Nykyinen†Nykyinen osoite: OX11 0DE, Iso-Britannia, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Iso-Britannia, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
Reaktiokeskuksen valoa keräävä kompleksi 1 (RC-LH1) on purppuranväristen fototrofisten bakteerien ydinosa fotosynteesissä. Esittelimme kaksi kryoelektronimikroskopiarakennetta Rhodopseudomonas palustris -bakteerin RC-LH1-kompleksista. RC-LH114-W-kompleksin 2,65 Å:n resoluution rakenne koostuu 14 alayksikön LH1-silmukasta, jotka ympäröivät RC:tä ja jonka katkaisee proteiini W. Kompleksi, jossa ei ole proteiinia W, koostuu kokonaan RC:n ympäröimästä RC:stä. Suljettu 16 alayksikön LH1-silmukka. Näiden rakenteiden vertailu antaa tietoa kinonien dynamiikasta RC-LH1-kompleksissa, mukaan lukien aiemmin määrittelemättömät konformaatiomuutokset kinonin sitoutuessa RC:n QB-kohtaan, sekä apu-kinonien sitoutumiskohtien sijainnista, jotka auttavat niitä siirtymään RC:hen. W-proteiinin ainutlaatuinen rakenne estää LH1-silmukan sulkeutumisen, mikä luo kanavan kinoni/kinoloni-vaihdon kiihdyttämiseksi.
Fotosynteesin tuottama energia voi ylläpitää lähes kaikkea elämää maapallolla, ja sillä on suuri potentiaali aurinkobioteknologialle. Globaalin fotosynteesin edistämisen lisäksi violetit fototrofiset bakteerit omaavat myös erilaisia ​​energiamuotoja ja aineenvaihduntakykyjä. Ne voivat välttää fotosynteesiä ja kasvaa heterotrofisina bakteereina pimeässä, sitoa typpeä ja hiilidioksidia, tuottaa vetyä ja hajottaa aromaattisia yhdisteitä (1-3). Näiden prosessien energian tarjoamiseksi valo on muunnettava nopeasti ja tehokkaasti kemialliseksi energiaksi. Tämä prosessi alkaa, kun valoa sitova antennikompleksi absorboi valoa ja siirtää loukkuun jääneen energian reaktiokeskukseen (RC), jolloin varausten erottuminen käynnistyy (4-7). Violettien fototrofisten bakteerien fotosynteesin perusyksikkö koostuu tyypin 2 RC:stä, jota ympäröi valoa sitova kompleksi 1 (LH1), muodostaen RC-LH1-ydinkompleksin. LH1 muodostuu joukosta kaarevia αβ-heterodimeerejä, joista kukin sitoo kaksi bakteerien klorofylli (BChl) a -molekyyliä ja yhden tai kaksi karotenoidia (8-12). Yksinkertaisin LH1-antenni koostuu 16 tai 17 αβ-heterodimeeristä, jotka ympäröivät RC:tä (9-13) suljetussa silmukassa, mutta muissa ydinkomplekseissa transmembraaniset peptidit katkaisevat ympäröivän LH1:n jatkuvuuden edistäen siten kinoli/kinoni-diffuusiota RC:n ja sytokromi bc1 -kompleksin välillä (11, 13-15). Violetti fototrofinen kasvi Rhodopseudomonas (Rps.) on malliorganismi, joka ymmärtää fotosynteesiä tukevan energian ja elektronin siirron. Rps:n ensimmäinen kiderakenne. Palustris RC-LH1 -kompleksin malli on RC, jota ympäröivät 15 heterodimeeristä LH1-silmukkaa, jotka katkaisee tuntematon proteiini nimeltä "Protein W" (14). Proteiini-W tunnistettiin myöhemmin RPA4402:ksi, joka on karakterisoimaton 10,5 kDa:n proteiini, jolla on kolme ennustettua transmembraanista heliksiä (TMH) (16). Ehdotamme proteiini W:tä koodaavan rpa4402-geenin nimeämistä uudelleen pufW:ksi, jotta se olisi yhdenmukainen RC-L-, M- (pufL, pufM) ja LH1α, β (pufA, pufB) -alayksiköitä koodaavien geenien nimikkeistön kanssa. Mielenkiintoista on, että proteiini-W:tä on vain noin 10 %:ssa RC-LH1:stä, mikä paljastaa, että Rps. palustris tuottaa kaksi erilaista RC-LH1-kompleksia. Tässä raportoimme kahden ydinkompleksin korkearesoluutioiset kryo-EM (cryo-EM) -rakenteet, joista toisessa on proteiini W ja 14 αβ -heterodimeeriä, toisessa ei ole proteiini W:tä ja siinä on suljettu 16 heterodimeerin LH1-silmukka. Rakenteemme edustaa edistysaskelta Rps. palustrisin RC-LH1-kompleksin ymmärtämisessä, koska olemme analysoineet kunkin variantin homogeenisen populaation ja meillä on riittävä resoluutio kunkin peptidin ja sitoutuneiden pigmenttien sekä niihin liittyvien lipidien ja kinonien selkeään määrittämiseen. Näiden rakenteiden vertailu osoittaa, että kolme TMH-proteiinia-W, joita ei ole tähän mennessä löydetty mistään muusta RC-LH1-kompleksista, muodostavat kinonikanavan kiihdyttäen kinoni/kinoloni-vaihtoa. Useita konservoituneita lipidi- ja kinonisitoutumiskohtia on tunnistettu, ja olemme paljastaneet uuden konformaatiomuutoksen kinonin ja RC:n yhdistämisen jälkeen, mikä saattaa soveltua hapettuneiden fototrofisten organismien fotosysteemi II (PSII) RC:lle. Löydöksemme tarjoavat uusia näkemyksiä kinoni/kinoloni-sitoutumisen ja -vaihdon kinetiikasta purppuranväristen fototrofisten bakteerien RC-LH1-ydinkompleksissa.
Jotta voisimme tutkia yksityiskohtaisesti kahta Rps. palustrisissa esiintyvää kompleksia, eristämme molemmat RC-LH1:t biokemiallisilla menetelmillä. Proteiini W:tä sisältävä kompleksi (jäljempänä ΔpufW) puhdistettiin kannasta, josta puuttuu pufW-geeni (16), ja vain yksi RC-LH1-kompleksi voidaan tuottaa. Proteiini W:tä sisältävää kompleksia tuottaa kanta. Tämän kannan proteiini W:tä on modifioitu 10x His-tagilla sen C-terminaalissa, jotta proteiini W:tä sisältävä kompleksi voidaan tehokkaasti yhdistää useimpiin puuttuviin proteiini W:hen immobilisoimalla metallia. Kompleksi erotetaan tehokkaasti (16) affiniteettikromatografialla (IMAC).
Kuten kuvassa 1 on esitetty, molemmat kompleksit sisältävät kolmen alayksikön RC:n (RC-L, RC-M ja RC-H), joita ympäröi LH1-antenni. Proteiini-W:tä vailla olevan kompleksin 2.80-A-rakenteessa on 16 αβ-heterodimeeriä, jotka muodostavat suljetun LH1-silmukan, joka ympäröi kokonaan RC:tä. Tätä kompleksia kutsutaan jäljempänä RC-LH116-kompleksiksi. Proteiini-W:tä sisältävän kompleksin 2.65Å-rakenteessa on proteiini-W:n katkaisema 14-heterodimeeri LH1, jota kutsutaan jäljempänä RC-LH114-W:ksi.
(A ja B) Yhdisteen pintaesitys. (C ja D) Sitoutuneet pigmentit ilmaistuna sauvoina. (E ja F) Sytoplasman pinnalta havaituissa komplekseissa peptidit ja LH1-alayksiköt on esitetty sarjakuvakuvioina, ja ne on numeroitu myötäpäivään proteiini-W-aukosta alkaen [yhdenmukaisesti Rba-numeroinnin kanssa. sphaeroides-kompleksi (13)]. LH1-α:n proteiinialayksikön väri on keltainen; LH1-β:n proteiinialayksikön väri on sininen; proteiini-W:n proteiini on punainen; RC-H:n proteiini on syaani; RC-L:n oranssi; RC-M:n magenta. Kofaktorit on esitetty sauvoilla, vihreä edustaa BChl- ja BPh a -molekyylejä, violetti edustaa karotenoideja ja keltainen edustaa UQ10-molekyylejä. (G ja H) Suurennettu kuva proteiini-W-aukosta RC-LH114-W-kompleksin (G) ja RC-LH116-kompleksin (H) vastaavalla alueella. Kofaktorit on esitetty tilan täyttävinä elementteinä, kelatoitunut kinoni on esitetty sinisenä. Proteiini-W-aukko on korostettu sinisellä katkoviivalla kuvassa (G), ja pienet reiät, joihin kinoni/kinololi diffundoituu LH116-renkaaseen, on korostettu mustalla katkoviivalla kuvassa (H).
Kuva 1 (A ja B) esittää RC:tä, jota ympäröivät avoimet tai suljetut LH1αβ-heterodimeerien ryhmät, joista kukin sitoo kaksi BChl:ää ja yhden karotenoidin (kuva 1, C ja D). Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että Rps on LH1-kompleksi. Spirulina-ksantiinin biosynteesireitillä nämä lajit sisältävät karotenoidien sekapopulaatioita (17). Spiropyrroksantiini on kuitenkin hallitseva karotenoidi ja sen tiheys on tyydyttävä. Siksi päätimme mallintaa spiroksantiinia kaikissa LH1:n sitoutumiskohdissa. Alfa- ja beeta-polypeptidit ovat yksittäisiä TMH:ita, joilla on lyhyet kalvon ulkoalueet (kuva 1, A, B, E ja F). Vaikka C-terminaalissa ei havaittu 17 aminohappotähteen tiheyttä, alfa-polypeptidi pilkkoutui Met1:stä Ala46:een molemmissa komplekseissa. β-polypeptidi pelkistyi Gly4:stä Tyr52:een RC-LH116:ssa ja Ser5:stä Tyr52:een RC-LH114-W:ssä. N-terminaalisten aminohappojen tiheyksiä ei havaittu 3 tai 4 eikä C-terminaalisten aminohappojen tiheyksiä 13 (kuva S1). Villityypin kannasta valmistetun sekalaisen RC-LH1-kompleksin massaspektrometria-analyysi osoitti, että puuttuva alue oli seurausta näiden peptidien heterologisesta pilkkoutumisesta (kuva S1 ja S2). Myös α-Met1:n N-terminaalinen formylaatio havaittiin (f). Analyysi osoitti, että α-peptidi koostuu aminohappotähteistä fMet1 - Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 ja β-peptidi aminohappotähteistä Ser2 - Ala53, mikä on hyvässä yhteensopivuudessa matalan lämpötilan EM-tiheyskartan kanssa.
