Artikkeli on osa tutkimusaihetta ”Edistyneet bioremediaatiotekniikat ja synteettisten orgaanisten yhdisteiden (SOC) kierrätysprosessit”. Katso kaikki 14 artikkelia.
Pienimolekyylipainoisia polysyklisiä aromaattisia hiilivetyjä (PAH-yhdisteitä), kuten naftaleenia ja substituoituja naftaleeneja (metyylinaftaleeni, naftoehappo, 1-naftyyli-N-metyylikarbamaatti jne.), käytetään laajalti eri teollisuudenaloilla, ja ne ovat genotoksisia, mutageenisia ja/tai karsinogeenisia eliöille. Näitä synteettisiä orgaanisia yhdisteitä (SOC) eli vierasaineita pidetään prioriteettisaasteina, ja ne aiheuttavat vakavan uhan maailmanlaajuiselle ympäristölle ja kansanterveydelle. Ihmisen toiminnan intensiteetti (esim. hiilen kaasutus, öljynjalostus, ajoneuvojen päästöt ja maatalouden sovellukset) määrää näiden kaikkialla esiintyvien ja pysyvien yhdisteiden pitoisuuden, kohtalon ja kulkeutumisen. Fysikaalisten ja kemiallisten käsittely-/poistomenetelmien lisäksi turvallisena, kustannustehokkaana ja lupaavana vaihtoehtona ovat nousseet esiin vihreät ja ympäristöystävälliset teknologiat, kuten bioremediaatio, jossa käytetään mikro-organismeja, jotka kykenevät hajottamaan POC-yhdisteet kokonaan tai muuttamaan ne myrkyttömiksi sivutuotteiksi. Maaperän mikrobiston proteobakteerien (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia ja Neosphingobacterium), firmicute-bakteerien (Bacillus ja Paenibacillus) ja aktinobakteerien (Rhodococcus ja Arthrobacter) pääjaksoihin kuuluvat useat bakteerilajit ovat osoittaneet kyvyn hajottaa erilaisia ​​orgaanisia yhdisteitä. Aineenvaihduntatutkimukset, genomiikka ja metagenomiikka-analyysi auttavat meitä ymmärtämään näiden yksinkertaisten elämänmuotojen katabolista monimutkaisuutta ja monimuotoisuutta, mitä voidaan edelleen soveltaa tehokkaaseen biohajoamiseen. PAH-yhdisteiden pitkäaikainen olemassaolo on johtanut uusien hajoamisfenotyyppien syntymiseen horisontaalisen geeninsiirron kautta käyttämällä geneettisiä elementtejä, kuten plasmideja, transposoneja, bakteriofageja, genomisia saarekkeita ja integroivia konjugatiivisia elementtejä. Systeemibiologia ja tiettyjen isolaattien tai malliyhteisöjen (konsortioiden) geenitekniikka voivat mahdollistaa näiden PAH-yhdisteiden kattavan, nopean ja tehokkaan bioremediaation synergististen vaikutusten kautta. Tässä katsauksessa keskitymme naftaleenia ja substituoitua naftaleenia hajottavien bakteerien eri aineenvaihduntareitteihin ja monimuotoisuuteen, geneettiseen koostumukseen ja monimuotoisuuteen sekä soluvasteisiin/sopeutumiin. Tämä tarjoaa ekologista tietoa kenttäkäyttöön ja kantojen optimointiin tehokasta bioremediaatiota varten.
Teollisuuden nopea kehitys (petrokemia, maatalous, lääkkeet, tekstiilivärit, kosmetiikka jne.) on edistänyt maailmanlaajuista taloudellista vaurautta ja parantanut elintasoa. Tämä eksponentiaalinen kehitys on johtanut suuren määrän synteettisten orgaanisten yhdisteiden (SOC) tuotantoon, joita käytetään erilaisten tuotteiden valmistuksessa. Näitä vieraita yhdisteitä eli SOC-yhdisteitä ovat polysykliset aromaattiset hiilivedyt (PAH-yhdisteet), torjunta-aineet, rikkakasvien torjunta-aineet, pehmittimet, väriaineet, lääkkeet, organofosfaatit, palonestoaineet, haihtuvat orgaaniset liuottimet jne. Ne pääsevät ilmakehään, vesi- ja maaekosysteemeihin, joissa niillä on moniulotteisia vaikutuksia, jotka aiheuttavat haitallisia vaikutuksia erilaisiin biomuotoihin muuttamalla fysikaalis-kemiallisia ominaisuuksia ja yhteisörakennetta (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). Monilla aromaattisilla epäpuhtauksilla on voimakkaita ja tuhoisia vaikutuksia moniin ehjiin ekosysteemeihin/biodiversiteettikeskittymiin (esim. koralliriutat, arktiset/antarktiset jäätiköt, korkeat vuoristojärvet, syvänmeren sedimentit jne.) (Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020). Viimeaikaiset geomikrobiologiset tutkimukset ovat osoittaneet, että synteettisen orgaanisen aineen (esim. aromaattisten epäpuhtauksien) ja niiden johdannaisten laskeutuminen keinotekoisten rakenteiden (rakennetun ympäristön) pinnoille (esim. kulttuuriperintökohteet ja graniitista, kivestä, puusta ja metallista valmistetut monumentit) kiihdyttää niiden hajoamista (Gadd 2017; Liu et al. 2018). Ihmisen toiminta voi voimistaa ja pahentaa monumenttien ja rakennusten biologista hajoamista ilmansaasteiden ja ilmastonmuutoksen kautta (Liu et al. 2020). Nämä orgaaniset epäpuhtaudet reagoivat ilmakehän vesihöyryn kanssa ja laskeutuvat rakenteisiin aiheuttaen materiaalin fysikaalista ja kemiallista hajoamista. Biohajoamisen tunnustetaan laajalti elävien organismien aiheuttamiksi ei-toivotuiksi muutoksiksi materiaalien ulkonäössä ja ominaisuuksissa, jotka vaikuttavat niiden säilymiseen (Pochon ja Jaton, 1967). Näiden yhdisteiden mikrobien lisätoiminta (aineenvaihdunta) voi heikentää rakenteellista eheyttä, konservoinnin tehokkuutta ja kulttuuriarvoa (Gadd, 2017; Liu et al., 2018). Toisaalta joissakin tapauksissa mikrobien sopeutuminen ja reagointi näihin rakenteisiin on havaittu hyödylliseksi, koska ne muodostavat biofilmejä ja muita suojaavia kuoria, jotka hidastavat hajoamis-/hajoamisnopeutta (Martino, 2016). Siksi tehokkaiden pitkän aikavälin kestävien konservointistrategioiden kehittäminen kivi-, metalli- ja puumonumenteille edellyttää perusteellista ymmärrystä tähän prosessiin liittyvistä keskeisistä prosesseista. Verrattuna luonnollisiin prosesseihin (geologiset prosessit, metsäpalot, tulivuorenpurkaukset, kasvien ja bakteerien reaktiot), ihmisen toiminta johtaa suurten määrien polysyklisten aromaattisten hiilivetyjen (PAH-yhdisteiden) ja muun orgaanisen hiilen (OC) vapautumiseen ekosysteemeihin. Monet maataloudessa (hyönteismyrkyt ja torjunta-aineet, kuten DDT, atratsiini, karbaryyli, pentakloorifenoli jne.), teollisuudessa (raakaöljy, öljyliete/jäte, öljystä saatavat muovit, PCB-yhdisteet, pehmittimet, pesuaineet, desinfiointiaineet, kaasutusaineet, hajusteet ja säilöntäaineet), henkilökohtaisen hygienian tuotteissa (aurinkovoiteet, desinfiointiaineet, hyönteiskarkotteet ja polysykliset myskit) ja ammuksissa (räjähteet, kuten 2,4,6-TNT) käytetyt PAH-yhdisteet ovat potentiaalisia vierasaineita, jotka voivat vaikuttaa planeetan terveyteen (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna ja Phale, 2008; Petrie et al., 2015). Tätä luetteloa voidaan laajentaa kattamaan öljystä saatavat yhdisteet (polttoöljyt, voiteluaineet, asfalteenit), suuren molekyylipainon omaavat biomuovit ja ioniset nesteet (Amde et al., 2015). Taulukossa 1 luetellaan erilaisia ​​aromaattisia epäpuhtauksia ja niiden sovelluksia eri teollisuudenaloilla. Viime vuosina haihtuvien orgaanisten yhdisteiden sekä hiilidioksidin ja muiden kasvihuonekaasujen ihmisen aiheuttamat päästöt ovat alkaneet lisääntyä (Dvorak et al., 2017). Ihmisen aiheuttamat vaikutukset ovat kuitenkin merkittävästi suurempia kuin luonnolliset. Lisäksi havaitsimme, että useita orgaanisia yhdisteitä (SOC) esiintyy monissa ympäristöissä, ja ne on tunnistettu uusiksi epäpuhtauksiksi, joilla on haitallisia vaikutuksia biomeihin (kuva 1). Ympäristövirastot, kuten Yhdysvaltain ympäristönsuojeluvirasto (USEPA), ovat sisällyttäneet monia näistä epäpuhtauksista prioriteettilistalleen niiden sytotoksisten, genotoksisten, mutageenisten ja karsinogeenisten ominaisuuksien vuoksi. Siksi tarvitaan tiukkoja hävittämissäännöksiä ja tehokkaita strategioita jätteiden käsittelyyn/poistamiseen saastuneista ekosysteemeistä. Erilaiset fysikaaliset ja kemialliset käsittelymenetelmät, kuten pyrolyysi, oksidatiivinen lämpökäsittely, ilman ilmastus, kaatopaikkasijoitus, poltto jne., ovat tehottomia ja kalliita ja tuottavat syövyttäviä, myrkyllisiä ja vaikeasti käsiteltäviä sivutuotteita. Maailmanlaajuisen ympäristötietoisuuden kasvaessa mikro-organismit, jotka kykenevät hajottamaan näitä epäpuhtauksia ja niiden johdannaisia ​​(kuten halogenoituja, nitro-, alkyyli- ja/tai metyyliyhdisteitä), herättävät yhä enemmän huomiota (Fennell et al., 2004; Haritash ja Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020). Näiden alkuperäisten mikro-organismien käytöllä yksinään tai sekaviljelmissä (pesäkkeissä) aromaattisten epäpuhtauksien poistamiseksi on etuja ympäristöturvallisuuden, kustannusten, tehokkuuden, vaikuttavuuden ja kestävyyden kannalta. Tutkijat selvittävät myös mikrobiprosessien integrointia sähkökemiallisiin redox-menetelmiin, nimittäin bioelektrokemiallisiin järjestelmiin (BES), lupaavana teknologiana epäpuhtauksien käsittelyyn/poistoon (Huang et al., 2011). BES-teknologia on herättänyt yhä enemmän huomiota korkean hyötysuhteensa, alhaisten kustannustensa, ympäristöturvallisuutensa, huoneenlämmössä toimivuutensa, bioyhteensopivien materiaaliensa ja arvokkaiden sivutuotteiden (esim. sähkön, polttoaineen ja kemikaalien) talteenottokyvynsä ansiosta (Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). Suuritehoisten genomisekvensointi- ja omiikkatyökalujen/-menetelmien tulo on tuottanut runsaasti uutta tietoa erilaisten hajottavien mikro-organismien reaktioiden geneettisestä säätelystä, proteomiikasta ja fluksomiikasta. Näiden työkalujen yhdistäminen systeemibiologiaan on entisestään parantanut ymmärrystämme mikro-organismien kohdekatabolisten reittien valinnasta ja hienosäädöstä (eli metabolinen suunnittelu) tehokkaan ja tuloksellisen biohajoamisen saavuttamiseksi. Jotta voimme suunnitella tehokkaita bioremediaatiostrategioita sopivia mikro-organismeja käyttäen, meidän on ymmärrettävä mikro-organismien biokemiallinen potentiaali, metabolinen monimuotoisuus, geneettinen koostumus ja ekologia (autoekologia/synekologia).
Kuva 1. Pienimolekyylisten PAH-yhdisteiden lähteet ja reitit erilaisissa ympäristöissä ja eliöstöön vaikuttavissa tekijöissä. Katkoviivat kuvaavat ekosysteemielementtien välisiä vuorovaikutuksia.
Tässä katsauksessa olemme pyrkineet tiivistämään tiedot yksinkertaisten PAH-yhdisteiden, kuten naftaleenin ja substituoitujen naftaleenien, hajoamisesta eri bakteeri-isolaattien toimesta. Tiedot kattavat aineenvaihduntareitit ja monimuotoisuuden, hajoamiseen osallistuvat entsyymit, geenikoostumuksen/sisällön ja monimuotoisuuden, soluvasteet ja bioremediaation eri näkökohdat. Biokemiallisten ja molekyylitason ymmärtäminen auttaa tunnistamaan sopivat isäntäkannat ja niiden jatkogeenisuunnittelun tällaisten prioriteettisaasteiden tehokasta bioremediaatiota varten. Tämä auttaa kehittämään strategioita kohdennettujen bakteerikonsortioiden perustamiseksi tehokasta bioremediaatiota varten.
Suuren määrän myrkyllisiä ja vaarallisia aromaattisia yhdisteitä (jotka täyttävät Huckelin säännön 4n + 2π elektronit, n = 1, 2, 3, …) läsnäolo aiheuttaa vakavan uhan useille ympäristöelementeille, kuten ilmalle, maaperälle, sedimenteille sekä pinta- ja pohjavesille (Puglisi et al., 2007). Näissä yhdisteissä on yksittäisiä bentseenirenkaita (monosyklisiä) tai useita bentseenirenkaita (polysyklisiä), jotka ovat järjestäytyneet lineaariseen, kulmikkaaseen tai klusterimuotoon, ja ne osoittavat vakautta (stabiilisuutta/epästabiilisuutta) ympäristössä korkean negatiivisen resonanssienergian ja inertiyden (inertiteetin) vuoksi, mikä voidaan selittää niiden hydrofobisiteetillä ja pelkistetyllä tilalla. Kun aromaattinen rengas korvataan edelleen metyyli- (-CH3), karboksyyli- (-COOH), hydroksyyli- (-OH) tai sulfonaattiryhmillä (-HSO3), siitä tulee vakaampi, sillä on voimakkaampi affiniteetti makromolekyyleihin ja se on biokertyvä biologisissa järjestelmissä (Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). Yhdysvaltain ympäristönsuojeluvirasto (EPA) on sisällyttänyt joitakin pienimolekyylipainoisia polysyklisiä aromaattisia hiilivetyjä (LMWAH-yhdisteitä), kuten naftaleenin ja sen johdannaiset [metyylinaftaleeni, naftoehappo, naftaleenisulfonaatti ja 1-naftyyli-N-metyylikarbamaatti (karbaryyli)] prioriteettiolentoaineiden luetteloon genotoksisuuden, mutageenisyyden ja/tai karsinogeenisuuden vuoksi (Cerniglia, 1984). Tämän luokan NM-PAH-yhdisteiden päästäminen ympäristöön voi johtaa näiden yhdisteiden biokertymiseen ravintoketjun kaikilla tasoilla ja siten vaikuttaa ekosysteemien terveyteen (Binkova ym., 2000; Srogi, 2007; Quinn ym., 2009).
PAH-yhdisteiden lähteet ja reitit eliöstössä tapahtuvat pääasiassa kulkeutumisen ja eri ekosysteemikomponenttien, kuten maaperän, pohjaveden, pintaveden, viljelykasvien ja ilmakehän, välisten vuorovaikutusten kautta (Arey ja Atkinson, 2003). Kuva 1 esittää erilaisten pienimolekyylipainoisten PAH-yhdisteiden vuorovaikutuksia ja jakautumista ekosysteemeissä sekä niiden reittejä eliöstölle/ihmisille altistumiseen. PAH-yhdisteitä kerrostuu pinnoille ilmansaasteiden seurauksena sekä ajoneuvojen päästöjen, teollisuuden pakokaasujen (hiilen kaasutus, poltto ja koksin tuotanto) kulkeutumisen (ajautumisen) ja laskeuman kautta. Teollinen toiminta, kuten synteettisten tekstiilien, väriaineiden ja maalien valmistus; puunsuojaus; kumin jalostus; sementin valmistus; torjunta-aineiden tuotanto; ja maataloussovellukset, ovat tärkeimpiä PAH-yhdisteiden lähteitä maa- ja vesijärjestelmissä (Bamforth ja Singleton, 2005; Wick et al., 2011). Tutkimukset ovat osoittaneet, että esikaupunki- ja kaupunkialueiden, moottoriteiden lähellä olevien alueiden ja suurten kaupunkien maaperä on alttiimpi polysyklisille aromaattisille hiilivedyille (PAH-yhdisteille) voimalaitosten päästöjen, asuinrakennusten lämmityksen, ilma- ja tieliikenteen kuormituksen sekä rakennustoiminnan vuoksi (Suman et al., 2016). (2008) osoittivat, että PAH-yhdisteiden pitoisuus maaperässä teiden lähellä New Orleansissa, Louisianassa, Yhdysvalloissa, oli jopa 7189 μg/kg, kun taas avoimessa tilassa se oli vain 2404 μg/kg. Vastaavasti jopa 300 μg/kg PAH-pitoisuuksia on raportoitu useiden Yhdysvaltain kaupunkien hiilen kaasutusalueiden lähellä (Kanaly ja Harayama, 2000; Bamforth ja Singleton, 2005). Intian eri kaupunkien, kuten Delhin (Sharma ym., 2008), Agran (Dubey ym., 2014), Mumbain (Kulkarni ja Venkataraman, 2000) ja Visakhapatnamin (Kulkarni ym., 2014), maaperän on raportoitu sisältävän suuria pitoisuuksia PAH-yhdisteitä. Aromaattiset yhdisteet adsorboituvat helpommin maaperän hiukkasiin, orgaaniseen aineeseen ja savimineraaleihin, jolloin niistä tulee merkittäviä hiilinieluja ekosysteemeissä (Srogi, 2007; Peng ym., 2008). PAH-yhdisteiden tärkeimmät lähteet vesiekosysteemeissä ovat sademäärä (märkä/kuiva sademäärä ja vesihöyry), kaupunkien valumavedet, jätevesipäästöt, pohjaveden täydentyminen jne. (Srogi, 2007). On arvioitu, että noin 80 % meriekosysteemien PAH-yhdisteistä on peräisin sademäärästä, sedimentaatiosta ja jätevesipäästöistä (Motelay-Massei ym., 2006; Srogi, 2007). Korkeammat PAH-pitoisuudet pintavedessä tai kiinteän jätteen kaatopaikkojen suotovedessä vuotavat lopulta pohjaveteen, mikä aiheuttaa merkittävän kansanterveysuhan, koska yli 70 % Etelä- ja Kaakkois-Aasian väestöstä juo pohjavettä (Duttagupta ym., 2019). Duttagupta ym. (2020) äskettäin tekemässä joki- (32) ja pohjavesianalyyseissä Länsi-Bengalissa, Intiassa, havaittiin, että arviolta 53 % kaupunkien asukkaista ja 44 % maaseudun asukkaista (yhteensä 20 miljoonaa asukasta) saattaa altistua naftaleenille (4,9–10,6 μg/l) ja sen johdannaisille. Erilaisten maankäyttömallien ja lisääntyneen pohjavedenoton katsotaan olevan tärkeimmät tekijät, jotka ohjaavat pienimolekyylipainoisten PAH-yhdisteiden pystysuoraa kulkeutumista (advektiota) maan alla. Maatalouden valumien, yhdyskuntien ja teollisuuden jätevesipäästöjen sekä kiinteän jätteen/jätteen päästöjen on havaittu olevan PAH-yhdisteiden vaikutuksen alaisia ​​jokien valuma-alueissa ja maan alla olevissa sedimenteissä. Ilmakehän sateet pahentavat entisestään PAH-saasteita. Korkeita PAH-yhdisteiden ja niiden alkyylijohdannaisten pitoisuuksia (yhteensä 51) on raportoitu joissa/valuma-alueilla maailmanlaajuisesti, kuten Fraser-joessa, Louan-joessa, Denso-joessa, Missouri-joessa, Anacostia-joessa, Ebro-joessa ja Delaware-joessa (Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018). Ganges-joen valuma-alueen sedimenteissä naftaleenin ja fenantreenin havaittiin olevan merkittävimpiä (havaittiin 70 %:ssa näytteistä) (Duttagupta et al., 2019). Lisäksi tutkimukset ovat osoittaneet, että juomaveden klooraus voi johtaa myrkyllisempien hapettuneiden ja kloorattujen PAH-yhdisteiden muodostumiseen (Manoli ja Samara, 1999). PAH-yhdisteet kertyvät viljoihin, hedelmiin ja vihanneksiin kasvien imeytyessä niitä saastuneesta maaperästä, pohjavedestä ja sateesta (Fismes et al., 2002). Monet vesieliöt, kuten kalat, simpukat, venäjänsirkat ja katkaravut, saastuvat PAH-yhdisteillä saastuneen ruoan ja meriveden nauttimisen sekä kudosten ja ihon kautta (Mackay ja Fraser, 2000). Kypsennys-/käsittelymenetelmät, kuten grillaus, paahtaminen, savustus, friteeraus, kuivaaminen, leivonta ja hiilikypsennys, voivat myös johtaa merkittäviin määriin PAH-yhdisteitä elintarvikkeissa. Tämä riippuu suurelta osin savustusmateriaalin valinnasta, fenoli-/aromaattisten hiilivetyjen pitoisuudesta, kypsennysmenetelmästä, lämmittimen tyypistä, kosteuspitoisuudesta, hapen saannista ja palamislämpötilasta (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). Polysyklisiä aromaattisia hiilivetyjä (PAH-yhdisteitä) on havaittu myös maidossa vaihtelevina pitoisuuksina (0,75–2,1 mg/l) (Girelli et al., 2014). Näiden PAH-yhdisteiden kertyminen elintarvikkeisiin riippuu myös elintarvikkeen fysikaalis-kemiallisista ominaisuuksista, kun taas niiden myrkylliset vaikutukset liittyvät fysiologisiin toimintoihin, aineenvaihduntaan, imeytymiseen, jakautumiseen ja jakautumiseen elimistöön (Mechini et al., 2011).
Polysyklisten aromaattisten hiilivetyjen (PAH-yhdisteiden) myrkyllisyys ja haitalliset vaikutukset ovat olleet tiedossa jo pitkään (Cherniglia, 1984). Pienimolekyylipainoiset polysykliset aromaattiset hiilivedyt (LMW-PAH-yhdisteet) (kaksi tai kolme rengasta) voivat sitoutua kovalenttisesti erilaisiin makromolekyyleihin, kuten DNA:han, RNA:han ja proteiineihin, ja ovat karsinogeenisia (Santarelli et al., 2008). Hydrofobisen luonteensa vuoksi ne erotetaan toisistaan ​​lipidikalvoilla. Ihmisillä sytokromi P450 -mono-oksigenaasit hapettavat PAH-yhdisteet epoksideiksi, joista jotkut ovat erittäin reaktiivisia (esim. baedioliepoksidi) ja voivat johtaa normaalien solujen muuttumiseen pahanlaatuisiksi (Marston et al., 2001). Lisäksi PAH-yhdisteiden transformaatiotuotteet, kuten kinonit, fenolit, epoksidit, diolit jne., ovat myrkyllisempiä kuin lähtöyhdisteet. Jotkut PAH-yhdisteet ja niiden metaboliset välituotteet voivat vaikuttaa hormoneihin ja erilaisiin aineenvaihdunnan entsyymeihin, mikä voi vaikuttaa haitallisesti kasvuun, keskushermostoon, lisääntymis- ja immuunijärjestelmiin (Swetha ja Phale, 2005; Vamsee-Krishna ym., 2006; Oostingh ym., 2008). Lyhytaikaisen altistumisen pienimolekyylipainoisille PAH-yhdisteille on raportoitu aiheuttavan keuhkojen toiminnan heikkenemistä ja tromboosia astmaatikoilla sekä lisäävän iho-, keuhko-, virtsarakko- ja ruoansulatuskanavan syöpien riskiä (Olsson ym., 2010; Diggs ym., 2011). Eläinkokeet ovat myös osoittaneet, että PAH-altistus voi vaikuttaa haitallisesti lisääntymistoimintaan ja kehitykseen ja voi aiheuttaa kaihia, munuais- ja maksavaurioita sekä keltaisuutta. Erilaisten PAH-yhdisteiden biotransformaatiotuotteiden, kuten diolien, epoksidien, kinonien ja vapaiden radikaalien (kationien), on osoitettu muodostavan DNA-addukteja. Stabiilien adduktien on osoitettu muuttavan DNA:n replikaatiokoneistoa, kun taas epästabiilit adduktit voivat depurinoida DNA:ta (pääasiassa adeniiniksi ja joskus guaniiniksi); molemmat voivat aiheuttaa virheitä, jotka johtavat mutaatioihin (Schweigert et al. 2001). Lisäksi kinonit (bentso-/pan-) voivat tuottaa reaktiivisia happilajeja (ROS), jotka aiheuttavat kohtalokkaita vaurioita DNA:lle ja muille makromolekyyleille ja siten vaikuttavat kudosten toimintaan/elinkelpoisuuteen (Ewa ja Danuta 2017). Kroonisen altistumisen pienille pyreeni-, bifenyyli- ja naftaleenipitoisuuksille on raportoitu aiheuttavan syöpää koe-eläimillä (Diggs et al. 2012). Niiden tappavan myrkyllisyyden vuoksi näiden PAH-yhdisteiden puhdistaminen/poistaminen saastuneilta/saastuneilta alueilta on ensisijaisen tärkeää.