α-His29:n ja β-His36:n koordinaatio saa BChl:t vastakkain; kukin αβ-heterodimeeri kokoontuu naapuriensa kanssa muodostaen avoimen silmukan (RC-LH114-W) tai suljetun silmukan (RC-LH116) RC:n eksitonikytkentäisen pigmenttiryhmän ympärille (kuva 1, C ja D). Verrattuna RC-LH114-W:n 877 nm:n kaistaan, RC-LH116:n absorptiopunasiirtymä 880 nm:n aallonpituudella on 3 nm (kuva 2A). Ympyrädikroismispektri on kuitenkin lähes sama (kuva 2B), mikä osoittaa, että vaikka avoimen ja suljetun silmukan välillä on selvä ero, BChl:ien paikallinen ympäristö on hyvin samanlainen. Absorptiopunasiirtymä voi johtua vähentyneestä lämpöliikkeestä ja lisääntyneestä vakaudesta suljetussa silmukassa (18, 19), suljetun silmukan aiheuttamasta pigmenttikytkennän muutoksesta (20, 21) tai näiden kahden vaikutuksen yhdistelmästä (11).
(A) Ultravioletti/näkyvä/lähi-infrapuna-absorptiospektri, jonka piikit on merkitty vastaavilla pigmenteillä ja normalisoitu BPh-piikkiin 775 nm:ssä. (B) Ympyrädikroismispektri normalisoituna BChl-absorbanssiin 805 nm:ssä. (C ja D) Valittuja ΔA-spektrejä RC-LH114-W-kompleksin (C) ja RC-LH116-kompleksin (D) aikaerotteista absorptiospektreistä. Paremman vertailun vuoksi kaikki spektrit on normalisoitu −A:n ∆A:han arvolla 0,2 ps. (E) Sytokromi c2:n hapettumisnopeus säteilytyksen jälkeen eri UQ2-pitoisuuksilla (katso raakatiedot kuvasta S8). (F) Soluissa, joita on kasvatettu matalan, keskitason tai korkean intensiteetin valossa (10, 30 tai 300 μMm-2 s-1), proteiinien W- ja RC-L-alayksiköt puhdistetussa kompleksissa ja erotettujen kalvojen suhde. Määritä proteiinitaso SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja immunomäärityksellä (katso raakatiedot kuvasta S9). Määritä suhde suhteessa puhdistettuun RC-LH114-W-kompleksiin. Kompleksin stoikiometrinen RC-L:n ja proteiini-W:n suhde on 1:1.
RC-LH114-W:n deformoituneen αβ14-silmukan kohdassa 1 olevat BChl:t (kuva 1, A, C ja E) ovat 6,8 Å lähempänä RC:n ensisijaista donoria (P) kuin vastaavat BChl:t RC-LH116:ssa (kuva 1, B, D ja F sekä kuva S3); näiden kahden kompleksin transienttiabsorptiokinetiikka kuitenkin osoittaa, että RC-LH114-W:n ja RC-LH116:n viritysenergian siirtoaikavakiot LH1:stä RC:hen ovat 40 ±4 ja 44 ±3 ps (kuva 2). , C ja D, kuva S4 ja taulukko S2). Myöskään elektronien siirrossa RC:n sisällä ei ole merkittävää eroa (kuva S5 ja siihen liittyvä lisäteksti). Epäilemme, että LH1:n ja RC-P:n välinen energiansiirtoajan läheinen vastaavuus johtuu useimpien BChl:ien samankaltaisesta etäisyydestä, kulmasta ja potentiaalienergiasta kahdessa LH1-silmukassa. Näyttää siltä, ​​että LH1-energiakuvion tutkiminen minimietäisyyden saavuttamiseksi ei ole nopeampaa kuin suora energiansiirto epäoptimaalisista kohdista RC:hen. RC-LH114-W:n avoimen silmukan LH1-silmukka voi myös läpikäydä merkityksetöntä lämpöliikettä matalissa lämpötiloissa rakenneanalyysin kannalta, ja huoneenlämmössä on pidempi αβ14-rengaskonformaatio βBChls:n pigmenttietäisyyden vuoksi RC1:n asemassa.
RC-LH116-kompleksi sisältää 32 BChl:ää ja 16 karotenoidia, ja sen yleinen järjestyminen on sama kuin Thermochromatium (Tch.) pidpidumilla [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 -kannalla (PDB ID 7C9R) (12) ja viherlevällä (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) saatu järjestys. Kohdistuksen jälkeen αβ-heterodimeerien asemissa havaittiin vain pieniä poikkeamia, erityisesti 1-5, 15 ja 16 (kuva S6). Proteiini-W:n läsnäololla on merkittävä vaikutus LH1:n rakenteeseen. Sen kolme TMH:ta ovat yhteydessä toisiinsa lyhyillä silmukoilla, N-terminaalin ollessa kompleksin luumenin puolella ja C-terminaalin sytoplasman puolella (kuvat 1A ja 3, A-D). Proteiini-W on pääosin hydrofobinen (kuva 3B), ja TMH2 ja TMH3 vuorovaikuttavat LH1αβ-14:n kanssa muodostaen transmembraanipinnan (kuva 3, B ja E–G). Rajapinta koostuu pääasiassa Phe-, Leu- ja Val-tähteistä transmembraanialueella. Nämä tähteet ovat pinoutuneet hydrofobisten aminohappojen ja αβ-14-pigmenttien kanssa. Myös jotkut polaariset tähteet vaikuttavat vuorovaikutukseen, mukaan lukien vetysidos W-Thr68:n ja β-Trp42:n välillä kompleksiontelon pinnalla (kuva 3, F ja G). Sytoplasman pinnalla Gln34 on αβ-14-karotenoidien keto-ryhmän vieressä. Lisäksi n-dodekyyli-β-d-maltosidimolekyyli (β-DDM) erotettiin ja sen hydrofobinen häntä ulottui proteiini-W:n ja αβ-14:n väliseen rajapintaan, ja lipidihäntä saattaa sijaita kehossa. Huomasimme myös, että proteiini W:n ja RCH:n C-terminaaliset erotusalueet ovat hyvin lähellä toisiaan, mutta eivät spesifisten vuorovaikutusten muodostumisen piirissä (kuva 1, A ja E). Näiden kahden proteiinin erottelemattomissa C-terminaalisissa aminohapoissa voi kuitenkin olla vuorovaikutuksia, jotka voivat tarjota mekanismin proteiini-W:n rekrytoinnille RC-LH114-W-kompleksin kokoonpanon aikana.
(A) Proteiini-W, joka on piirrettynä LH1αβ14:n rajapintaa vasten, omaa sauvanmuotoisen sivuketjun (punainen), joka näkyy osassa sähköstaattisen potentiaalin kaaviota (läpinäkyvä harmaa pinta, jonka ääriviivataso on 0,13). (B) Proteiini-W:tä esittää hydrofobinen värillinen pinta. Polaariset ja varautuneet alueet näkyvät syaanina, hydrofobiset alueet valkoisina ja voimakkaasti hydrofobiset alueet oranssina. (C ja D) Proteiini-W esitettynä piirrettynä, sen suunta on sama kuin (A) (C) -kuvassa ja kierretty 180° (D). Sekvenssin sijainnin mukaan erotettavissa olevat aminohappotähteet omaksuvat sateenkaaren värimaailman, jossa N-terminaali on sininen ja C-terminaali punainen. (E) Proteiini-W samassa näkymässä kuin (A) -kuvassa, ja proteiini-W:LH1:n rajapinnan aminohappotähteet esitetään tankoina, joihin on kiinnitetty merkkejä. (F) Proteiini-W on kierretty 90° suhteessa (E)-kuvaan ja LH1αβ14-kuvaan nähden ja suhteessa rajapinnan aminohappotähteisiin palkkimuodossa. Beeta-polypeptidin ulkonevat aminohappotähteet on merkitty. Kofaktori on esitetty kuvan 1 väriä vastaavana palkkina, hajonnut β-DDM on esitetty harmaana ja happi on esitetty punaisena. (G) Kuvassa (F) olevaa näkymää on käännetty 180°, ja siinä näkyvät leimatun alfa-polypeptidin näkyvät aminohappotähteet.
Proteiini-W korvaa αβ-heterodimeerin (15. kuvassa 1F), estäen siten silmukan sulkeutumisen ja kallistaen kolmea ensimmäistä αβ-heterodimeeriä. Havaittiin, että ensimmäisen αβ-1-heterodimeerin suurin kallistuskulma kalvon normaaliin nähden oli 25° - 29° (kuva 1, A ja E), joka muodostui αβ-1:n 2° - 8°:n kallistuksesta RC A:n terävässä kontrastissa - LH116 (kuva 1, B ja F). Toinen ja kolmas heterodimeeri ovat kaltevia vastaavasti 12° - 22° ja 5° - 10°. RC:n steerisen esteen vuoksi αβ-1:n kallistus ei sisällä toista αβ-paria (joka vastaa 16. αβ:tä kuvassa 1F), muodostaen siten selkeän aukon LH1-renkaaseen (kuva 1, A ja E). Kahden αβ-heterodimeerin puuttumisen ja neljän BChl:n sekä kahden karotenoidin menetyksen vuoksi mikään karotenoideista ei sitoudu kiertyneeseen αβ-1-alayksikköön, mikä johtaa LH114-W-renkaaseen, joka sisältää 13 karotenoidia (vegetarian) ja 28 BChl:ää. Kahden αβ1–7-alueiden kompleksin paikalliset resoluutioarviot ovat alhaisemmat kuin muun LH1-silmukan, mikä saattaa heijastaa RC QB -kohdan vieressä olevan LH1-alayksikön luontaista plastisuutta (kuva 4).