PAH-yhdisteiden poistamiseksi saastuneista alueista/ympäristöistä on käytetty erilaisia ​​fysikaalisia ja kemiallisia menetelmiä. Prosesseilla, kuten polttamisella, kloorinpoistolla, UV-hapetuksella, kiinnityksellä ja liuotinuutolla, on monia haittoja, kuten myrkyllisten sivutuotteiden muodostuminen, prosessin monimutkaisuus, turvallisuus- ja sääntelykysymykset, alhainen tehokkuus ja korkeat kustannukset. Mikrobien biohajoaminen (kutsutaan bioremediaatioksi) on kuitenkin lupaava vaihtoehtoinen lähestymistapa, jossa käytetään mikro-organismeja puhdasviljelmien tai pesäkkeiden muodossa. Fysikaalisiin ja kemiallisiin menetelmiin verrattuna tämä prosessi on ympäristöystävällinen, ei-invasiivinen, kustannustehokas ja kestävä. Bioremediaatio voidaan suorittaa saastuneella alueella (in situ) tai erityisesti valmistellulla alueella (ex situ), ja siksi sitä pidetään kestävämpänä puhdistusmenetelmänä kuin perinteisiä fysikaalisia ja kemiallisia menetelmiä (Juhasz ja Naidu, 2000; Andreoni ja Gianfreda, 2007; Megharaj et al., 2011; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020).
Aromaattisten epäpuhtauksien hajoamiseen liittyvien mikrobien aineenvaihduntavaiheiden ymmärtämisellä on valtavat tieteelliset ja taloudelliset vaikutukset ekologiseen ja ympäristön kestävyyteen. Arviolta 2,1 × 1018 grammaa hiiltä (C) on varastoitunut sedimentteihin ja orgaanisiin yhdisteisiin (eli öljyyn, maakaasuun ja hiileen eli fossiilisiin polttoaineisiin) maailmanlaajuisesti, mikä vaikuttaa merkittävästi maailmanlaajuiseen hiilen kiertokulkuun. Nopea teollistuminen, fossiilisten polttoaineiden louhinta ja ihmisen toiminta kuitenkin kuluttavat näitä litosfäärin hiilivarastoja, jolloin ilmakehään vapautuu vuosittain arviolta 5,5 × 1015 g orgaanista hiiltä (epäpuhtauksina) (Gonzalez-Gaya ym., 2019). Suurin osa tästä orgaanisesta hiilestä pääsee maa- ja meriekosysteemeihin sedimentaation, kuljetuksen ja valunnan kautta. Lisäksi fossiilisista polttoaineista peräisin olevat uudet synteettiset epäpuhtaudet, kuten muovit, pehmittimet ja muovin stabilointiaineet (ftalaatit ja niiden isomeerit), saastuttavat vakavasti meri-, maaperä- ja vesiekosysteemejä ja niiden eliöstöä, mikä pahentaa maailmanlaajuisia ilmastoriskejä. Erilaisia ​​mikromuoveja, nanomuoveja, muovifragmentteja ja niiden myrkyllisiä monomeerituotteita, jotka ovat peräisin polyeteenitereftalaatista (PET), on kertynyt Tyynellemerelle Pohjois-Amerikan ja Kaakkois-Aasian välille muodostaen "Tyynenmeren suuren jätesaaren" ja vahingoittaen meren elämää (Newell et al., 2020). Tieteelliset tutkimukset ovat osoittaneet, että tällaisia ​​epäpuhtauksia/jätettä ei ole mahdollista poistaa millään fysikaalisilla tai kemiallisilla menetelmillä. Tässä yhteydessä hyödyllisimpiä mikro-organismeja ovat ne, jotka kykenevät oksidatiivisesti metaboloimaan epäpuhtauksia hiilidioksidiksi, kemialliseksi energiaksi ja muiksi myrkyttömiksi sivutuotteiksi, jotka lopulta siirtyvät muihin ravinteiden kiertoprosesseihin (H, O, N, S, P, Fe jne.). Siksi aromaattisten epäpuhtauksien mineralisaation mikrobisen ekofysiologian ja sen ympäristönhallinnan ymmärtäminen on ratkaisevan tärkeää mikrobien hiilikierron, hiilibudjetin ja tulevien ilmastoriskien arvioimiseksi. Koska tällaiset yhdisteet on poistettava kiireellisesti ympäristöstä, on syntynyt useita puhtaisiin teknologioihin keskittyviä ekoteollisuuksia. Vaihtoehtoisesti ekosysteemeihin kertyneiden teollisuusjätteiden/jätekemikaalien hyödyntämistä (eli jätettä vauraudeksi -lähestymistapaa) pidetään yhtenä kiertotalouden ja kestävän kehityksen tavoitteiden pilareista (Close et al., 2012). Siksi näiden potentiaalisten hajoamiskandidaattien metabolisten, entsymaattisten ja geneettisten näkökohtien ymmärtäminen on äärimmäisen tärkeää tällaisten aromaattisten epäpuhtauksien tehokkaan poistamisen ja bioremediaation kannalta.
Monien aromaattisten epäpuhtauksien joukossa kiinnitämme erityistä huomiota pienimolekyylipainoisiin PAH-yhdisteisiin, kuten naftaleeniin ja substituoituihin naftaleeneihin. Nämä yhdisteet ovat tärkeitä komponentteja öljypohjaisissa polttoaineissa, tekstiiliväreissä, kuluttajatuotteissa, torjunta-aineissa (koi- ja hyönteiskarkotteissa), pehmittimissä ja tanniineissa, ja siksi niitä esiintyy laajalti monissa ekosysteemeissä (Preuss et al., 2003). Viimeaikaiset raportit korostavat naftaleenipitoisuuksien kertymistä pohjavesisedimentteihin, pohjaveteen ja maaperään, vadose-vyöhykkeille ja jokiuomiin, mikä viittaa sen biokertymiseen ympäristöön (Duttagupta et al., 2019, 2020). Taulukossa 2 on yhteenveto naftaleenin ja sen johdannaisten fysikaalis-kemiallisista ominaisuuksista, sovelluksista ja terveysvaikutuksista. Verrattuna muihin suurimolekyylipainoisiin PAH-yhdisteisiin, naftaleeni ja sen johdannaiset ovat vähemmän hydrofobisia, vesiliukoisempia ja laajalti levinneitä ekosysteemeissä, joten niitä käytetään usein mallisubstraatteina PAH-yhdisteiden aineenvaihdunnan, genetiikan ja aineenvaihdunnan monimuotoisuuden tutkimiseen. Suuri määrä mikro-organismeja pystyy metaboloimaan naftaleenia ja sen johdannaisia, ja niiden aineenvaihduntareiteistä, entsyymeistä ja säätelyominaisuuksista on saatavilla kattavaa tietoa (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). Lisäksi naftaleeni ja sen johdannaiset on nimetty prototyyppiyhdisteiksi ympäristön saastumisen arvioinnissa niiden suuren runsauden ja biologisen hyötyosuuden vuoksi. Yhdysvaltain ympäristönsuojeluvirasto (EPA) arvioi, että naftaleenin keskimääräiset pitoisuudet ovat 5,19 μg kuutiometrissä tupakansavusta, pääasiassa epätäydellisestä palamisesta, ja 7,8–46 μg sivuvirtasavusta, kun taas altistuminen kreosootille ja naftaleenille on 100–10 000 kertaa suurempi (Preuss et al. 2003). Erityisesti naftaleenilla on havaittu olevan laji-, alue- ja sukupuolikohtaista hengitystietoksisuutta ja karsinogeenisuutta. Eläinkokeiden perusteella Kansainvälinen syöväntutkimuslaitos (IARC) on luokitellut naftaleenin "mahdolliseksi ihmiskarsinogeeniksi" (ryhmä 2B)1. Altistuminen substituoiduille naftaleeneille, pääasiassa hengitysteitse tai parenteraalisesti (suun kautta) annosteltuna, aiheuttaa keuhkokudosvaurioita ja lisää keuhkokasvainten esiintyvyyttä rotilla ja hiirillä (National Toxicology Program 2). Akuutteja vaikutuksia ovat pahoinvointi, oksentelu, vatsakipu, ripuli, päänsärky, sekavuus, runsas hikoilu, kuume, takykardia jne. Toisaalta laajakirjoisen karbamaattihyönteismyrkyn karbaryylin (1-naftyyli-N-metyylikarbamaatti) on raportoitu olevan myrkyllistä vesiselkärangattomille, sammakkoeläimille, mehiläisille ja ihmisille, ja sen on osoitettu estävän asetyylikoliesteraasia aiheuttaen halvaantumista (Smulders et al., 2003; Bulen ja Distel, 2011). Siksi mikrobien hajoamisen, geneettisen säätelyn, entsymaattisten ja solureaktioiden mekanismien ymmärtäminen on ratkaisevan tärkeää bioremediaatiostrategioiden kehittämisessä saastuneissa ympäristöissä.
Taulukko 2. Yksityiskohtaista tietoa naftaleenin ja sen johdannaisten fysikaalis-kemiallisista ominaisuuksista, käyttötarkoituksista, tunnistusmenetelmistä ja niihin liittyvistä sairauksista.
Saastuneissa lokeroissa hydrofobiset ja lipofiiliset aromaattiset epäpuhtaudet voivat aiheuttaa erilaisia ​​soluvaikutuksia ympäristön mikrobiomiin (yhteisöön), kuten muutoksia kalvon juoksevuudessa, kalvon läpäisevyydessä, lipidikaksoiskerroksen turpoamisessa, energiansiirron häiriintymisessä (elektroninsiirtoketju/protonin liikevoima) ja kalvoon liittyvien proteiinien aktiivisuudessa (Sikkema et al., 1995). Lisäksi jotkut liukoiset välituotteet, kuten katekolit ja kinonit, tuottavat reaktiivisia happilajeja (ROS) ja muodostavat adduktioita DNA:n ja proteiinien kanssa (Penning et al., 1999). Tällaisten yhdisteiden runsaus ekosysteemeissä kohdistaa siis valintapainetta mikrobiyhteisöihin, jotta niistä tulisi tehokkaita hajottajia eri fysiologisilla tasoilla, mukaan lukien sisäänotto/kuljetus, solunsisäinen transformaatio, assimilaatio/hyödyntäminen ja osastojen muodostuminen.
Ribosomal Database Project-II:n (RDP-II) haulla paljastui, että naftaleenilla tai sen johdannaisilla kontaminoituneista elatusalustoista tai rikastusviljelmistä eristettiin yhteensä 926 bakteerilajia. Proteobakteeriryhmällä oli eniten edustajia (n = 755), jota seurasivat Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) ja luokittelemattomat bakteerit (8) (kuva 2). γ-proteobakteerien (Pseudomonadales ja Xanthomonadales) edustajat hallitsivat kaikkia gramnegatiivisia ryhmiä, joilla oli korkea G+C-pitoisuus (54 %), kun taas Clostridiales ja Bacillales (30 %) olivat grampositiivisia ryhmiä, joilla oli alhainen G+C-pitoisuus. Pseudomonas-bakteerien (suurin määrä, 338 lajia) on raportoitu kykenevän hajottamaan naftaleenia ja sen metyylijohdannaisia ​​erilaisissa saastuneissa ekosysteemeissä (kivihiiliterva, öljy, raakaöljy, liete, öljyvuodot, jätevesi, orgaaninen jäte ja kaatopaikat) sekä ehjissä ekosysteemeissä (maaperä, joet, sedimentit ja pohjavesi) (kuva 2). Lisäksi joidenkin näiden alueiden rikastustutkimukset ja metagenomianalyysi paljastivat, että viljelemättömillä Legionella- ja Clostridium-lajeilla saattaa olla hajottavaa kykyä, mikä viittaa tarpeeseen viljellä näitä bakteereja uusien reittien ja aineenvaihdunnan monimuotoisuuden tutkimiseksi.
Kuva 2. Bakteerien edustajien taksonominen monimuotoisuus ja ekologinen jakauma naftaleenilla ja naftaleenijohdannaisilla saastuneissa ympäristöissä.
Erilaisista aromaattisia hiilivetyjä hajottavista mikro-organismeista useimmat kykenevät hajottamaan naftaleenia ainoana hiilen ja energian lähteenä. Naftaleenin aineenvaihduntaan liittyvä tapahtumasarja on kuvattu Pseudomonas sp. (kannat: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 ja CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 ja muut kannat (ND6 ja AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis ja Zylstra, 2004; Sota et al., 2006; Aineenvaihdunnan käynnistää monikomponenttinen dioksigenaasi [naftaleenidioksigenaasi (NDO), rengashydroksyloiva dioksigenaasi], joka katalysoi naftaleenin yhden aromaattisen renkaan hapettumista käyttämällä molekyylihappea toisena substraattina, jolloin naftaleeni muuttuu cis-naftaleenidioliksi (kuva 3). Cis-dihydrodioli muuttuu 1,2-dihydroksinaftaleeniksi dehydrogenaasin avulla. A Rengasta pilkkova dioksigenaasi, 1,2-dihydroksinaftaleenidioksigenaasi (12DHNDO), muuntaa 1,2-dihydroksinaftaleenin 2-hydroksikromeeni-2-karboksyylihapoksi. Entsymaattinen cis-trans-isomerointi tuottaa trans-o-hydroksibentsylideenipyruvaattia, jonka hydrataasi-aldolaasi pilkkoo salisyylialdehydiksi ja pyruvaatiksi. Orgaaninen happopyruvaatti oli ensimmäinen naftaleenin hiilirungosta johdettu C3-yhdiste, joka ohjautui keskeiseen hiilireittiin. Lisäksi NAD+-riippuvainen salisyylialdehydidehydrogenaasi muuntaa salisyylialdehydin salisyylihapoksi. Tässä vaiheessa tapahtuvaa aineenvaihduntaa kutsutaan naftaleenin hajoamisen "ylemmäksi reitiksi". Tämä reitti on hyvin yleinen useimmissa naftaleenia hajottavissa bakteereissa. On kuitenkin olemassa muutamia poikkeuksia; esimerkiksi termofiilisessä Bacillus hamburgii 2:ssa naftaleenin hajoamisen käynnistää naftaleeni-2,3-dioksigenaasi, jolloin muodostuu 2,3-dihydroksinaftaleenia (Annweiler et al., 2000).
Kuva 3. Naftaleenin, metyylinaftaleenin, naftoehapon ja karbaryylin hajoamisreitit. Ympyröidyt numerot edustavat entsyymejä, jotka vastaavat naftaleenin ja sen johdannaisten peräkkäisestä muuntamisesta seuraaviksi tuotteiksi. 1 — naftaleenidioksigenaasi (NDO); 2, cis-dihydrodiolidehydrogenaasi; 3, 1,2-dihydroksinaftaleenidioksigenaasi; 4, 2-hydroksikromeeni-2-karboksyylihappoisomeraasi; 5, trans-O-hydroksibentsylideenipyruvaattihydrataasi-aldolaasi; 6, salisyylialdehydidehydrogenaasi; 7, salisylaatti-1-hydroksylaasi; 8, katekoli-2,3-dioksigenaasi (C23DO); 9, 2-hydroksimukonaattisemialdehydidehydrogenaasi; 10, 2-oksopent-4-enoaattihydrataasi; 11, 4-hydroksi-2-oksopentanoaattialdolaasi; 12, asetaldehydidehydrogenaasi; 13, katekoli-1,2-dioksigenaasi (C12DO); 14, mukonaattisykloisomeraasi; 15, mukonolaktoni-delta-isomeraasi; 16, β-ketoadipatenollaktonihydrolaasi; 17, β-ketoadipaattisukkinyyli-CoA-transferaasi; 18, β-ketoadipaatti-CoA-tiolaasi; 19, sukkinyyli-CoA: asetyyli-CoA-sukkinyylitransferaasi; 20, salisylaatti-5-hydroksylaasi; 21 – gentisaatti-1,2-dioksigenaasi (GDO); 22, maleyylipyruvaatti-isomeraasi; 23, fumaryylipyruvaattihydrolaasi; 24, metyylinaftaleenihydroksylaasi (NDO); 25, hydroksimetyylinaftaleenidehydrogenaasi; 26, naftaldehydidhydrogenaasi; 27, 3-formyylisalisyylihappooksidaasi; 28, hydroksi-isoftalaattidekarboksylaasi; 29, karbaryylihydrolaasi (CH); 30, 1-naftoli-2-hydroksylaasi.
Organismista ja sen geneettisestä rakenteesta riippuen syntyvä salisyylihappo metaboloituu edelleen joko katekolireitin kautta salisylaatti-1-hydroksylaasin (S1H) avulla tai gentisaattireitin kautta salisylaatti-5-hydroksylaasin (S5H) avulla (kuva 3). Koska salisyylihappo on naftaleenin aineenvaihdunnan tärkein välituote (ylempi reitti), vaiheita salisyylihaposta TCA-välituotteeseen kutsutaan usein alemmaksi reitiksi, ja geenit on järjestetty yhdeksi operoniksi. On yleistä nähdä, että ylemmän reitin operonin (nah) ja alemman reitin operonin (sal) geenejä säätelevät yhteiset säätelytekijät; esimerkiksi NahR ja salisyylihappo toimivat indusoijina, jolloin molemmat operonit metaboloivat naftaleenin kokonaan (Phale et al., 2019, 2020).
Lisäksi katekoli pilkkoutuu syklisesti 2-hydroksimukonaattisemialdehydiksi meta-reittiä pitkin katekoli-2,3-dioksigenaasin (C23DO) avulla (Yen et al., 1988) ja hydrolysoituu edelleen 2-hydroksimukonaattisemialdehydihydrolaasin avulla muodostaen 2-hydroksipent-2,4-dieenihappoa. 2-hydroksipent-2,4-dienoaatti muuttuu sitten pyruvaatiksi ja asetaldehydiksi hydrataasin (2-oksopent-4-enoaattihydrataasi) ja aldolaasin (4-hydroksi-2-oksopentanoaattialdolaasi) avulla ja siirtyy sitten keskeiseen hiilireitin kautta (kuva 3). Vaihtoehtoisesti katekoli pilkkoutuu syklisesti cis,cis-mukonaatiksi orto-reittiä pitkin katekoli-1,2-oksigenaasin (C12DO) avulla. Mukonaattisykloisomeraasi, mukonolaktoni-isomeraasi ja β-ketoadipaatti-nollaktonihydrolaasi muuttavat cis,cis-mukonaatin 3-oksoadipaatiksi, joka siirtyy keskeiseen hiilireittiin sukkinyyli-CoA:n ja asetyyli-CoA:n kautta (Nozaki et al., 1968) (kuva 3).
Gentisaatti (2,5-dihydroksibentsoaatti) -reitillä aromaattinen rengas pilkkoutuu gentisaatti-1,2-dioksigenaasin (GDO) avulla maleyylipyruvaatiksi. Tämä tuote voidaan hydrolysoida suoraan pyruvaatiksi ja malaatiksi tai se voidaan isomeroida fumaryylipyruvaatiksi, joka voidaan sitten hydrolysoida pyruvaatiksi ja fumaraatiksi (Larkin ja Day, 1986). Vaihtoehtoisen reitin valintaa on havaittu sekä gramnegatiivisilla että grampositiivisilla bakteereilla biokemiallisella ja geneettisellä tasolla (Morawski et al., 1997; Whyte et al., 1997). Gramnegatiiviset bakteerit (Pseudomonas) käyttävät mieluummin salisyylihappoa, joka indusoi naftaleenin aineenvaihduntaa, dekarboksyloimalla sen katekoliksi salisylaatti-1-hydroksylaasin avulla (Gibson ja Subramanian, 1984). Toisaalta grampositiivisissa bakteereissa (Rhodococcus) salisylaatti-5-hydroksylaasi muuntaa salisyylihapon gentisiinihapoksi, kun taas salisyylihapolla ei ole induktiivista vaikutusta naftaleenigeenien transkriptioon (Grund et al., 1992) (kuva 3).
On raportoitu, että lajit, kuten Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, Pseudomonas ja Mycobacterium, voivat hajottaa monometyylinaftaleenia tai dimetyylinaftaleenia (Dean-Raymond ja Bartha, 1975; Cane ja Williams, 1982; Mahajan et al., 1994; Dutta et al., 1998; Hedlund et al., 1999). Näistä Pseudomonas sp. CSV86:n 1-metyylinaftaleenin ja 2-metyylinaftaleenin hajoamisreittiä on tutkittu selvästi biokemiallisella ja entsymaattisella tasolla (Mahajan et al., 1994). 1-metyylinaftaleeni metaboloituu kahta reittiä. Ensin aromaattinen rengas hydroksyloituu (metyylinaftaleenin substituoimaton rengas), jolloin muodostuu cis-1,2-dihydroksi-1,2-dihydro-8-metyylinaftaleenia, joka hapetetaan edelleen metyylisalisylaatiksi ja metyylikatekoliksi ja siirtyy sitten renkaan pilkkomisen jälkeen keskeiseen hiilireitin yhteyteen (kuva 3). Tätä reittiä kutsutaan "hiilenlähdereitinä". Toisessa "detoksifikaatioreitissä" metyyliryhmä voidaan hydroksyloida NDO:lla, jolloin muodostuu 1-hydroksimetyylinaftaleenia, joka hapetetaan edelleen 1-naftoehapoksi ja erittyy viljelyalustaan ​​umpikujatuotteena. Tutkimukset ovat osoittaneet, että CSV86-kanta ei pysty kasvamaan 1- ja 2-naftoehapolla ainoana hiili- ja energialähteenään, mikä vahvistaa sen detoksifikaatioreitin (Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). 2-metyylinaftaleenissa metyyliryhmä hydroksyloituu hydroksylaasin avulla, jolloin muodostuu 2-hydroksimetyylinaftaleenia. Lisäksi naftaleenirenkaan substituoimaton rengas hydroksyloituu muodostaen dihydrodiolin, joka hapettuu 4-hydroksimetyylikatekoliksi entsyymikatalysoitujen reaktioiden sarjassa ja siirtyy keskeiseen hiilireitin kautta metarenkaan pilkkoutumisreitin kautta. Samoin S. paucimobilis 2322:n on raportoitu käyttävän NDO:ta 2-metyylinaftaleenin hydroksylointiin, joka hapettuu edelleen metyylisalisylaatiksi ja metyylikatekoliksi (Dutta et al., 1998).