RC-LH114-W:n (A ja B) ja RC-LH116:n (C ja D) kuvat on esitetty samasta ylhäältä/sivulta katsottuna (A ja B) (A ja C) ja ontelon pinnasta (B ja D) kuin kuvassa 1. Värilliset näppäimet näkyvät oikealla.
Ainoa muu ominainen ydinkompleksi, jonka stoikiometrinen suhde on 1:14, on Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX-dimeeri (13). Proteiinilla W ja PufX:llä ei kuitenkaan ole ilmeistä homologiaa, ja niillä on merkittävä vaikutus niiden LH1-rakenteisiin. PufX on yksittäinen TMH, jolla on N-terminaalinen sytoplasminen domeeni, joka on vuorovaikutuksessa RC-H-alayksikön sytoplasmisen puolen kanssa (13) kohdassa, joka vastaa Rps. palustris LH116αβ-16:ta. PufX luo kanavan kinoni/kinoloni-vaihdolle RC-LH1:n ja sytokromi bcl -kompleksin välillä ja on läsnä kaikissa Rba. sphaeroides -ydinkomplekseissa (13). Vaikka monomeeri-monomeerirajapinta on Rba:ssa, sphaeroides RC-LH1-PufX-dimeeri sijaitsee proteiini W:n sitoutumiskohdassa RC-LH114-W:ssä, ja PufX:n ja proteiini-W:n indusoima aukko on vastaavassa kohdassa (kuva S7A). RC-LH114-W:n aukko on myös linjassa Pseudomonas rosea LH1:n hypoteettisen kinonikanavan (8) kanssa, joka muodostuu peptideistä, jotka eivät ole sukua proteiinille W tai PufX:lle (kuva S7B). Lisäksi Blc:n kinonikanava. Yhden γ-alayksikön poisjättämällä muodostuva smaragdinvihreä LH1 (7) sijaitsee samankaltaisessa paikassa (kuva S7C). Vaikka eri proteiinit välittävätkin näitä kinoni/kinololi-kanavia, niiden esiintyminen samassa paikassa RC-LH1-kompleksissa näyttää olevan esimerkki konvergentista evoluutiosta, mikä viittaa siihen, että proteiini W:n luoma aukko voi toimia kinonikanavana.
LH114-W-silmukan aukko mahdollistaa jatkuvan kalvoalueen muodostumisen RC-LH114-W-kompleksin sisätilan ja kalvon väliin (kuva 1G) sen sijaan, että kaksi domeenia yhdistettäisiin proteiinihuokosen kautta kuten proteiineissa. RC-LH116-kompleksi on samanlainen kuin suljettu Tch. Neulamainen kompleksi (22) (kuva 1H). Koska kinonin diffuusio kalvon läpi on nopeampaa kuin diffuusio kapean proteiinikanavan läpi, avoin LH114-W-silmukka voi mahdollistaa nopeamman RC:n vaihtuvuuden kuin suljettu LH116-silmukka, ja kinonin diffuusio RC:hen voi olla rajoitetumpaa. Jotta voisimme testata, vaikuttaako proteiini W kinonien muuntumiseen RC:n kautta, suoritimme sytokromihapetusmäärityksen tietyllä ubikinoni 2:n (UQ2) pitoisuudella (luonnollisen UQ10:n analogi, jolla on lyhyempi isopreenihäntä) (kuva 2E). Vaikka kelatoituneen kinoonin läsnäolo haittaa näennäisen Michaelis-vakion tarkkaa määrittämistä (RC-LH114-W ja RC-LH116 soveltuvat vastaavasti pitoisuuksille 0,2 ± 0,1 μM ja 0,5 ± 0,2 μM), RC-LH114-W:n maksiminopeus (4,6 ± 0,2 e-RC-1 s-1) on 28 ± 5 % suurempi kuin RC-LH116:n (3,6 ± 0,1 e-RC-1 s-1).
Aluksi arvioimme, että proteiini-W:tä on noin 10 %:ssa ydinkompleksista (16); tässä heikon, keskivalon ja kirkkaan valon kasvusolujen käyttöasteet ovat vastaavasti 15 ± 0,6 %, 11 ± 1 % ja 0,9 ± 0,5 % (kuva 2F). Massaspektrometrian kvantitatiivinen vertailu osoitti, että histidiini-leiman lisääminen ei vähentänyt proteiini-W:n suhteellista runsautta villityypin kantoihin verrattuna (P = 0,59), joten nämä tasot eivät ole modifioidun proteiini-W:n artefakti (kuva S10). Tämä proteiini-W:n alhainen käyttöaste RC-LH1-kompleksissa voi kuitenkin sallia joidenkin RC-solujen kääntymisen kiihtyneellä nopeudella, mikä lieventää hitaampaa kinoni/kinoloni-vaihtoa RC-LH116-kompleksissa. Huomasimme, että korkea valon käyttöaste on ristiriidassa viimeaikaisten transkriptomiikkatietojen kanssa, jotka osoittavat, että pufW-geenin ilmentyminen lisääntyy voimakkaassa valossa (kuva S11) (23). Ero pufW-transkription ja proteiini-W:n liittymisen välillä RC-LH1-kompleksiin on hämmentävä ja saattaa heijastaa proteiinin monimutkaista säätelyä.
RC-LH114-W:ssä on allokoitu ja mallinnettu 6 kardiolipiinia (CDL), 7 fosfatidyylikoliinia (POPC), 1 fosfatidyyliglyseroli (POPG) ja 29 β-DDM-molekyyliä: 6 CDL:ää, 24 POPC:tä, 2 POPG:tä ja 12 βDDM:ää. RC-LH116 (kuva 5, A ja B). Näissä kahdessa rakenteessa CDL sijaitsee lähes kompleksin sytoplasmisella puolella, kun taas POPC, POPG ja β-DDM sijaitsevat enimmäkseen luminaalilla. Kaksi lipidi- ja detergenttimolekyyliä eristettiin RC-LH114-W-kompleksin αβ-1 - αβ-6 -alueelta (kuva 5A), ja viisi eristettiin RC-LH116:n vastaavalta alueelta (kuva 5B). Kompleksin toisella puolella havaittiin lisää lipidejä, pääasiassa CDL:ää, kertyneenä RC:n ja αβ-7 - αβ-13:n väliin (kuva 5, A ja B). Muut rakenteellisesti erottuvat lipidit ja detergentit sijaitsevat LH1-renkaan ulkopuolella, ja hyvin erottuvat asyyliketjut ulottuvat LH1-alayksiköiden väliin, joita RC-LH114-W:ssä alustavasti nimetään β-DDM:ksi ja RC A:ssa β-DDM:n ja POPC-LH116:n seoksessa β-DDM:ksi. Kelatoivien lipidien ja detergenttien samankaltaiset sijainnit rakenteessamme osoittavat, että ne ovat fysiologisesti relevantteja sitoutumiskohtia (kuva S12A). Myös vastaavien molekyylien sijainnit Tch:ssa ovat hyvin yhdenmukaisia. Gentle- ja Trv-kanta 970 RC-LH1:t (kuva S12, B–E) (9, 12) ja lipidipääryhmän vetysidostähteet osoittivat melko hyvää säilymistä sekvenssien linjauksessa (kuva S13), mikä osoittaa, että RC:hen sitoutuva CDL (24) on säilynyt, ja nämä kohdat voivat olla säilyneet RC-LH1-kompleksissa.
(A ja B) RC-LH114-W (A) ja RC-LH116 (B) -peptidit on esitetty sarjakuvakuvilla ja pigmentit tankoilla kuvan 1 värimaailman mukaisesti. Lipidit on esitetty punaisella ja detergentit harmaalla. RC QA- ja QB-kohtiin sitoutunut UQ on keltainen, kun taas eristetty UQ on sininen. (C ja D) Samat kuvat kuin (A) ja (B), lipidit jätetty pois. (E-G) Suurennettu kuva RC-LH116:n Q1(E):stä, Q2(F):stä ja Q3(G):stä, joiden sivuketjut vaikuttavat toisiinsa. Vetysidokset on esitetty mustina katkoviivoina.
RC-LH116:ssa sekä RC QA että QB UQ, jotka osallistuvat elektroninsiirtoon varauksen erotusprosessissa, hajoavat sitoutumiskohdissaan. RC-LH114-W:ssä QB-kinonia ei kuitenkaan ole erotettu, ja sitä käsitellään yksityiskohtaisemmin jäljempänä. QA- ja QB-kinonien lisäksi kaksi kelatoitunutta UQ-molekyyliä (jotka sijaitsevat RC- ja LH1-renkaiden välissä) on allokoitu RC-LH114-W-rakenteeseen niiden hyvin eroteltujen pääryhmien mukaan (jotka sijaitsevat vastaavasti Q1:ssä ja Q2:ssa). tilassa). Kuva 5C). Kaksi isopreeniyksikköä on osoitettu Q1:lle, ja tiheyskartta erottelee Q2:n kaikki 10 isopreenihäntää. RC-LH116:n rakenteessa erotettiin kolme kelatoitunutta UQ10-molekyyliä (Q1:stä Q3:een, kuva 5D), ja kaikilla molekyyleillä on selkeä tiheys koko hännässä (kuva 5, D-G). Näissä kahdessa rakenteessa Q1:n ja Q2:n kinonipääryhmien sijainnit ovat erinomaisen yhdenmukaiset (kuva S12F), ja ne vuorovaikuttavat vain RC:n kanssa. Q1 sijaitsee RC-LH114-W:n W-aukon suulla (kuva 1G ja 5, C, D ja E), ja Q2 sijaitsee lähellä QB:n sitoutumiskohtaa (kuva 5, C, D ja F). Konservoituneet L-Trp143- ja L-Trp269-tähteet ovat hyvin lähellä Q1:tä ja Q2:ta ja tarjoavat potentiaalisia π-pinoamisvuorovaikutuksia (kuva 5, E ja F sekä kuva S12). L-Gln88, 3,0 Å Q1:n distaalisesta hapesta, muodostaa vahvan vetysidoksen (kuva 5E); tämä tähde on konservoitunut kaikissa RC:issä paitsi kaukaisimmassa suhteessa (kuva S13). L-Ser91 on konservatiivisesti korvattu Thr:lla useimmissa muissa RC-yhdisteissä (kuva S13), se on 3,8 Å Q1:n metyylihapesta ja voi muodostaa heikkoja vetysidoksia (kuva 5E). Q3:lla ei näytä olevan spesifistä vuorovaikutusta, mutta se sijaitsee hydrofobisella alueella RC-M-alayksikön ja LH1-α-alayksiköiden 5–6 välissä (kuva 5, D ja G). Q1, Q2 ja Q3 tai niiden lähellä olevat kelatoituneet kinonit on myös erotettu Tch. Gentle-, Trv.-kannasta 970 ja Blc-kannoissa. Iirisrakenne (9, 10, 12) viittaa konservoituneeseen apu-kinonin sitoutumiskohtaan RC-LH1-kompleksissa (kuva S12G). RC-LH116:ssa hajonneet viisi UQ:ta ovat hyvässä yhteensopivuudessa kunkin kompleksin korkean suorituskyvyn nestekromatografialla (HPLC) määritetyn 5,8 ± 0,7:n kanssa, kun taas RC-LH114-W:ssä hajonneet kolme UQ:ta ovat alhaisemmat kuin [arvo]. Mitattu arvo 6,2 ± 0,3 (kuva S14) osoittaa, että rakenteessa on ratkaisemattomia UQ-molekyylejä.
Pseudo-symmetriset L- ja M-polypeptidit sisältävät kumpikin viisi TMH:ta ja muodostavat heterodimeerin, joka yhdistää yhden BChl-dimeerin, kaksi BChl-monomeeriä, kaksi bakteriofagi (BPh) -monomeeriä ja yhden ei-hemiraudan sekä yhden tai kaksi UQ10-molekyyliä. Vetysidosten läsnäolon ansiosta terminaalisessa ketoniryhmässä ja sen tunnetun kertymisen Rps:ään karotenoidit liitetään M-alayksikköön, jonka nimi on cis-3,4-dehydroorhodopiini. Laji (25). RC-H:n ulkokalvon domeeni on ankkuroitu kalvoon yhdellä TMH:lla. Kokonaisuudessaan RC-rakenne on samanlainen kuin sukulaisten lajien (kuten Rba) kolmen alayksikön RC. sphaeroides (PDB ID: 3I4D). BChl:n ja BPh:n makrosyklit, karotenoidirunko ja ei-hemirauta ovat päällekkäisiä näiden rakenteiden resoluutioalueella, samoin kuin UQ10-pääryhmä QA-kohdassa ja QB-kinoni RC-LH116:ssa (kuva S15).
Kahden eri QB-kohtien käyttöasteen omaavan RC-rakenteen saatavuus tarjoaa uuden mahdollisuuden tutkia QB-kinonin sitoutumiseen liittyviä johdonmukaisia ​​konformaatiomuutoksia. RC-LH116-kompleksissa QB-kinoni sijaitsee täysin sitoutuneessa "proksimaalisessa" asemassa (26), mutta RC-LH114-W:n erotus ei sisällä QB-kinonia. RC-LH114-W:ssä ei ole QB-kinonia, mikä on yllättävää, koska kompleksi on aktiivisempi, aktiivisempi kuin RC-LH116-kompleksi, jossa on rakenteellisesti erottunut QB-kinoni. Vaikka kaksi LH1-rengasta kelatoivat noin kuutta kinonia, viisi on rakenteellisesti erottunut suljetussa RC-LH116-renkaassa, kun taas vain kolme on rakenteellisesti rajoittunut avoimessa RC-LH114-W-renkaassa. Tämä lisääntynyt rakenteellinen epäjärjestys voi heijastaa RC-LH114-W:n QB-kohtien nopeampaa korvautumista, nopeampaa kinonikinetiikkaa kompleksissa ja lisääntynyttä todennäköisyyttä ylittää LH1-silmukka. Ehdotamme, että UQ:n puute RC-LH114-W:n RC QB -kohdassa voi johtua monimutkaisemmasta ja aktiivisemmasta kompleksista, ja RC-LH114-W:n QB-kohdassa UQ:n vaihtuvuus on välittömästi pysähtynyt. Spesifinen vaihe (QB-kohdan sisäänkäynti on suljettu) heijastaa tämän aktiivisuuden konformaatiota.
Ilman QB:tä L-Phe217:n mukana tuleva rotaatio asentoon, joka ei sovi yhteen UQ10:n sitoutumisen kanssa, koska se aiheuttaa spatiaalisen törmäyksen hännän ensimmäisen isopreeniyksikön kanssa (kuva 6A). Lisäksi ilmeiset tärkeimmät konformaatiomuutokset ovat ilmeisiä, erityisesti helix de (lyhyt helix silmukassa TMH D:n ja E:n välillä), jossa L-Phe217 siirtyy QB:n sitoutumistaskuun, ja L-Tyr223:n rotaatio (kuva 6A), joka katkaisee vetysidoksen M-Asp45-runkoon ja sulkee QB:n sitoutumiskohdan sisäänkäynnin (kuva 6B). Helix de kääntyy tyvestä, L-Ser209:n Cα siirtyy 0,33 Å, kun taas L-Val221Cα siirtyy 3,52 Å. TMH D:ssä ja E:ssä ei ole havaittavia muutoksia, jotka ovat päällekkäisiä molemmissa rakenteissa (kuva 6A). Tietääksemme tämä on ensimmäinen luonnollisessa RC:ssä oleva rakenne, joka sulkee QB-kohdan. Vertailu täydelliseen (QB-sitoutuneeseen) rakenteeseen osoittaa, että ennen kuin kinoni pelkistyy, tarvitaan konformaatiomuutos, jotta se siirtyy kinoniin. L-Phe217 kiertyy muodostaen π-pinoamisvuorovaikutuksen kinonin pääryhmän kanssa, ja heliksi siirtyy ulospäin, jolloin L-Gly222:n runko ja L-Tyr223:n sivuketju muodostavat vetysidosverkoston, jolla on vakaa vetysidosrakenne (kuva 6, A ja C).
(A) Päällekkäinen sarjakuva hologrammista (L-ketju, oranssi/M-ketju, magenta) ja apo-rakenteesta (harmaa), jossa avaintähteet on esitetty sauvamaisena esityksenä. UQ10 on esitetty keltaisella palkilla. Katkoviiva osoittaa koko rakenteessa muodostuneet vetysidokset. (B ja C) Apolipoproteiinin ja koko rengasrakenteen pintaesitys, jossa L-Phe217:n sivuketjun happi on korostettu sinisellä ja L-Tyr223:n punaisella. L-alayksikkö on oranssi; M- ja H-alayksiköitä ei ole väritetty. (D ja E) Apolipoproteiini (D) ja kokonainen (E) RC QB-kohdat [väritetty (A):n mukaan] ja Thermophilus thermophilus PSII (vihreä, sininen muovikinonilla; PDB ID: 3WU2) Kohdista (58).
Yllättäen, vaikka useita QB-puutteisia RC-rakenteita ilman LH1:tä on saatavilla, tässä tutkimuksessa havaittuja konformaatiomuutoksia ei ole aiemmin raportoitu. Näihin kuuluvat QB:tä poistava rakenne Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) ja Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29) -kannoissa, jotka kaikki ovat lähes samat kuin niiden yleinen QB-rakenne. 3PRC:n lähempi tarkastelu paljasti, että LDAO (lauryylidimetyyliamiinioksidi) -detergenttimolekyylit sitoutuvat QB-aseman sisääntuloon, mikä voi estää uudelleenjärjestymisen suljettuun konformaatioon. Vaikka LDAO ei hajoa samassa asemassa 1EYS:ssä tai 1OGV:ssä, nämä RC:t valmistetaan käyttämällä samaa detergenttiä ja siksi ne voivat tuottaa saman vaikutuksen. Sytokromi c2:n kanssa yhteiskiteytetyn Rba. Sphaeroides RC:n (PDB ID: 1L9B) kiderakenteella näyttää myös olevan suljettu QB-kohta. Tässä tapauksessa RC-M-polypeptidin N-terminaalinen alue (joka on vuorovaikutuksessa QB:n sitoutumiskohdan kanssa Tyr-tähteen H-sidoksen kautta Q-heliksissä) omaksuu luonnottoman konformaation, eikä QB:n konformaatiomuutosta tutkita enempää (30). Rauhoittavaa on, että emme ole nähneet tällaista M-polypeptidin muodonmuutosta RC-LH114-W-rakenteessa, joka on lähes sama kuin RC-LH116 RC:n N-terminaalinen alue. On myös huomattava, että detergenttipohjaisen LH1-antennin hävittämisen jälkeen PDB:n apolipoproteiini-RC:t hävisivät, mikä eliminoi sisäiset kinonivarastot ja lipidit RC:n ja ympäröivän LH1-renkaan sisäpinnan välisestä raosta (31, 32). RC pysyy toiminnallisena, koska se säilyttää kaikki kofaktorit lukuun ottamatta hajoavaa QB-kinonia, joka on vähemmän stabiili ja usein häviää valmistusprosessin aikana (33). Lisäksi tiedetään, että LH1:n ja luonnollisten syklisten lipidien poistaminen RC:stä voi vaikuttaa toimintoihin, kuten varaukseltaan erotetun P+QB-tilan lyhentyneeseen elinikään (31, 34, 35). Siksi oletamme, että RC:tä ympäröivän paikallisen LH1-renkaan olemassaolo saattaa ylläpitää "suljettua" QB-kohtaa ja siten säilyttää paikallisen ympäristön QB:n lähellä.