Naftoehapot (substituoidut/substituoimattomat) ovat vieroitus-/biotransformaatiotuotteita, joita muodostuu metylinaftaleenin, fenantreenin ja antraseenin hajoamisen aikana ja vapautuu käytettyyn viljelyalustaan. On raportoitu, että maaperästä eristetty Stenotrophomonas maltophilia CSV89 pystyy metaboloimaan 1-naftoehappoa hiilenlähteenä (Phale et al., 1995). Aineenvaihdunta alkaa aromaattisen renkaan dihydroksylaatiolla, jolloin muodostuu 1,2-dihydroksi-8-karboksinaftaleenia. Tuloksena oleva dioli hapettuu katekoliksi 2-hydroksi-3-karboksibentsylideenipyruvaatin, 3-formyylisalisyylihapon, 2-hydroksi-isoftaalihapon ja salisyylihapon kautta ja siirtyy keskeiseen hiilireittiin metarenkaan pilkkoutumisreitin kautta (kuva 3).
Karbaryyli on naftyylikarbamaattiryhmään kuuluva torjunta-aine. Intian vihreän vallankumouksen jälkeen 1970-luvulla kemiallisten lannoitteiden ja torjunta-aineiden käyttö on johtanut polysyklisten aromaattisten hiilivetyjen (PAH) päästöjen lisääntymiseen maatalouden hajakuormituslähteistä (Pingali, 2012; Duttagupta et al., 2020). Arviolta 55 % (85 722 000 hehtaaria) Intian kokonaisviljelymaasta käsitellään kemiallisilla torjunta-aineilla. Viimeisten viiden vuoden aikana (2015–2020) Intian maataloussektori on käyttänyt keskimäärin 55 000–60 000 tonnia torjunta-aineita vuosittain (Osuuskuntien ja maanviljelijöiden hyvinvointiosasto, Maatalousministeriö, Intian hallitus, elokuu 2020). Pohjois- ja Keski-Gangesin tasangoilla (osavaltiot, joissa on suurin väestö ja asukastiheys) torjunta-aineiden käyttö viljelykasveilla on laajalle levinnyttä, ja hyönteismyrkyt ovat vallitsevia. Karbaryyli (1-naftyyli-N-metyylikarbamaatti) on laajakirjoinen, kohtalaisen tai erittäin myrkyllinen karbamaattihyönteismyrkky, jota käytetään Intian maataloudessa keskimäärin 100–110 tonnia. Sitä myydään yleisesti kauppanimellä Sevin, ja sitä käytetään hyönteisten (kirvojen, tulimuurahaisten, kirppujen, punkkien, hämähäkkien ja monien muiden ulkotuholaisten) torjuntaan, jotka vaikuttavat erilaisiin viljelykasveihin (maissi, soijapapu, puuvilla, hedelmät ja vihannekset). Joitakin mikro-organismeja, kuten Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus ja Arthrobacter, voidaan käyttää myös muiden tuholaisten torjuntaan. On raportoitu, että RC100 voi hajottaa karbaryyliä (Larkin ja Day, 1986; Chapalamadugu ja Chaudhry, 1991; Hayatsu ym., 1999; Swetha ja Phale, 2005; Trivedi ym., 2017). Karbaryylin hajoamisreittiä on tutkittu laajasti biokemiallisella, entsymaattisella ja geneettisellä tasolla Pseudomonas sp. -kantojen C4, C5 ja C6 maaperäisolaateissa (Swetha ja Phale, 2005; Trivedi ym., 2016) (kuva 3). Metabolian reitti alkaa esterisidoksen hydrolyysillä karbaryylihydrolaasin (CH) avulla, jolloin muodostuu 1-naftolia, metyyliamiinia ja hiilidioksidia. 1-naftoli muuttuu sitten 1,2-dihydroksinaftaleeniksi 1-naftolihydroksylaasin (1-NH2) avulla, joka metaboloituu edelleen keskushiilireitin kautta salisylaatin ja gentisaatin kautta. Joidenkin karbaryyliä hajottavien bakteerien on raportoitu metaboloivan sen salisyylihapoksi katekoli-ortorenkaan pilkkomisen kautta (Larkin ja Day, 1986; Chapalamadugu ja Chaudhry, 1991). Merkillepantavaa on, että naftaleenia hajottavat bakteerit metaboloivat salisyylihappoa pääasiassa katekolin kautta, kun taas karbaryyliä hajottavat bakteerit metaboloivat salisyylihappoa mieluummin gentisaattireitin kautta.
Naftaleenisulfonihappo-/disulfonihappo- ja naftyyliamiinisulfonihappojohdannaisia ​​voidaan käyttää välituotteina atsovärien, kostutusaineiden, dispergointiaineiden jne. valmistuksessa. Vaikka näiden yhdisteiden myrkyllisyys ihmisille on vähäistä, sytotoksisuusarvioinnit ovat osoittaneet, että ne ovat tappavia kaloille, vesikirpuille ja leville (Greim et al., 1994). Pseudomonas-suvun edustajien (kannat A3, C22) on raportoitu käynnistävän metabolian sulfonihapporyhmän sisältävän aromaattisen renkaan kaksoishydroksylaatiolla dihydrodiolin muodostamiseksi, joka muuttuu edelleen 1,2-dihydroksinaftaleeniksi sulfiittiryhmän spontaanin pilkkoutumisen kautta (Brilon et al., 1981). Tuloksena oleva 1,2-dihydroksinaftaleeni kataboloituu klassisen naftaleenireitin, eli katekoli- tai gentisaattireitin, kautta (kuva 4). On osoitettu, että aminonaftaleenisulfonihappo ja hydroksinaftaleenisulfonihappo voidaan hajottaa kokonaan sekabakteerikonsortioiden avulla, joilla on toisiaan täydentävät kataboliset reitit (Nortemann et al., 1986). On osoitettu, että yksi konsortion jäsen poistaa rikin aminonaftaleenisulfonihaposta tai hydroksinaftaleenisulfonihaposta 1,2-dioksygenaatiolla, kun taas aminosalisylaatti tai hydroksysalisylaatti vapautuu viljelyalustaan ​​umpikujametaboliittina ja muut konsortion jäsenet ottavat sen myöhemmin vastaan. Naftaleenidisulfonihappo on suhteellisen polaarinen, mutta huonosti biohajoava, ja siksi se voi metaboloitua eri reittejä pitkin. Ensimmäinen rikinpoisto tapahtuu aromaattisen renkaan ja sulfonihapporyhmän regioselektiivisen dihydroksylaation aikana; toinen rikinpoisto tapahtuu 5-sulfosalisyylihapon hydroksylaation aikana salisyylihappo-5-hydroksylaasin avulla, jolloin muodostuu gentisiinihappoa, joka siirtyy keskeiseen hiilireitin kautta (Brilon et al., 1981) (kuva 4). Naftaleenin hajottamisesta vastaavat entsyymit vastaavat myös naftaleenisulfonaatin metaboliasta (Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006).
Kuva 4. Naftaleenisulfonaatin hajoamisen aineenvaihduntareitit. Ympyröissä olevat numerot edustavat naftyylisulfonaatin aineenvaihdunnasta vastaavia entsyymejä, jotka ovat samanlaisia/identtisiä kuvassa 3 kuvattujen entsyymien kanssa.
Pienimolekyylipainoiset PAH-yhdisteet (LMW-PAH-yhdisteet) ovat pelkistyviä, hydrofobisia ja huonosti liukenevia, eivätkä siksi ole alttiita luonnolliselle hajoamiselle/hajoamiselle. Aerobiset mikro-organismit pystyvät kuitenkin hapettamaan ne absorboimalla molekyylihappea (O2). Nämä entsyymit kuuluvat pääasiassa oksidoreduktaasien luokkaan ja voivat suorittaa erilaisia ​​reaktioita, kuten aromaattisen renkaan hydroksylaation (mono- tai dihydroksylaation), dehydrauksen ja aromaattisen renkaan pilkkomisen. Näistä reaktioista saadut tuotteet ovat korkeammassa hapetusasteessa ja metaboloituvat helpommin keskeisen hiilireitin kautta (Phale et al., 2020). Hajoamisreitin entsyymien on raportoitu olevan indusoituvia. Näiden entsyymien aktiivisuus on hyvin alhainen tai merkityksetön, kun soluja kasvatetaan yksinkertaisilla hiililähteillä, kuten glukoosilla tai orgaanisilla hapoilla. Taulukossa 3 on yhteenveto eri entsyymeistä (oksigenaasit, hydrolaasit, dehydrogenaasit, oksidaasit jne.), jotka osallistuvat naftaleenin ja sen johdannaisten metaboliaan.
Taulukko 3. Naftaleenin ja sen johdannaisten hajottamisesta vastaavien entsyymien biokemialliset ominaisuudet.
Radioisotooppitutkimukset (18O2) ovat osoittaneet, että molekyyli-O2:n liittyminen aromaattisiin renkaisiin oksygenaasien avulla on tärkein vaihe yhdisteen lisäbiohajoamisen aktivoinnissa (Hayaishi et al., 1955; Mason et al., 1955). Yhden happiatomin (O) liittyminen molekyylihapesta (O2) substraattiin käynnistyy joko endogeenisten tai eksogeenisten mono-oksigenaasien (joita kutsutaan myös hydroksylaaseiksi) avulla. Toinen happiatomi pelkistyy vedeksi. Eksogeeniset mono-oksigenaasit pelkistävät flaviinin NADH:lla tai NADPH:lla, kun taas endomono-oksigenaaseissa substraatti pelkistää flaviinin. Hydroksylaation sijainti johtaa monimuotoisuuteen tuotteiden muodostumisessa. Esimerkiksi salisylaatti-1-hydroksylaasi hydroksyloi salisyylihappoa C1-asemassa muodostaen katekolia. Toisaalta monikomponenttinen salisylaatti-5-hydroksylaasi (joka sisältää reduktaasin, ferredoksiinin ja oksigenaasin alayksiköt) hydroksyloi salisyylihappoa C5-asemassa muodostaen gentisiinihappoa (Yamamoto et al., 1965).
Dioksigenaasit liittävät kaksi O2-atomia substraattiin. Muodostuvista tuotteista riippuen ne jaetaan rengashydroksyloiviin dioksigenaaseihin ja renkaan pilkkoviin dioksigenaaseihin. Rengashydroksyloivat dioksigenaasit muuntavat aromaattisia substraatteja cis-dihydrodioleiksi (esim. naftaleeni) ja ovat laajalle levinneitä bakteerien keskuudessa. Tähän mennessä on osoitettu, että rengashydroksyloivia dioksigenaaseja sisältävät organismit kykenevät kasvamaan erilaisilla aromaattisilla hiilen lähteillä, ja nämä entsyymit luokitellaan NDO:ksi (naftaleeni), tolueenidioksigenaasiksi (TDO, tolueeni) ja bifenyylidioksigenaasiksi (BPDO, bifenyyli). Sekä NDO että BPDO voivat katalysoida erilaisten polysyklisten aromaattisten hiilivetyjen (tolueeni, nitrotolueeni, ksyleeni, etyylibentseeni, naftaleeni, bifenyyli, fluoreeni, indoli, metyylinaftaleeni, naftaleenisulfonaatti, fenantreeni, antraseeni, asetofenoni jne.) kaksoishapettumista ja sivuketjujen hydroksylaatiota (Boyd ja Sheldrake, 1998; Phale et al., 2020). NDO on monikomponenttijärjestelmä, joka koostuu oksidoreduktaasista, ferredoksiinista ja aktiivisen kohdan sisältävästä oksygenaasikomponentista (Gibson ja Subramanian, 1984; Resnick et al., 1996). NDO:n katalyyttinen yksikkö koostuu suuresta α-alayksiköstä ja pienestä β-alayksiköstä, jotka ovat järjestäytyneet α3β3-konfiguraatioon. NDO kuuluu suureen oksygenaasien perheeseen, ja sen α-alayksikkö sisältää Rieske-kohdan [2Fe-2S] ja mononukleaarisen ei-hemiraudan, joka määrittää NDO:n substraattispesifisyyden (Parales et al., 1998). Tyypillisesti yhdessä katalyyttisessä syklissä kaksi pyridiininukleotidin pelkistyksestä peräisin olevaa elektronia siirtyy aktiivisen kohdan Fe(II)-ioniin reduktaasin, ferredoksiinin ja Rieske-kohdan kautta. Pelkistävät ekvivalentit aktivoivat molekyylihappea, mikä on edellytys substraattidihydroksylaatiolle (Ferraro et al., 2005). Tähän mennessä vain muutamia NDO:ita on puhdistettu ja karakterisoitu yksityiskohtaisesti eri kannoista, ja naftaleenin hajoamiseen liittyvien reittien geneettistä kontrollia on tutkittu yksityiskohtaisesti (Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). Rengasta pilkkovat dioksigenaasit (endo- tai orto-renkaan pilkkovat entsyymit ja eksodioli- tai meta-renkaan pilkkovat entsyymit) vaikuttavat hydroksyloituihin aromaattisiin yhdisteisiin. Esimerkiksi orto-renkaan pilkkova dioksigenaasi on katekoli-1,2-dioksigenaasi, kun taas meta-renkaan pilkkova dioksigenaasi on katekoli-2,3-dioksigenaasi (Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968). Erilaisten oksygenaasien lisäksi on olemassa myös useita dehydrogenaaseja, jotka vastaavat aromaattisten dihydrodiolien, alkoholien ja aldehydien dehydrogenaatiosta ja käyttävät NAD+/NADP+-entsyymejä elektronin vastaanottajina, jotka ovat joitakin tärkeitä aineenvaihduntaan osallistuvia entsyymejä (Gibson ja Subramanian, 1984; Shaw ja Harayama, 1990; Fahle et al., 2020).