Vaikka apolipoproteiini (ilman QB-kinonia) ja täydellinen rakenne edustavat vain kahta tilannekuvaa QB-kohdan vaihtuvuudesta pikemminkin kuin tapahtumasarjaa, on viitteitä siitä, että sitoutumista voidaan rajoittaa hydrokinonin vaikutuksesta uudelleensitoutumisen estämiseksi substraatin eston estämiseksi. Kinololin ja kinoonin vuorovaikutus apolipoproteiinin QB-kohdan lähellä voi olla erilainen, mikä johtaa sen hylkimiseen RC:n toimesta. On jo pitkään ehdotettu, että konformaatiomuutoksilla on merkitystä kinonien sitoutumisessa ja pelkistyksessä. Jäätyneiden RC:iden kyky pelkistää kinoneja pimeäsopeutumisen jälkeen heikentyy (36); röntgenkristallografia osoittaa, että tämä vaurio johtuu QB-kinonien jäämisestä loukkuun "distaaliseen" konformaatioon noin 4,5 Å aktiivisesta proksimaalisesta asemasta (26), 37). Ehdotamme, että tämä distaalinen sitoutumiskonformaatio on tilannekuva apolipoproteiinin ja täyden rengasrakenteen välisestä välitilasta, joka seuraa alkuperäistä vuorovaikutusta kinonin kanssa ja QB-kohdan avautumista.
Tiettyjen fototrofisten bakteerien ja syanobakteerien, levien ja kasvien PSII-kompleksissa esiintyvällä tyypin II RC:llä on rakenteellinen ja toiminnallinen säilyminen (38). Kuvassa 6 (D ja E) esitetty rakenteellinen linjaus korostaa PSII RC:iden ja bakteerien RC-kompleksin QB-kohdan samankaltaisuutta. Tätä vertailua on pitkään käytetty mallina kinonien sitoutumis- ja pelkistysjärjestelmien tutkimiseen. Aiemmat julkaisut ovat viitanneet siihen, että konformaatiomuutoksiin liittyy kinonien PSII-pelkistys (39, 40). Siksi, ottaen huomioon RC:n evolutiivisen säilymisen, tämä aiemmin havaitsematon sitoutumismekanismi voi soveltua myös PSII RC:n QB-kohtaan hapettuneissa fototrofisissa kasveissa.
Rps ΔpufW (leimaamaton pufW-deleetio) ja PufW-His (C-terminaalinen 10x His-merkitty proteiini-W, jota ilmennetään luonnollisesta pufW-lokuksesta) -kannat. palustris CGA009 on kuvattu aiemmassa työssämme (16). Nämä kannat ja isogeeninen villityypin emo otettiin talteen pakastimesta siirtämällä pieni määrä soluja PYE-levylle (kukin 5 g litrassa -1) (säilytetty LB-alustassa -80 °C:ssa, joka sisälsi 50 % (w/v) glyserolia), proteiinia, hiivauutetta ja sukkinaattia) agaria [1,5 % (w/v)]. Levyä inkuboitiin yön yli pimeässä huoneenlämmössä anaerobisissa olosuhteissa ja sitten valaistiin valkoisella valolla (~50 μmolm-2 s-1) OSRAM 116-W -halogeenilampuilla (RS Components, UK) 3–5 päivän ajan, kunnes ilmestyi yksi ainoa pesäke. Yhtä pesäkettä käytettiin 10 ml:n M22+-elatusaineen (41), johon oli lisätty 0,1 % (w/v) kasaminohappoja (jäljempänä M22), inokulointiin. Viljelmää kasvatettiin vähähappisissa olosuhteissa pimeässä 34 °C:ssa ravistellen nopeudella 180 rpm 48 tunnin ajan, ja sitten 70 ml viljelmää inokuloitiin samoissa olosuhteissa 24 tunnin ajan. 1 ml:n tilavuudella olevaa semiaerobista viljelmää käytetään 30 ml:n M22-elatusaineen inokulointiin 30 ml:n yleiskäyttöisessä kierrekorkilla suljetussa läpinäkyvässä lasipullossa ja säteilytettiin ravistamalla (~50 μmolm-2 s-1) 48 tunnin ajan steriilillä magneettisekoitussauvalla. Sitten 30 ml viljelmää inokuloitiin noin 1 litralla viljelmää samoissa olosuhteissa, ja tällä viljelmällä inokuloitiin sitten noin 9 litraa viljelmää, jota oli valotettu noin 200 μmolm-2 s-1 -nopeudella 72 tunnin ajan. Solut kerättiin sentrifugoimalla 7132 RCF:ssä 30 minuutin ajan, suspendoitiin uudelleen noin 10 ml:aan 20 mM tris-HCl:ää (pH 8,0) ja säilytettiin -20 °C:ssa, kunnes niitä tarvittiin.
Sulatuksen jälkeen lisää uudelleensuspendoituihin soluihin deoksiribonukleaasi I:n (Merck, UK) kiteitä, lysotsyymiä (Merck, UK) ja kaksi Rochen holoentsyymiproteaasi-inhibiittoritablettia (Merck, UK). Solut rikottiin 8–12 kertaa 20 000 psi:n ranskalaisessa painekammiossa (Aminco, USA). Kun ehjät solut ja liukenemattomat solujätteet oli poistettu sentrifugoimalla 18 500 RCF:n voimalla 15 minuutin ajan 4 °C:ssa, kalvo saostettiin pigmentoidusta lysaatista sentrifugoimalla 113 000 RCF:n voimalla 2 tunnin ajan 43 000 °C:ssa. Hävitä liukoinen fraktio ja suspendoi värillinen kalvo uudelleen 100–200 ml:aan 20 mM tris-HCl:ää (pH 8,0) ja homogenisoi, kunnes näkyviä aggregaatteja ei enää ole. Suspendoitua kalvoa inkuboitiin 20 mM tris-HCl:ssä (pH 8,0) (Anatrace, USA), joka sisälsi 2 % (w/v) β-DDM:ää, 1 tunnin ajan pimeässä 4 °C:ssa varovasti sekoittaen. Sitten sentrifugoitiin 70 °C:ssa 150 000 RCF:n liuottamiseksi 4 °C:ssa 1 tunnin ajan jäännösliukenemattomien aineiden poistamiseksi.
ΔpufW-kannasta peräisin oleva liuotuskalvo lisättiin 50 ml:n DEAE-sepharose-ioninvaihtokolonniin, jossa oli kolme kolonnin tilavuutta (CV) sitoutumispuskuria [20 mM Tris-HCl (pH 8,0), joka sisälsi 0,03 % (w/v) β-DDM:ää]. Kolonni pestiin kahdella CV-sitoutumispuskurilla ja sitten kahdella sitoutumispuskurilla, jotka sisälsivät 50 mM NaCl:a. RC-LH116-kompleksi eluoitiin lineaarisella gradientilla 150–300 mM NaCl:a (sitoutumispuskurissa) 1,75 CV:ssä, ja jäljelle jäänyt sitoutumiskompleksi eluoitiin sitoutumispuskurilla, joka sisälsi 300 mM NaCl:a 0,5 CV:ssä. Absorptiospektri kerättiin aallonpituuksien 250 ja 1000 nm välillä, jaettiin absorbanssisuhde (A880/A280) yli 1:n arvoon 880–280 nm:ssä, laimennettiin se kahdesti sitoutumispuskurissa ja toistettiin sama toimenpide uudelleen DEAE-kolonnilla puhdistuksen jälkeen. Laimenna fraktiot, joiden A880/A280-suhteet ovat yli 1,7 ja A880/A805-suhteet yli 3,0, suorita kolmas ioninvaihtokierros ja säilytä fraktiot, joiden A880/A280-suhteet ovat yli 2,2 ja A880/A805-suhteet yli 5,0. Osittain puhdistettu kompleksi väkevöitiin noin 2 ml:aan Amicon 100 000 molekyylipainon raja-arvon (MWCO) omaavalla keskipakosuodattimella (Merck, Iso-Britannia) ja ladattiin Superdex 200 16/600 -kokoekskluusiokolonniin (GE Healthcare, Yhdysvallat), joka sisälsi 200 mM NaCl-puskuria, ja eluoitiin sitten samassa puskurissa 1,5 CV:n paineella. Kerää kokoekskluusiofraktion absorptiospektrit ja väkevöi absorptiospektrit A880/A280-suhteilla yli 2,4 ja A880/A805-suhteilla yli 5,8:n A880:een 100:aan ja käytä niitä välittömästi kryo-TEM-verkon valmisteluun tai säilytykseen. Säilytä -80 °C:ssa, kunnes sitä tarvitaan.