Entsyymit, kuten hydrolaasit (esteraasit, amidaasit), ovat toinen tärkeä entsyymiluokka, jotka käyttävät vettä kovalenttisten sidosten katkaisemiseen ja joilla on laaja substraattispesifisyys. Karbaryylihydrolaasia ja muita hydrolaaseja pidetään gramnegatiivisten bakteerien periplasman (transmembraanin) komponentteina (Kamini et al., 2018). Karbaryylillä on sekä amidi- että esterisidos; siksi se voidaan hydrolysoida joko esteraasilla tai amidaasilla 1-naftoliksi. Karbaryylin Rhizobium rhizobium -kannassa AC10023 ja Arthrobacter-kannassa RC100 on raportoitu toimivan esteraasina ja amidaasina. Karbaryylin Arthrobacter-kannassa RC100 toimii myös amidaasina. RC100:n on osoitettu hydrolysoivan neljää N-metyylikarbamaattiluokan hyönteismyrkkyä, kuten karbaryyliä, metomyyliä, mefenamiinihappoa ja XMC:tä (Hayaatsu et al., 2001). On raportoitu, että CH Pseudomonas sp. C5pp voi vaikuttaa karbaryyliin (100 % aktiivisuus) ja 1-naftyyliasetaattiin (36 % aktiivisuus), mutta ei 1-naftyyliasetamidiin, mikä osoittaa sen olevan esteraasi (Trivedi et al., 2016).
Biokemialliset tutkimukset, entsyymien säätelymallit ja geneettinen analyysi ovat osoittaneet, että naftaleenin hajoamisgeenit koostuvat kahdesta indusoituvasta säätelyyksiköstä eli "operonista": nah ("ylävirran reitti", joka muuntaa naftaleenin salisyylihapoksi) ja sal ("alavirran reitti", joka muuntaa salisyylihapon keskeiseksi hiilireitiksi katekolin kautta). Salisyylihappo ja sen analogit voivat toimia indusoijina (Shamsuzzaman ja Barnsley, 1974). Glukoosin tai orgaanisten happojen läsnä ollessa operoni repressoituu. Kuva 5 esittää naftaleenin hajoamisen täydellisen geneettisen organisaation (operonimuodossa). Useita nimettyjä nah-geenin variantteja/muotoja (ndo/pah/dox) on kuvattu, ja niillä on havaittu olevan korkea sekvenssihomologia (90 %) kaikkien Pseudomonas-lajien välillä (Abbasian et al., 2016). Naftaleenin ylävirran reitin geenit olivat yleensä järjestetty konsensusjärjestykseen, kuten kuvassa 5A on esitetty. Myös toisen geenin, nahQ:n, on raportoitu osallistuvan naftaleenin aineenvaihduntaan, ja se sijaitsi yleensä nahC:n ja nahE:n välissä, mutta sen varsinainen tehtävä on vielä selvittämättä. Samoin nahY-geeni, joka vastaa naftaleeniherkästä kemotaksista, löydettiin joidenkin jäsenten nah-operonin distaalisesta päästä. Ralstonia sp.:ssä glutationi-S-transferaasia (gsh) koodaavan U2-geenin havaittiin sijaitsevan nahAa:n ja nahAb:n välissä, mutta se ei vaikuttanut naftaleenin käyttöominaisuuksiin (Zylstra et al., 1997).
Kuva 5. Naftaleenin hajoamisen aikana havaittu geneettinen organisaatio ja monimuotoisuus bakteerilajeilla; (A) Ylempi naftaleenireitti, naftaleenin metabolia salisyylihapoksi; (B) Alempi naftaleenireitti, salisyylihappo katekolin kautta keskeiseen hiilireittiin; (C) salisyylihappo gentisaatin kautta keskeiseen hiilireittiin.
”Alempi reitti” (sal-operoni) koostuu tyypillisesti nahGTHINLMOKJ:sta ja muuntaa salisylaatin pyruvaatiksi ja asetaldehydiksi katekoli-metaring-pilkkoutumisreitin kautta. NahG-geenin (joka koodaa salisylaattihydroksylaasia) havaittiin olevan konservoitunut operonin proksimaalisessa päässä (kuva 5B). Verrattuna muihin naftaleenia hajottaviin kantoihin, P. putida CSV86:ssa nah- ja sal-operonit ovat peräkkäin ja hyvin läheistä sukua toisilleen (noin 7,5 kb). Joissakin gramnegatiivisissa bakteereissa, kuten Ralstonia sp. U2:ssa, Polaromonas naphthalenivorans CJ2:ssa ja P. putida AK5:ssä, naftaleeni metaboloituu keskeisenä hiilimetaboliittina gentisaattireitin kautta (sgp/nag-operonin muodossa). Geenikasetti on tyypillisesti muodossa nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, jossa nagR (joka koodaa LysR-tyyppistä säätelijää) sijaitsee yläpäässä (kuva 5C).
Karbaryyli siirtyy keskushiilikiertoon 1-naftolin, 1,2-dihydroksinaftaleenin, salisyylihapon ja gentisiinihapon metabolian kautta (kuva 3). Geneettisten ja metabolisten tutkimusten perusteella on ehdotettu tämän reitin jakamista "ylävirtaan" (karbaryylin muuntuminen salisyylihapoksi), "keskivirtaan" (salisyylihapon muuntuminen gentisiinihapoksi) ja "alavirtaan" (gentisiinihapon muuntuminen keskushiilikiertoon kuuluviksi välituotteiksi) (Singh et al., 2013). C5pp:n (superkontig A, 76,3 kb) genomianalyysi paljasti, että mcbACBDEF-geeni osallistuu karbaryylin muuntumiseen salisyylihapoksi, jota seuraa mcbIJKL salisyylihapon muuntumisessa gentisiinihapoksi ja mcbOQP gentisiinihapon muuntumisessa keskushiilikiertoon kuuluviksi välituotteiksi (fumaraatti ja pyruvaatti, Trivedi et al., 2016) (kuva 6).
On raportoitu, että aromaattisten hiilivetyjen (mukaan lukien naftaleeni ja salisyylihappo) hajottamiseen osallistuvia entsyymejä voidaan indusoida vastaavilla yhdisteillä ja estää yksinkertaisilla hiilen lähteillä, kuten glukoosilla tai orgaanisilla hapoilla (Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020). Naftaleenin ja sen johdannaisten erilaisista metaboliareiteistä naftaleenin ja karbaryylin säätelyominaisuuksia on tutkittu jossain määrin. Naftaleenin tapauksessa sekä ylävirran että alavirran reittien geenejä säätelee NahR, LysR-tyyppinen trans-aktiivinen positiivinen säätelijä. Sitä tarvitaan nah-geenin induktiolle salisyylihapolla ja sen myöhemmälle korkeatasoiselle ilmentymiselle (Yen ja Gunsalus, 1982). Lisäksi tutkimukset ovat osoittaneet, että integroiva isäntätekijä (IHF) ja XylR (sigma 54:stä riippuva transkriptionaalinen säätelijä) ovat myös kriittisiä geenien transkriptionaaliselle aktivaatiolle naftaleenin aineenvaihdunnassa (Ramos et al., 1997). Tutkimukset ovat osoittaneet, että katekoli-meta-renkaan avautumisreitin entsyymit, nimittäin katekoli-2,3-dioksigenaasi, indusoituvat naftaleenin ja/tai salisyylihapon läsnä ollessa (Basu et al., 2006). Tutkimukset ovat osoittaneet, että katekoli-orto-renkaan avautumisreitin entsyymit, nimittäin katekoli-1,2-dioksigenaasi, indusoituvat bentsoehapon ja cis,cis-mukonaatin läsnä ollessa (Parsek et al., 1994; Tover et al., 2001).
C5pp-kannassa viisi geeniä, mcbG, mcbH, mcbN, mcbR ja mcbS, koodaavat LysR/TetR-transkriptionaalisten säätelijöiden perheeseen kuuluvia säätelijöitä, jotka vastaavat karbaryylin hajoamisen kontrolloinnista. Homologisen geenin mcbG havaittiin olevan läheisimmin sukua LysR-tyyppiselle säätelijälle PhnS (58 % aminohappoidentiteetti), joka osallistuu fenantreenin aineenvaihduntaan Burkholderia RP00725:ssä (Trivedi et al., 2016). McbH-geenin havaittiin osallistuvan välireittiin (salisyylihapon muuntuminen gentisiinihapoksi) ja kuuluvan LysR-tyyppiseen transkriptionaaliseen säätelijään NagR/DntR/NahR Pseudomonas- ja Burkholderia-lajeissa. Tämän perheen jäsenten on raportoitu tunnistavan salisyylihapon spesifiseksi efektorimolekyyliksi hajoamisgeenien induktiolle. Toisaalta alavirran reitillä (gentisaatti-keskushiilireitin metaboliitit) tunnistettiin kolme geeniä, mcbN, mcbR ja mcbS, jotka kuuluvat LysR- ja TetR-tyyppisiin transkriptionaalisiin säätelijöihin.
Prokaryooteissa horisontaaliset geeninsiirtoprosessit (hankkiminen, vaihto tai siirto) plasmidien, transposonien, profagien, genomisten saarekkeiden ja integroivien konjugatiivisten elementtien (ICE) kautta ovat bakteerien genomien plastisuuden tärkeimmät syyt, jotka johtavat tiettyjen toimintojen/ominaisuuksien lisääntymiseen tai menetykseen. Se mahdollistaa bakteerien nopean sopeutumisen erilaisiin ympäristöolosuhteisiin, mikä tarjoaa isännälle potentiaalisia adaptiivisia metabolisia etuja, kuten aromaattisten yhdisteiden hajotuksen. Aineenvaihdunnalliset muutokset saavutetaan usein hienosäätämällä hajottajaoperoneja, niiden säätelymekanismeja ja entsyymien spesifisyyksiä, mikä helpottaa laajemman valikoiman aromaattisten yhdisteiden hajotusta (Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). Naftaleenin hajottamiseen tarkoitettujen geenikasettien on havaittu sijaitsevan useissa liikkuvissa elementeissä, kuten plasmideissa (konjugatiivisissa ja ei-konjugatiivisissa), transposoneissa, genomeissa, ICE-elementeissä ja eri bakteerilajien yhdistelmissä (kuva 5). Pseudomonas G7:ssä plasmidin NAH7 nah- ja sal-operonit transkriboidaan samassa orientaatiossa ja ne ovat osa viallista transposonia, joka vaatii mobilisoitumiseen transposaasi Tn4653:n (Sota et al., 2006). Pseudomonas-kannassa NCIB9816-4 geeni löydettiin konjugatiivisesta plasmidista pDTG1 kahtena operonina (noin 15 kb:n etäisyydellä toisistaan), jotka transkriboitiin vastakkaisiin suuntiin (Dennis ja Zylstra, 2004). Pseudomonas putida -kannassa AK5 ei-konjugatiivinen plasmidi pAK5 koodaa entsyymiä, joka vastaa naftaleenin hajoamisesta gentisaattireitin kautta (Izmalkova et al., 2013). Pseudomonas-kannassa PMD-1 nah-operoni sijaitsee kromosomissa, kun taas sal-operoni sijaitsee konjugatiivisessa plasmidissa pMWD-1 (Zuniga et al., 1981). Pseudomonas stutzeri AN10:ssä kaikki naftaleenin hajotukseen liittyvät geenit (nah- ja sal-operonit) sijaitsevat kuitenkin kromosomissa ja ne oletettavasti rekrytoidaan transpositio-, rekombinaatio- ja uudelleenjärjestymistapahtumien kautta (Bosch et al., 2000). Pseudomonas sp. CSV86:ssa nah- ja sal-operonit sijaitsevat genomissa ICE-muodossa (ICECSV86). Rakennetta suojaa tRNAGly, jota seuraavat suorat toistot, jotka osoittavat rekombinaatio-/kiinnittymiskohtia (attR ja attL), ja faagin kaltainen integraasi, joka sijaitsee tRNAGly:n molemmissa päissä, joten se on rakenteellisesti samanlainen kuin ICEclc-elementti (ICEclcB13 Pseudomonas knackmusiissa kloorikatekolin hajotuksen osalta). On raportoitu, että ICE:n geenejä voidaan siirtää konjugoimalla erittäin alhaisella siirtotiheydellä (10-8), jolloin hajoamisominaisuudet siirtyvät vastaanottajalle (Basu ja Phale, 2008; Phale et al., 2019).
Suurin osa karbaryylin hajoamisesta vastaavista geeneistä sijaitsee plasmideissa. Arthrobacter sp. RC100 sisältää kolme plasmidia (pRC1, pRC2 ja pRC300), joista kaksi konjugatiivista plasmidia, pRC1 ja pRC2, koodaavat entsyymejä, jotka muuntavat karbaryylin gentisaatiksi. Toisaalta entsyymit, jotka osallistuvat gentisaatin muuntamiseen keskeisiksi hiilimetaboliiteiksi, sijaitsevat kromosomissa (Hayaatsu et al., 1999). Rhizobium-suvun bakteerit. Kanta AC100, jota käytetään karbaryylin muuntamiseen 1-naftoliksi, sisältävät plasmidin pAC200, jossa on cehA-geeni, joka koodaa CH:ta osana Tnceh-transposonia, jota ympäröivät insertion elementin kaltaiset sekvenssit (istA ja istB) (Hashimoto et al., 2002). Sphingomonas-kannassa CF06 karbaryylihappoa hajottavan geenin uskotaan olevan läsnä viidessä plasmidissa: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 ja pCF05. Näiden plasmidien DNA-homologia on korkea, mikä viittaa geeniduplikaatiotapahtuman olemassaoloon (Feng et al., 1997). Kahdesta Pseudomonas-lajista koostuvassa karbaryylihappoa hajottavassa symbiootissa kanta 50581 sisältää konjugatiivisen plasmidin pCD1 (50 kb), joka koodaa mcd-karbaryylihydrolaasigeeniä, kun taas kannan 50552 konjugatiivinen plasmidi koodaa 1-naftolia hajottavaa entsyymiä (Chapalamadugu ja Chaudhry, 1991). Achromobacter-kannassa WM111 mcd-furadaanihydrolaasigeeni sijaitsee 100 kb:n plasmidissa (pPDL11). Tämän geenin on osoitettu esiintyvän eri plasmideissa (100, 105, 115 tai 124 kb) eri bakteereissa eri maantieteellisillä alueilla (Parekh et al., 1995). Pseudomonas sp. C5pp:ssä kaikki karbaryyliä hajottavat geenit sijaitsevat 76,3 kb:n sekvenssin kattavassa genomissa (Trivedi et al., 2016). Genomianalyysi (6,15 Mb) paljasti 42 MGE:n ja 36 GEI:n läsnäolon, joista 17 MGE:tä sijaitsi superkontigissa A (76,3 kb) keskimääräisen epäsymmetrisen G+C-pitoisuuden ollessa (54–60 mol-%), mikä viittaa mahdollisiin horisontaalisiin geeninsiirtotapahtumiin (Trivedi et al., 2016). P. putida XWY-1:llä on samanlainen karbaryyliä hajottavien geenien järjestys, mutta nämä geenit sijaitsevat plasmidissa (Zhu et al., 2019).
Biokemiallisen ja genomisen tason metabolisen tehokkuuden lisäksi mikro-organismeilla on myös muita ominaisuuksia tai vasteita, kuten kemotaksia, solun pinnan modifiointiominaisuudet, lokeroituminen, preferentiaalinen käyttö, biosurfaktanttien tuotanto jne., jotka auttavat niitä metaboloimaan aromaattisia epäpuhtauksia tehokkaammin saastuneissa ympäristöissä (kuva 7).
Kuva 7. Ihanteellisten aromaattisia hiilivetyjä hajottavien bakteerien erilaiset soluvastestrategiat vieraiden epäpuhtauksien tehokkaaseen biohajoamiseen.
Kemotaktisia vasteita pidetään tekijöinä, jotka edistävät orgaanisten epäpuhtauksien hajoamista heterogeenisesti saastuneissa ekosysteemeissä. (2002) osoitti, että Pseudomonas sp. G7:n kemotaksis naftaleenille lisäsi naftaleenin hajoamisnopeutta vesiympäristöissä. Villityypin kanta G7 hajotti naftaleenia paljon nopeammin kuin kemotaksis-puutteellinen mutanttikanta. NahY-proteiinin (538 aminohappoa, kalvotopologia) havaittiin transkriptoituvan yhdessä metakatkaisureitin geenien kanssa NAH7-plasmidissa, ja kemotaksis-transduktorien tavoin tämä proteiini näyttää toimivan naftaleenin hajoamisen kemoreseptorina (Grimm ja Harwood 1997). Toinen Hansel et al. (2009) tutkimus osoitti, että proteiini on kemotaktinen, mutta sen hajoamisnopeus on korkea. (2011) osoittivat Pseudomonas (P. putida) -bakteerin kemotaktisen vasteen kaasumaiselle naftaleenille, jossa kaasufaasidiffuusio johti naftaleenin tasaiseen virtaukseen soluihin, mikä kontrolloi solujen kemotaktista vastetta. Tutkijat hyödynsivät tätä kemotaktista käyttäytymistä muokatakseen mikrobeja, jotka tehostaisivat hajoamisnopeutta. Tutkimukset ovat osoittaneet, että kemosensoriset reitit säätelevät myös muita solutoimintoja, kuten solujen jakautumista, solusyklin säätelyä ja biofilmin muodostumista, auttaen siten hallitsemaan hajoamisnopeutta. Tämän ominaisuuden (kemotaksiksen) valjastaminen tehokkaaseen hajoamiseen on kuitenkin useiden pullonkaulojen haitaksi. Suurimmat esteet ovat: (a) eri paralogiset reseptorit tunnistavat samat yhdisteet/ligandit; (b) vaihtoehtoisten reseptorien olemassaolo eli energeettinen tropismi; (c) merkittävät sekvenssierot saman reseptoriperheen sensorisissa domeeneissa; ja (d) tiedon puute tärkeimmistä bakteerien sensoriproteiineista (Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). Joskus aromaattisten hiilivetyjen biohajoaminen tuottaa useita metaboliitteja/välituotteita, jotka voivat olla kemotaktisia yhdelle bakteeriryhmälle, mutta vastenmielisiä toisille, mikä vaikeuttaa prosessia entisestään. Ligandien (aromaattisten hiilivetyjen) ja kemiallisten reseptorien välisten vuorovaikutusten tunnistamiseksi rakensimme hybridi-sensoriproteiineja (PcaY, McfR ja NahY) fuusioimalla Pseudomonas putidan ja Escherichia colin sensori- ja signalointidomeenit, jotka kohdistuvat vastaavasti aromaattisten happojen, TCA-välituotteiden ja naftaleenin reseptoreihin (Luu et al., 2019).
Naftaleenin ja muiden polysyklisten aromaattisten hiilivetyjen (PAH-yhdisteiden) vaikutuksesta bakteerikalvon rakenne ja mikro-organismien eheys muuttuvat merkittävästi. Tutkimukset ovat osoittaneet, että naftaleeni häiritsee asyyliketjun vuorovaikutusta hydrofobisten vuorovaikutusten kautta, mikä lisää kalvon turpoamista ja juoksevuutta (Sikkema et al., 1995). Tämän haitallisen vaikutuksen torjumiseksi bakteerit säätelevät kalvon juoksevuutta muuttamalla iso-/anteiso-haaroittuneiden rasvahappojen välistä suhdetta ja rasvahappokoostumusta ja isomeroimalla cis-tyydyttymättömiä rasvahappoja vastaaviksi trans-isomeereiksi (Heipieper ja de Bont, 1994). Naftaleenikäsittelyllä kasvatetuissa Pseudomonas stutzeri -bakteerissa tyydyttyneiden ja tyydyttymättömien rasvahappojen suhde nousi 1,1:stä 2,1:een, kun taas Pseudomonas JS150 -bakteerissa tämä suhde nousi 7,5:stä 12,0:aan (Mrozik et al., 2004). Naftaleenipinnalla kasvatetuissa Achromobacter KAs 3–5 -soluissa havaittiin solujen aggregaatiota naftaleenikiteiden ympärillä ja solujen pintavarauksen laskua (-22,5 mV:sta -2,5 mV:iin), johon liittyi sytoplasman kondensaatiota ja vakuolisaatiota, mikä viittaa muutoksiin solurakenteessa ja solun pintaominaisuuksissa (Mohapatra et al., 2019). Vaikka solujen/pinnan muutokset liittyvät suoraan aromaattisten epäpuhtauksien parempaan imeytymiseen, asiaankuuluvia biotekniikkastrategioita ei ole optimoitu perusteellisesti. Solujen muodon manipulointia on käytetty harvoin biologisten prosessien optimointiin (Volke ja Nikel, 2018). Solujen jakautumiseen vaikuttavien geenien deleetio aiheuttaa muutoksia solumorfologiassa. Solujen jakautumiseen vaikuttavien geenien deleetio aiheuttaa muutoksia solumorfologiassa. Bacillus subtilis -bakteerissa solun väliseinäproteiini SepF on osoitettu osallistuvan väliseinän muodostumiseen ja sitä tarvitaan solunjakautumisen seuraavissa vaiheissa, mutta se ei ole välttämätön geeni. Peptidiglykaanihydrolaaseja koodaavien geenien deleetio Bacillus subtilis -bakteerissa johti solujen pidentymiseen, lisääntyneeseen spesifiseen kasvunopeuteen ja parantuneeseen entsyymien tuotantokapasiteettiin (Cui et al., 2018).
Karbaryylin hajoamisreitin osastojen luokittelua on ehdotettu Pseudomonas-kantojen C5pp ja C7 tehokkaan hajoamisen saavuttamiseksi (Kamini et al., 2018). On ehdotettu, että karbaryyli kuljetetaan periplasmiseen tilaan ulkokalvon väliseinän läpi ja/tai diffundoituvien poriinien kautta. CH on periplasminen entsyymi, joka katalysoi karbaryylin hydrolyysiä 1-naftoliksi, joka on vakaampi, hydrofobisempi ja myrkyllisempi. CH lokalisoituu periplasmaan ja sillä on alhainen affiniteetti karbaryyliin, mikä kontrolloi 1-naftolin muodostumista estäen siten sen kertymisen soluihin ja vähentäen sen myrkyllisyyttä soluille (Kamini et al., 2018). Tuloksena oleva 1-naftoli kuljetetaan sytoplasmaan sisäkalvon läpi jakautumisen ja/tai diffuusion avulla, ja sitten korkea-affiniteettisen entsyymin 1NH hydroksyloi sen 1,2-dihydroksinaftaleeniksi, joka metaboloituu edelleen keskeisessä hiilireitissä.