PufW-His-kannan liuotuskalvo lisättiin 20 ml:n HisPrep FF Ni-NTA Sepharose -kolonniin (20 mM tris-HCl (pH 8,0), joka sisälsi 200 mM NaCl:a ja 0,03 % (w/w)) IMAC-puskurissa (GE Healthcare). v) β-DDM]. Kolonni pestiin viidellä CV:llä IMAC-puskuria ja sitten viidellä CV:llä IMAC-puskuria, joka sisälsi 10 mM histidiiniä. Ydinkompleksi eluoitiin kolonnista viidellä IMAC-puskurilla, jotka sisälsivät 100 mM histidiiniä. RC-LH114-W-kompleksia sisältävä fraktio konsentroitiin noin 10 ml:aan Amicon 100 000 MWCO -suodattimella (Merck, Iso-Britannia) varustetussa sekoitussäiliössä, laimennettiin 20-kertaisesti sitoutumispuskurilla ja lisättiin sitten 25 ml:aan DEAE Sepharose -kolonnia. Neljä CV:tä sidottiin puskuriin etukäteen. Pese kolonni neljällä CV-sitoutumispuskurilla ja eluoi sitten kompleksi kahdeksalla CV:llä lineaarisella gradientilla 0–100 mM NaCl (sitoutumispuskurissa) ja loput neljä CV:tä sisältävät 100 mM sitoutumispuskuria. Natriumkloridilla eluoituneet jäännöskompleksit, joiden A880/A280-suhde oli yli 2,4 ja A880/A805-suhde yli 4,6, konsentroitiin noin 2 ml:aan Amicon 100 000 MWCO -sentrifugisuodattimessa ja täytettiin 1,5 CV:lla IMAC:tä etukäteen puskuritasapainotetulla Superdex 200 16/600 -kokoekskluusiokolonnilla ja eluoitiin sitten samassa puskurissa 1,5 CV:n tilavuudella. Kerää kokoekskluusiofraktioiden absorptiospektrit ja väkevöi absorptiospektrit A880/A280-suhteilla yli 2,1 ja A880/A805-suhteilla yli 4,6 A880:aan 100-kertaisesti. Näitä käytetään välittömästi pakastetun TEM-verkon valmisteluun tai säilytetään -80 °C:ssa, kunnes sitä tarvitaan.
Leica EM GP -immersiopakastinta käytettiin matalan lämpötilan TEM-hilanäytteiden valmistukseen. Kompleksi laimennettiin IMAC-puskurissa A880-arvoon 50, ja sitten 5 μl ladattiin juuri hehkupurettuun QUANTIFOIL 1.2/1.3 -hiilipäällysteiseen kupariverkkoon (Agar Scientific, Iso-Britannia). Hilaa inkuboidaan 20 °C:ssa ja 60 %:n suhteellisessa kosteudessa 30 sekunnin ajan, sitten sitä kuivataan 3 sekunnin ajan ja lopuksi sammutetaan nestemäisessä etaanissa -176 °C:ssa.
RC-LH114-W-kompleksin tiedot tallennettiin eBIC:llä (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) Titan Krios -mikroskoopilla, joka toimii 300 kV:n kiihtyvyysjännitteellä, 130 000× nimellisellä suurennuksella ja 20 eV:n energialla. Kuvien tallentamiseen laskentatilassa käytettiin Gatan 968 GIF Quantum -mikroskooppia, jossa oli K2-huippudetektori. Kalibroitu pikselikoko on 1,048 Å ja annosnopeus 3,83 e-Å-2s-1. Elokuva kerättiin 11 sekunnissa ja jaettiin 40 osaan. Mikroskoopin tarkennusta varten käytettiin hiilipäällysteistä aluetta ja sitten kerättiin kolme elokuvaa reikää kohden. Yhteensä kerättiin 3130 elokuvaa, joiden epätarkkuusarvot olivat -1 ja -3 μm välillä.
RC-LH116-kompleksin tiedot kerättiin samalla mikroskoopilla Asterburyn biorakennelaboratoriossa (Leedsin yliopisto, Iso-Britannia). Tiedot kerättiin laskentatilassa 130 k suurennuksella, ja pikselikoko kalibroitiin 1,065 Å:iin annoksella 4,6 e-Å-2s-1. Elokuva tallennettiin 12 sekunnissa ja jaettiin 48 osaan. Yhteensä kerättiin 3359 filmiä, joiden epätarkkuusarvot olivat -1 ja -3 μm:n välillä.
Kaikki tiedonkäsittely suoritetaan Relion 3.0 -prosessissa (42). Säteen liike korjataan annospainotuksella Motioncorr 2:lla (43) ja sitten CTF (kontrastinsiirtofunktio) -parametri määritetään CTFFIND 4.1:llä (44). Tyypillisiä mikrovalokuvia näiden alkukäsittelyvaiheiden jälkeen on esitetty kuvassa 2. S16. Automaattinen valintamalli luodaan valitsemalla manuaalisesti noin 250 pikseliä, joissa on 1000 hiukkasta, 250 pikselin kehyksestä ilman referenssi kaksiulotteista (2D) luokittelua, jolloin hylätään luokitukset, jotka vastaavat näytteen kontaminaatiota tai joilla ei ole havaittavia ominaisuuksia. Sitten suoritettiin automaattinen valinta kaikille mikrovalokuville, ja RC-LH114-W sisälsi 849 359 hiukkasta ja RC-LH116-kompleksi 476 547 hiukkasta. Kaikille valituille hiukkasille on tehty kaksi ei-referenssi-2D-luokittelukierrosta, ja kunkin ajon jälkeen hylätään hiukkaset, jotka täyttävät hiilialueen, näytteen kontaminaation, eivätkä ne sisällä selviä piirteitä tai ovat voimakkaasti päällekkäisiä hiukkasia. Tuloksena on 772 033 (90,9 %) ja 359 678 (75,5 %) hiukkasta. RC-LH114-W:n ja RC-LH116:n 3D-luokitteluun käytetään hiukkasia. Alkuperäinen 3D-referenssimalli luotiin käyttämällä stokastista gradienttilaskeutumismenetelmää. Käyttämällä alkuperäistä mallia referenssinä valitut hiukkaset luokitellaan neljään luokkaan 3D:ssä. Käyttämällä tämän luokan mallia referenssinä, suorita 3D-tarkennus suurimman luokan hiukkasille, käytä sitten alkuperäistä 15 Å alipäästösuodatinta peittämään liuotinalue, lisää 6 pikseliä pehmeitä reunoja ja jälkikäsittele pikselit ylemmän detektorin Gatan K2 -piikin modulaatiosiirtofunktion korjaamiseksi. RC-LH114-W-aineistossa tätä alkuperäistä mallia muokattiin poistamalla voimakas tiheys maskin reunoilta (irrotettu UCSF Chimeran ydinkompleksitiheydestä). Tuloksena olevia malleja (RC-LH114-W:n ja RC-LH116:n resoluutiot ovat 3,91 ja 4,16 Å) käytetään referenssinä toisella 3D-luokittelukierroksella. Käytetyt hiukkaset on ryhmitelty alkuperäiseen 3D-luokkaan, eivätkä ne sisällä vahvaa korrelaatiota naapuruston kanssa. Päällekkäisyyttä tai ilmeisten rakenteellisten piirteiden puutetta. Toisen 3D-luokittelukierroksen jälkeen valittiin luokka, jolla oli korkein resoluutio [RC-LH114-W:lle yksi luokka on 377 703 hiukkasta (44,5 %), RC-LH116:lle on kaksi luokkaa, yhteensä 260 752 hiukkasta (54,7 %), ja ne ovat samoja vain, kun ne on kohdistettu alkukierroksen jälkeen pienellä erolla]. Valitut hiukkaset uutetaan uudelleen 400 pikselin laatikossa ja tarkennetaan 3D-tarkennuksella. Liuotinmaski luodaan käyttämällä alkuperäistä 15 Å alipäästösuodatinta, 3 pikselin karttalaajennusta ja 3 pikselin pehmeää maskia. Käyttämällä hiukkaskohtaista CTF-tarkennusta, hiukkaskohtaista liikekorjausta ja toista hiukkaskohtaisen CTF-tarkennuksen kierrosta, suoritetaan jokaisen vaiheen jälkeen 3D-tarkennus, liuotinmaskaus ja jälkikäsittely tuloksena olevan tekstuurin tarkentamiseksi. Käyttämällä FSC:n (Fourier Shell Correlation Coefficient) raja-arvoa 0,143, RC-LH114-W:n ja RC-LH116:n lopullisten mallien resoluutiot ovat vastaavasti 2,65 ja 2,80 Å. Lopullisen mallin FSC-käyrä on esitetty kuvassa 2. S17.
Kaikki proteiinisekvenssit on ladattu UniProtKB:stä: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProt ID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) -ohjelmistoa käytettiin RC:n homologiamallin rakentamiseen, joka sisältää RC-L:n, RC-M:n ja RC-H:n proteiinisekvenssit sekä Rba:n kiderakenteen. sphaeroides RC:tä käytettiin templaattina (PDB ID: 5LSE) (46). Käytä UCSF Chimeran ”sovituskartta”-työkalua sovittaaksesi luodun mallin karttaan (47), parantaaksesi proteiinirakennetta ja kofaktorin [4×BChl a (monomeerikirjaston aminohappotähteen nimi = BCL), 2×BPh a (BPH), yksi tai kaksi UQ10-tyyppiä (U10), yksi ei-hemirauta (Fe) ja yksi 3,4-dihydroheksakarbonyylikoliini (QAK)] lisäämiseen Coot (48) -ohjelmalla. Koska QAK ei ole saatavilla monomeerikirjastossa, se parametrisoitiin PHENIXin eLBOW-työkalulla (49).
Seuraavaksi konstruoitiin LH1-alayksikkö. Aluksi PHENIXin (49) automaattista konstruointityökalua käytettiin rakentamaan automaattisesti osa LH1-sekvenssistä käyttämällä karttaa ja LH1-α- ja LH1-β-proteiinisekvenssejä syötteenä. Valittiin täydellisin LH1-alayksikkö, erotettiin se ja ladattiin Cootiin, puuttuva sekvenssi lisättiin manuaalisesti ja koko rakenne tarkennettiin manuaalisesti ennen kahden BCls a:n (BCL) ja spirilloksantiinin (CRT) lisäämistä [asiaankuuluvien Rps-standardien mukaisesti]. LH1-kompleksin tiheys ja tunnettu karotenoidipitoisuus. Laji (17)]. Kopioi koko LH1-alayksikkö ja käytä UCSF Chimera “Docking Map Tool” -työkalua telakoidaksesi viereisen ei-mallialueen LH1-tiheyteen ja tarkenna sitä sitten Cootissa; toistettiin prosessi, kunnes kaikki LH1-alayksiköt oli mallinnettu. RC-LH114-W-rakenteessa proteiini segmentoidaan USCF Chimera -kartan jäljellä olevista ei-proteiinikomponenteista poimimalla Coot-kartasta ja Autobuild-työkalua käytetään alkumallin luomiseen sekä jäljellä olevien alayksiköiden (proteiini-W) mallintamiseen PHENIXissä (49). Lisää puuttuvat sekvenssit tuloksena olevaan malliin Cootissa (48) ja tarkenna sitten koko alayksikköä manuaalisesti. Jäljelle jäävä kohdistamaton tiheys sopii lipidien (CDL:n PDB-monomeerikirjaston ID = CDL, POPC = 6PL ja POPG = PGT), β-DDM-detergentin (LMT) ja UQ10-molekyylien (U10) yhdistelmään. Käytä PHENIX-optimointia (49) ja manuaalista optimointia Cootissa (48) täydellisen alkumallin täydellistämiseksi, kunnes mallin tilastotietoja ja sovituksen visuaalista laatua ei voida enää parantaa. Lopuksi terävöitä paikallista karttaa LocScale-työkalulla (50) ja suorita sitten useita muita kohdistamattoman tiheyden mallinnusjaksoja sekä automaattista ja manuaalista optimointia.
Kuvissa 1 ja 2 (S18–S23) on esitetty niiden tiheyksiin telakoidut peptidit, kofaktorit ja muut lipidit ja kinonit. Lopullisen mallin tilastotiedot on esitetty taulukossa S1.
Ellei toisin mainita, UV/Vis/NIR-absorptiospektrit kerättiin Cary60-spektrofotometrillä (Agilent, USA) 1 nm:n välein välillä 250 nm - 1000 nm ja integrointiajalla 0,1 s.
Laimenna näyte kvartsikyvetissä, jonka pituus on 2 mm, kunnes A880 on 1, ja kerää absorptiospektri aallonpituuksien välillä 400–1000 nm. Ympyrädikroiset spektrit kerättiin Jasco 810 -spektropolarimetrillä (Jasco, Japani) 1 nm:n välein aallonpituuksien välillä 400–950 nm, pyyhkäisynopeudella 20 nm/min.
Molaarinen ekstinktiokerroin määritetään laimentamalla ydinkompleksi noin A880-arvoon 50. Laimenna 10 μl:n tilavuus 990 μl:aan sitoutumispuskuria tai metanolia ja kerää absorptiospektri välittömästi BChl:n hajoamisen minimoimiseksi. Kunkin metanolinäytteen BChl-pitoisuus laskettiin ekstinktiokertoimella 54,8 mM⁻¹ cm⁻¹ aallonpituudella 771 nm, ja ekstinktiokerroin määritettiin (51). Jaa mitattu BChl-pitoisuus 32:lla (RC-LH114-W) tai 36:lla (RC-LH116) ydinkompleksin pitoisuuden määrittämiseksi, jota sitten käytetään saman puskuriin kerätyn näytteen absorptiospektrin määrittämiseen. Ekstinktiokerroin. Kullekin näytteelle tehtiin kolme toistettua mittausta, ja laskennassa käytettiin BChl:n Qy-maksimin keskimääräistä absorbanssia. RC-LH114-W:n ekstinktiokerroin mitattuna 878 nm:ssä on 3280±140 mM-1 cm-1, kun taas RC-LH116:n ekstinktiokerroin mitattuna 880 nm:ssä on 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 kvantifioitiin menetelmän (52) mukaisesti. Lyhyesti sanottuna käänteisfaasi-HPLC (RP-HPLC) suoritettiin käyttämällä Agilent 1200 HPLC -järjestelmää. Liuota noin 0,02 nmol RC-LH116:ta tai RC-LH114-W:tä 50 μl:aan 50:50 metanoli:kloroformia, joka sisältää 0,02 % (w/v) rautakloridia, ja injektoi esitasapainotettu Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm liuotettuna 1 ml-1 min-1 40 °C:ssa HPLC-liuottimella (80:20 metanoli:2-propanoli) × 25 cm:n kolonniin. Suorita isokraattinen eluointi HPLC-liuottimella absorbanssin seuraamiseksi aallonpituuksilla 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoidit) ja 780 nm (BChl) yhden tunnin ajan. 275 nm:n kromatogrammin piikki 25,5 minuutin kohdalla integroitiin, eikä se sisältänyt muita havaittavia yhdisteitä. Integroitua pinta-alaa käytetään laskemaan uutetun UQ10:n moolimäärä suhteessa kalibrointikäyrään, joka on laskettu puhtaiden standardien injektiosta 0–5,8 nmol (kuva S14). Jokainen näyte analysoitiin kolmessa toistossa, ja raportoitu virhe vastaa keskiarvon keskihajontaa.
Valmistettiin liuos, joka sisälsi RC-LH1-kompleksia, jonka maksimi-Qy-absorptio oli 0,1, lisäämällä 30 μM pelkistettyä hevosen sydämen sytokromi c2:ta (Merck, Iso-Britannia) ja 0–50 μMUQ2:ta (Merck, Iso-Britannia). Jokaisesta UQ2-pitoisuudesta valmistettiin kolme 1 ml:n näytettä ja inkuboitiin yön yli pimeässä 4 °C:ssa, jotta varmistettiin täydellinen pimeään sopeutuminen ennen mittausta. Liuos ladattiin OLIS RSM1000 -modulaariseen spektrofotometriin, joka oli varustettu 300 nm:n liekki-/500-viivahilalla, 1,24 mm:n sisääntulolla, 0,12 mm:n keskellä ja 0,6 mm:n ulostuloaukolla. Näytefotoputken ja referenssifotomonistinputken sisääntuloon asetettiin 600 nm:n pituinen suodatin viritysvalon poissulkemiseksi. Absorbanssia seurattiin 550 nm:ssä 0,15 sekunnin integrointiajalla. Viritysvalo lähetetään 880 nm:n M880F2 LEDistä (valodiodi) (Thorlabs Ltd., Iso-Britannia) valokuitukaapelin kautta 90 %:n intensiteetillä DC2200-ohjaimen (Thorlabs Ltd., Iso-Britannia) kautta ja lähetetään valonlähteeseen 90 asteen kulmassa. Mittaussäde on suunnattu peiliä vastakkaiseen suuntaan, jotta se heijastaa takaisin kaiken valon, jota näyte ei alun perin absorboinut. Absorbanssia seurataan 10 sekuntia ennen 50 sekunnin valaistusvoimakkuutta. Sen jälkeen absorbanssia seurataan edelleen 60 sekunnin ajan pimeässä sen arvioimiseksi, missä määrin kinololi pelkistää spontaanisti sytokromi c23 +:aa (katso raakatiedot kuvasta S8).
Dataa käsiteltiin sovittamalla lineaarinen alkunopeus 0,5–10 sekunnin välille (UQ2-pitoisuudesta riippuen) ja laskemalla kaikkien kolmen näytteen nopeuksien keskiarvo kullakin UQ2-pitoisuudella. Vastaavan ekstinktiokertoimen avulla laskettua RC-LH1-pitoisuutta käytettiin nopeuden muuntamiseen katalyyttiseksi tehokkuudeksi, joka piirrettiin Origin Pro 2019 -ohjelmistolla (OriginLab, USA) ja sovitettiin Michaelis-Menten-malliin näennäisten Km- ja Kcat-arvojen määrittämiseksi.
Transienttiabsorptiomittauksia varten RC-LH1-näyte laimennettiin noin 2 μM:iin IMAC-puskurissa, joka sisälsi 50 mM natriumaskorbaattia (Merck, USA) ja 0,4 mM terbutiinia (Merck, USA). Askorbiinihappoa käytetään uhrautuvana elektronidonorina ja tert-butaklofeenia QB-inhibiittorina sen varmistamiseksi, että pääasiallinen RC-donori pysyy pelkistyneenä (eli ei fotohapettuneena) koko mittausprosessin ajan. Noin 3 ml näytettä lisätään pyörivään kyvettiin (halkaisija noin 0,1 m, nopeus 350 rpm), jonka optinen reitti on 2 mm, jotta näytteellä laserradalla on riittävästi aikaa pimeään sopeutumiseen virityspulssien välillä. Käytä noin 100 fs:n laserpulsseja vahvistaaksesi Ti:Safiirilaserjärjestelmää (Spectra Physics, USA) näytteen virittämiseksi 880 nm:ssä 1 kHz:n toistotaajuudella (20 nJ NIR:lle tai 100 nJ Vis:lle). Ennen datan keräämistä altista näyte viritysvalolle noin 30 minuutiksi. Altistuminen aiheuttaa QA:n inaktivoitumisen (mahdollisesti vähentäen QA:ta kerran tai kaksi). Huomaa kuitenkin, että tämä prosessi on palautuva, koska pitkän pimeään sopeutumisen jälkeen RC palaa hitaasti QA-aktiivisuuteen. Helios-spektrometrillä (Ultrafast Systems, USA) mitattiin transienttispektrejä viiveajalla -10 - 7000 ps. Käytä Surface Xplorer -ohjelmistoa (Ultrafast Systems, USA) datajoukkojen ryhmittelyn purkamiseen, yhdistämiseen ja standardointiin. Käytä CarpetView-ohjelmistopakettia (Light Conversion Ltd., Liettua) käyttääksesi yhdistettyä datajoukkoa saadaksesi hajoamiseen liittyviä differentiaalispektrejä tai käytä funktiota, joka konvoloi useita eksponentteja laitteen vasteen kanssa sovittaakseen yhden aallonpituuden spektrin kehityksen Originissa (OriginLab, USA).
Kuten edellä mainittiin (53), valmistettiin fotosynteettinen kalvo, joka sisälsi LH1-kompleksin, josta puuttui sekä RC että perifeerinen LH2-antenni. Kalvo laimennettiin 20 mM Trisillä (pH 8,0) ja ladattiin sitten kvartsikyvettiin, jonka optinen polku oli 2 mm. Näytteen virittämiseen käytettiin 30 nJ:n laserpulssia aallonpituudella 540 nm viiveajalla -10 - 7000 ps. Käsittele datajoukko kuten Rps.pal-näytteelle on kuvattu.