Vaikka mikro-organismeilla on geneettiset ja metaboliset kyvyt hajottaa vierasaineita sisältäviä hiilen lähteitä, niiden hyödyntämisen hierarkkinen rakenne (eli yksinkertaisten hiilen lähteiden suosiminen monimutkaisiin verrattuna) on merkittävä este biohajoamiselle. Yksinkertaisten hiilen lähteiden läsnäolo ja hyödyntäminen heikentää sellaisten entsyymien toimintaa, jotka hajottavat monimutkaisia/ei-edullisia hiilen lähteitä, kuten PAH-yhdisteitä. Hyvin tutkittu esimerkki on, että kun Escherichia coli -bakteeriin syötetään glukoosia ja laktoosia samanaikaisesti, glukoosia käytetään tehokkaammin kuin laktoosia (Jacob ja Monod, 1965). Pseudomonas-bakteerin on raportoitu hajottavan useita PAH-yhdisteitä ja vierasaineita hiilen lähteinä. Pseudomonas-bakteerin hiilen lähteiden hyödyntämisen hierarkia on orgaaniset hapot > glukoosi > aromaattiset yhdisteet (Hylemon ja Phibbs, 1972; Collier et al., 1996). Tähän on kuitenkin poikkeus. Mielenkiintoista on, että Pseudomonas sp. CSV86:lla on ainutlaatuinen hierarkkinen rakenne, joka käyttää ensisijaisesti aromaattisia hiilivetyjä (bentsoehappo, naftaleeni jne.) glukoosin sijaan ja metaboloi aromaattisia hiilivetyjä yhdessä orgaanisten happojen kanssa (Basu et al., 2006). Tässä bakteerissa aromaattisten hiilivetyjen hajotukseen ja kuljetukseen liittyvät geenit eivät vähene edes toisen hiilen lähteen, kuten glukoosin tai orgaanisten happojen, läsnä ollessa. Kun bakteeria kasvatettiin glukoosi- ja aromaattisten hiilivetyjen kasvatusalustassa, havaittiin, että glukoosin kuljetukseen ja metaboliaan liittyvät geenit vähenivät, aromaattisia hiilivetyjä hyödynnettiin ensimmäisessä logaritmivaiheessa ja glukoosia toisessa logaritmivaiheessa (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). Toisaalta orgaanisten happojen läsnäolo ei vaikuttanut aromaattisten hiilivetyjen metabolian ilmentymiseen, joten tämän bakteerin odotetaan olevan ehdokaskanta biohajoavuustutkimuksiin (Phale et al., 2020).
On hyvin tunnettua, että hiilivetyjen biotransformaatio voi aiheuttaa oksidatiivista stressiä ja antioksidanttientsyymien lisääntynyttä ilmentymistä mikro-organismeissa. Tehoton naftaleenin biohajoaminen sekä stationäärifaasisoluissa että myrkyllisten yhdisteiden läsnä ollessa johtaa reaktiivisten happilajien (ROS) muodostumiseen (Kang et al. 2006). Koska naftaleenia hajottavat entsyymit sisältävät rauta-rikki-klustereita, oksidatiivisen stressin alaisena hemin ja rauta-rikki-proteiinien rauta hapettuu, mikä johtaa proteiinien inaktivoitumiseen. Ferredoksiini-NADP+-reduktaasi (Fpr) yhdessä superoksididismutaasin (SOD) kanssa välittää palautuvaa redox-reaktiota NADP+/NADPH:n ja kahden ferredoksiini- tai flavodoksiinimolekyylin välillä, jolloin se sitoo ROS:ia ja palauttaa rauta-rikki-keskuksen oksidatiivisen stressin alaisena (Li et al. 2006). On raportoitu, että sekä Fpr että SodA (SOD) voivat indusoitua Pseudomonas-soluissa oksidatiivisen stressin seurauksena, ja neljässä Pseudomonas-kannassa (O1, W1, As1 ja G1) havaittiin lisääntynyttä SOD- ja katalaasiaktiivisuutta naftaleenilla lisättyjen olosuhteiden aikana (Kang et al., 2006). Tutkimukset ovat osoittaneet, että antioksidanttien, kuten askorbiinihapon tai rauta(II)-ionisaation (Fe2+), lisääminen voi lisätä naftaleenin kasvunopeutta. Kun Rhodococcus erythropolis kasvoi naftaleeniväliaineessa, oksidatiiviseen stressiin liittyvien sytokromi P450 -geenien, kuten sodA:n (Fe/Mn-superoksididismutaasi), sodC:n (Cu/Zn-superoksididismutaasi) ja recA:n, transkriptio lisääntyi (Sazykin et al., 2019). Naftaleenissa viljeltyjen Pseudomonas-solujen vertaileva kvantitatiivinen proteomiikka-analyysi osoitti, että oksidatiiviseen stressivasteeseen liittyvien useiden proteiinien lisääntynyt ilmentyminen on stressin hallintastrategia (Herbst et al., 2013).
Mikro-organismien on raportoitu tuottavan biosurfaktantteja hydrofobisten hiililähteiden vaikutuksesta. Nämä pinta-aktiiviset aineet ovat amfifiilisiä pinta-aktiivisia yhdisteitä, jotka voivat muodostaa aggregaatteja öljy-vesi- tai ilma-vesi-rajapinnoille. Tämä edistää pseudo-liukenemista ja helpottaa aromaattisten hiilivetyjen adsorptiota, mikä johtaa tehokkaaseen biohajoamiseen (Rahman et al., 2002). Näiden ominaisuuksien ansiosta biosurfaktantteja käytetään laajalti eri teollisuudenaloilla. Kemiallisten pinta-aktiivisten aineiden tai biosurfaktanttien lisääminen bakteeriviljelmiin voi parantaa hiilivetyjen hajoamisen tehokkuutta ja nopeutta. Biosurfaktanteista Pseudomonas aeruginosan tuottamia ramnolipidejä on tutkittu ja karakterisoitu laajasti (Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). Lisäksi muita biosurfaktantteja ovat lipopeptidit (musiinit Pseudomonas fluorescens -bakteerista), emulgointiaine 378 (Pseudomonas fluorescens -bakteerista) (Rosenberg ja Ron, 1999), trehaloosidisakkaridilipidit Rhodococcus-bakteerista (Ramdahl, 1985), licheniini Bacillus-bakteerista (Saraswathy ja Hallberg, 2002) sekä pinta-aktiivinen aine Bacillus subtilis -bakteerista (Siegmund ja Wagner, 1991) ja Bacillus amyloliquefaciens -bakteerista (Zhi et al., 2017). Näiden tehokkaiden pinta-aktiivisten aineiden on osoitettu alentavan pintajännitystä 72 dynestä/cm alle 30 dyneen/cm, mikä mahdollistaa paremman hiilivetyjen imeytymisen. On raportoitu, että Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia ja muut bakteerilajit voivat tuottaa erilaisia ​​ramnolipidi- ja glykolipidipohjaisia ​​biosurfaktantteja, kun niitä kasvatellaan naftaleeni- ja metyylinaftaleeni-alustassa (Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89 voi tuottaa solunulkoista biosurfaktanttia Biosur-Pm, kun sitä kasvatetaan aromaattisilla yhdisteillä, kuten naftoehapolla (Phale et al., 1995). Biosur-Pm:n muodostumisen kinetiikka osoitti, että sen synteesi on kasvusta ja pH:sta riippuva prosessi. Havaittiin, että solujen tuottaman Biosur-Pm:n määrä neutraalissa pH:ssa oli suurempi kuin pH 8,5:ssä. PH 8,5:ssä kasvatetut solut olivat hydrofobisempia ja niillä oli suurempi affiniteetti aromaattisiin ja alifaattisiin yhdisteisiin kuin pH 7,0:ssa kasvatetut solut. Rhodococcus spp. N6, korkeampi hiili-typpisuhde (C:N) ja raudan rajoitus ovat optimaaliset olosuhteet solunulkoisten biosurfaktanttien tuotannolle (Mutalik et al., 2008). Biosurfaktanttien (surfaktiinien) biosynteesiä on pyritty parantamaan optimoimalla kantoja ja fermentaatiota. Pinta-aktiivisen aineen tiitteri viljelyalustassa on kuitenkin alhainen (1,0 g/l), mikä asettaa haasteen laajamittaiselle tuotannolle (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Siksi geenitekniikan menetelmiä on käytetty sen biosynteesin parantamiseksi. Sen tekninen muokkaaminen on kuitenkin vaikeaa operonin suuren koon (∼25 kb) ja koorumin tunnistusjärjestelmän monimutkaisen biosynteettisen säätelyn vuoksi (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Bacillus-bakteereissa on tehty useita geenitekniikan muutoksia, joiden pääasiallisena tavoitteena on ollut surfaktiinin tuotannon lisääminen korvaamalla promoottori (srfA-operoni), yliekspressoimalla surfaktiinin vientiproteiinia YerP:tä ja säätelytekijöitä ComX ja PhrC (Jiao et al., 2017). Näillä geenitekniikan menetelmillä on kuitenkin saavutettu vain yksi tai muutama geneettisten muutosten määrä, eivätkä ne ole vielä saavuttaneet kaupallista tuotantoa. Siksi tietämykseen perustuvien optimointimenetelmien lisätutkimus on tarpeen.
PAH-yhdisteiden biohajoavuustutkimukset tehdään pääasiassa tavanomaisissa laboratorio-olosuhteissa. Saastuneilla alueilla tai ympäristöissä monien abioottisten ja bioottisten tekijöiden (lämpötila, pH, happi, ravinteiden saatavuus, substraatin biologinen hyötyosuus, muut vierasaineet, lopputuotteiden esto jne.) on osoitettu muuttavan ja vaikuttavan mikro-organismien hajoamiskykyyn.
Lämpötilalla on merkittävä vaikutus PAH-yhdisteiden biohajoamiseen. Lämpötilan noustessa liuenneen hapen pitoisuus laskee, mikä vaikuttaa aerobisten mikro-organismien aineenvaihduntaan, koska ne tarvitsevat molekyylihappea yhtenä substraatteina oksigenaaseille, jotka suorittavat hydroksylaatio- tai renkaan pilkkoutumisreaktioita. Usein havaitaan, että kohonnut lämpötila muuntaa emo-PAH-yhdisteet myrkyllisemmiksi yhdisteiksi, mikä estää biohajoamista (Muller et al., 1998).
On havaittu, että monilla PAH-yhdisteiden saastuttamilla alueilla on äärimmäiset pH-arvot, kuten happamien kaivosviemäröintien saastuttamilla alueilla (pH 1–4) ja emäksisen suotoveden saastuttamilla maakaasun/hiilen kaasutusalueilla (pH 8–12). Nämä olosuhteet voivat vaikuttaa vakavasti biohajoamisprosessiin. Siksi ennen mikro-organismien käyttöä bioremediaatioon on suositeltavaa säätää pH-arvoa lisäämällä sopivia kemikaaleja (joilla on kohtalainen tai erittäin alhainen hapetus-pelkistyspotentiaali), kuten ammoniumsulfaattia tai ammoniumnitraattia emäksisille maille tai kalkitusta kalsiumkarbonaatilla tai magnesiumkarbonaatilla happamille alueille (Bowlen et al. 1995; Gupta ja Sar 2020).
Hapen saanti vaikutusalueelle on PAH-yhdisteiden biohajoamisen nopeutta rajoittava tekijä. Ympäristön redox-olosuhteiden vuoksi in situ -bioremediaatioprosessit vaativat yleensä hapen lisäämistä ulkoisista lähteistä (muokkaus, ilmastus ja kemikaalien lisäys) (Pardieck et al., 1992). Odenkranz et al. (1996) osoittivat, että magnesiumperoksidin (happea vapauttava yhdiste) lisääminen saastuneeseen pohjavesikerrokseen voi tehokkaasti bioremedioida BTEX-yhdisteitä. Toisessa tutkimuksessa tutkittiin fenolin ja BTEX:n in situ -hajoamista saastuneessa pohjavesikerroksessa injektoimalla natriumnitraattia ja rakentamalla uuttokaivoja tehokkaan bioremediaation saavuttamiseksi (Bewley ja Webb, 2001).