Kalvo pelletoitiin sentrifugoimalla 150 000 RCF:n voimalla 2 tunnin ajan 4 °C:ssa, ja sitten sen absorbanssi 880 nm:ssä suspendoitiin uudelleen 20 mM tris-HCl:ään (pH 8,0) ja 200 mM NaCl:aan. Liuota kalvo sekoittamalla hitaasti 2 %:n (w/v) β-DDM:ään 1 tunnin ajan pimeässä 4 °C:ssa. Näyte laimennettiin 100 mM trietyyliammoniumkarbonaatilla (pH 8,0) (TEAB; Merck, UK) proteiinipitoisuuteen 2,5 mg ml-1 (Bio-Rad-analyysi). Jatkokäsittely suoritettiin aiemmin julkaistun menetelmän (54) mukaisesti aloittamalla 50 μg proteiinin laimentamalla yhteensä 50 μl:aan TEAB:ia, joka sisälsi 1 % (w/v) natriumlauraattia (Merck, UK). 60 sekunnin ultraäänikäsittelyn jälkeen se pelkistettiin 5 mM tris(2-karboksietyyli)fosfiinilla (Merck, UK) 37 °C:ssa 30 minuutin ajan. S-alkylointia varten näytettä inkuboitiin 10 mM metyyli-S-metyylitiometaanisulfonaatin (Merck, UK) kanssa ja lisättiin se 200 mM isopropanoli-kantaliuoksesta 10 minuutin ajan huoneenlämmössä. Proteolyyttinen pilkkominen suoritettiin lisäämällä 2 μg trypsiini/endoproteinaasi Lys-C -seosta (Promega UK) ja inkuboitiin 37 °C:ssa 3 tunnin ajan. Lauraattipinta-aktiivinen aine uutettiin lisäämällä 50 μl etyyliasetaattia ja 10 μl 10 % (v/v) LC-laatuista trifluorietikkahappoa (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) ja sekoittamalla vorteksilla 60 sekunnin ajan. Faasien erottumista edistettiin sentrifugoimalla 15 700 RCF:n voimalla 5 minuutin ajan. Valmistajan ohjeiden mukaisesti peptidiä sisältävän alemman faasin huolelliseen aspirointiin ja suolanpoistoon käytettiin C18-spin-kolonnia (Thermo Fisher Scientific, Iso-Britannia). Tyhjiösentrifugoinnilla kuivaamisen jälkeen näyte liuotettiin 0,5 % TFA:han ja 3 % asetonitriiliin, ja 500 ng analysoitiin nanoflow RP -kromatografialla ja massaspektrometrialla käyttäen aiemmin yksityiskohtaisesti kuvattuja järjestelmäparametreja.
Käytä MaxQuant v.1.5.3.30 (56) -ohjelmaa proteiinien tunnistamiseen ja kvantifiointiin etsiäksesi Rps. palustris -proteomitietokantaa (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Massaspektrometrian proteomiikkatiedot on talletettu ProteomeXchange Allianceen PRIDE-kumppaniarkiston (http://proteomecentral.proteomexchange.org) kautta tietojoukon tunnuksella PXD020402.
RPLC-analyysiä ja sähkösuihkutusionisaatiomassaspektrometriaa varten RC-LH1-kompleksi valmistettiin villityypin Rps-soluista. Aikaisemmin julkaistua menetelmää (16) käyttäen palustris-soluissa tuotettu proteiinipitoisuus oli 2 mg ml-1 20 mM Hepesissä (pH 7,8), 100 mM NaCl:ssa ja 0,03 % (w/v) β- (Bio-Rad-analyysi) ) DDM:ssä. Valmistajan ohjeiden mukaisesti 2D-puhdistuskitillä (GE Healthcare, USA) uutettiin 10 μg proteiinia saostusmenetelmällä ja sakka liuotettiin 20 μl:aan 60 % (v/v) muurahaishappoa (FA), 20 % (v/v) asetonitriiliä ja 20 % (v/v) vettä. Viisi mikrolitraa analysoitiin RPLC:llä (Dionex RSLC) ja massaspektrometrialla (Maxis UHR-TOF, Bruker). Käytä MabPac 1.2×100 mm -kolonnia (Thermo Fisher Scientific, Iso-Britannia) erotukseen 60 °C:ssa ja nopeudella 100 μlmin -1, gradientilla 85 % (v/v) liuotinta A [0,1 % (v/v) FA ja 0,02 % (V/v) TFA:n vesiliuos] - 85 % (v/v) liuotinta B [0,1 % (v/v) FA ja 0,02 % (v/v) 90 % (v/v) asetonitriili-TFA:ssa]. Käyttämällä standardia sähkösuihkutusionisaatiolähdettä ja oletusparametreja yli 60 minuutin ajan, massaspektrometri saavuttaa 100 - 2750 m/z (massa-varaussuhde). Käytä ExPASy-bioinformatiikan resurssiportaalin FindPept-työkalua (https://web.expasy.org/findpept/) ja kartoita massaspektri kompleksin alayksiköihin.
Soluja kasvatettiin 72 tuntia 100 ml:n NF-alhaisessa (10 μMm-2 s-1), keskivahvassa (30 μMm-2 s-1) tai voimakkaassa (300 μMm-2 s-1) valossa. M22-elatusaine (M22-elatusaine, josta ammoniumsulfaattia ei ole poistettu ja natriumsukkinaatti on korvattu natriumasetaatilla) 100 ml:n kierrekorkkipullossa (23). Viidessä 30 sekunnin syklissä 0,1 mikronin lasihelmiä pilkottiin tilavuussuhteessa 1:1 solujen lysoimiseksi ja jäähdytettiin jäillä 5 minuuttia. Liukenematon aines, ehjät solut ja lasihelmet poistettiin sentrifugoimalla 16 000 RCF:n voimalla 10 minuutin ajan pöytämikrosentrifugissa. Kalvo erotettiin Ti 70.1 -roottorissa 100 000 RCF:llä 20 mM tris-HCl:ssä (pH 8,0) ja 40/15 % (w/w) sakkaroosigradientilla 10 tunnin ajan.
Kuten aiemmassa työssämme on kuvattu, His-merkin immunodetektio PufW:ssä (16). Lyhyesti sanottuna puhdistettu ydinkompleksi (11,8 nM) tai saman RC-pitoisuuden sisältävä kalvo (määritetty hapetuksella vähentämällä pelkistetty erotusspektri ja sovittamalla värjätyn geelin latausmäärä) kahdesti laimennetussa 2x SDS-latauspuskurissa (Merck, Iso-Britannia). Proteiinit erotettiin replikoidulla 12 % bis-tris NuPage -geelillä (Thermo Fisher Scientific, Iso-Britannia). Geeli värjättiin Coomassie Brilliant Bluella (Bio-Rad, Iso-Britannia) RC-L-alayksikön lataamiseksi ja visualisoimiseksi. Toisen geelin proteiini siirrettiin metanoliaktivoidulle polyvinylideenifluoridikalvolle (PVDF) (Thermo Fisher Scientific, Iso-Britannia) immunomääritystä varten. PVDF-kalvo blokattiin 50 mM tris-HCl:lla (pH 7,6), 150 mM NaCl:lla, 0,2 % (v/v) Tween-20:lla ja 5 % (w/v) rasvattomalla maitojauheella, ja inkuboitiin sitten anti-His-primäärivasta-aineen kanssa (laimennettu vasta-ainepuskuri [50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl ja 0,05 % (v/v) Tween-20] 1:1000 A190-114A:ssa, Bethyl Laboratories, USA) neljän tunnin ajan. Kolmen pesun jälkeen viiden minuutin ajan vasta-ainepuskurissa kalvo yhdistettiin piparjuuriperoksidaasiin (Sigma-Aldrich, Iso-Britannia) perustuvan hiirivasta-aineen kanssa (laimennettuna suhteessa 1:10 000 vasta-ainepuskurissa). Inkuboi havaitsemisen mahdollistamiseksi (5 minuuttia kolmen pesun jälkeen vasta-ainepuskurissa) käyttämällä WESTAR ETA C 2.0 -kemiluminesenssisubstraattia (Cyanagen, Italia) ja Amersham Imager 600 -laitetta (GE Healthcare, Iso-Britannia).
Piirtämällä kunkin värjätyn geelin tai immunomäärityskaistan intensiteettijakauma, integroimalla piikin alla oleva pinta-ala ja laskemalla RC-L:n (värjätty geeli) ja proteiini-W:n (immunomääritys) intensiteettisuhde ImageJ:ssä (57) käsittele kuva. Nämä suhteet muunnettiin moolisuhteiksi olettamalla, että RC-L:n ja proteiini-W:n suhde puhtaassa RC-LH114-W-näytteessä oli 1:1, ja normalisoimalla koko datajoukko vastaavasti.
Tämän artikkelin lisämateriaaleja on osoitteessa http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Tämä on avoimen saatavuuden artikkeli, joka on jaettu Creative Commons Attribution License -lisenssin ehtojen mukaisesti. Artikkelia saa käyttää, jakaa ja kopioida rajoittamattomasti missä tahansa mediassa sillä ehdolla, että alkuperäinen teos mainitaan asianmukaisesti.
Huomautus: Pyydämme sinua antamaan sähköpostiosoitteesi vain, jotta sivulle suosittelemasi henkilö tietää, että haluat hänen näkevän sähköpostin ja että se ei ole roskapostia. Emme tallenna sähköpostiosoitteita.
Tätä kysymystä käytetään testaamaan, oletko vierailija, ja estämään automaattinen roskapostin lähetys.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Reaktiokeskuksessa sijaitsevan valonloukkukompleksin 1 tarkka rakenne tarjoaa uusia näkemyksiä kinonidynamiikkaan.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Reaktiokeskuksessa sijaitsevan valonloukkukompleksin 1 tarkka rakenne tarjoaa uusia näkemyksiä kinonidynamiikkaan.
©2021 American Association for the Advanced of Science. kaikki oikeudet pidätetään. AAAS on HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ja COUNTER kumppani. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.