Nykyinen osoite: Köln 50931, Saksa, Kölnin huippuyksikkö, tutkimuskeskus Cellular Stress Response in Age-Related Diseases (CECAD).
Mitokondriosairauksien aiheuttamaa neurodegeneraatiota pidetään peruuttamattomana, koska hermosolujen metabolinen plastisuus on rajallinen, mutta mitokondrioiden toimintahäiriön vaikutusta hermosolujen aineenvaihdunnan soluautonomiaan elimistössä ymmärretään huonosti. Tässä esittelemme Purkinjen hermosolujen soluspesifisen proteomin, jolla on etenevä OXPHOS-puutos, jonka aiheuttaa häiriintynyt mitokondrioiden fuusiodynamiikka. Havaitsimme, että mitokondrioiden toimintahäiriö laukaisi syvällisen muutoksen proteomiikan alalla, mikä lopulta johti tarkkojen aineenvaihduntaohjelmien peräkkäiseen aktivoitumiseen ennen solukuolemaa. Yllättäen havaitsimme pyruvaattikarboksylaasin (PCx) ja muiden TCA-syklin välituotteita täydentävien ikääntymistä estävien entsyymien ilmeisen induktion. PCx:n esto pahensi oksidatiivista stressiä ja neurodegeneraatiota, mikä osoittaa, että ateroskleroosilla on suojaava vaikutus hermosoluissa, joilta puuttuu OXPHOS. Mitokondrioiden fuusion palautuminen terminaalisesti rappeutuneissa hermosoluissa kääntää nämä metaboliset ominaisuudet täysin päinvastaisiksi estäen siten solukuoleman. Löydöksemme tunnistavat aiemmin tuntemattomia reittejä, jotka antavat vastustuskykyä mitokondrioiden toimintahäiriöille, ja osoittavat, että neurodegeneraatio voidaan kääntää jopa taudin myöhäisissä vaiheissa.
Mitokondrioiden keskeistä roolia hermosolujen energia-aineenvaihdunnan ylläpitämisessä korostavat ihmisen mitokondriosairauksiin liittyvät laajat neurologiset oireet. Useimmat näistä sairauksista johtuvat mitokondrioiden geenien ilmentymistä säätelevistä geenimutaatioista (1, 2) tai mitokondrioiden dynamiikkaan liittyvästä geenituhosta, joka vaikuttaa epäsuorasti mitokondriaalisen DNA:n (mtDNA) pysyvyyteen (3, 4). Eläinmalleilla tehdyt tutkimukset ovat osoittaneet, että vasteena ympäröivien kudosten mitokondrioiden toimintahäiriöihin voivat aktivoitua konservatiiviset aineenvaihduntareitit (5-7), mikä tarjoaa tärkeää tietoa näiden monimutkaisten sairauksien patogeneesin syvällisempään ymmärtämiseen. Jyrkässä ristiriidassa ymmärryksemme aivojen mitokondriaalisen adenosiinitrifosfaatin (ATP) tuotannon yleisen epäonnistumisen aiheuttamista tiettyjen solutyyppien aineenvaihduntamuutoksista on perustavanlaatuista (8), mikä korostaa tarvetta tunnistaa terapeuttisia kohteita, joita voidaan käyttää sairauksien ehkäisyyn tai ehkäisyyn. Neurodegeneraation estäminen (9). Tiedon puute johtuu siitä, että hermosolujen katsotaan yleisesti olevan hyvin rajallinen aineenvaihdunnallinen joustavuus verrattuna ympäröivien kudosten solutyyppeihin (10). Koska näillä soluilla on keskeinen rooli metaboliittien toimittamisen koordinoinnissa neuroneille synaptisen signaalinvälityksen edistämiseksi ja reagoimiseksi vammoihin ja sairauksiin, kyky sopeuttaa solujen aineenvaihduntaa aivokudoksen haastaviin olosuhteisiin on lähes rajallinen gliasoluille (11–14). Lisäksi aivokudoksen luontainen solujen heterogeenisuus haittaa suuresti tietyissä neuronaalisissa alaryhmissä tapahtuvien aineenvaihduntamuutosten tutkimusta. Tämän seurauksena mitokondrioiden toimintahäiriöiden tarkoista solu- ja aineenvaihduntavaikutuksista neuroneissa tiedetään vain vähän.
Ymmärtääksemme mitokondrioiden toimintahäiriöiden metabolisia seurauksia eristimme Purkinjen neuroneja (PN) neurodegeneraation eri vaiheissa, jotka johtuvat mitokondrioiden ulkokalvon fuusion (Mfn2) tuhoutumisesta. Vaikka Mfn2-mutaatiot ihmisillä liittyvät perinnölliseen motoriseen sensoriseen neuropatiaan, joka tunnetaan nimellä Charcot-Marie-Tooth tyyppi 2A (15), Mfn2:n ehdollinen tuhoutuminen hiirillä on hyvin tunnettu oksidaatiofosforylaation (OXPHOS) induktiotoimintahäiriömenetelmä. Eri neuronaalisiin alatyyppeihin (16-19) ja niistä johtuvaan neurodegeneratiiviseen fenotyyppiin liittyy eteneviä neurologisia oireita, kuten liikehäiriöitä (18, 19) tai pikkuaivoataksiaa (16). Käyttämällä yhdistelmää leimaamattomia kvantitatiivisia (LFQ) proteomiikan, metabolomiikan, kuvantamisen ja virologisia menetelmiä osoitamme, että etenevä neurodegeneraatio indusoi voimakkaasti pyruvaattikarboksylaasia (PCx) ja muita PN-neuronien arterioskleroosiin osallistuvia tekijöitä in vivo entsyymien ilmentymisessä. Varmistaaksemme tämän löydöksen merkityksellisyyden, vähensimme spesifisesti PCx:n ilmentymistä Mfn2-puutteisissa neuropatiasoluissa ja havaitsimme, että tämä operaatio pahensi oksidatiivista stressiä ja kiihdytti neurodegeneraatiota, mikä osoitti, että azoospermia lisää solukuolemaa ja aineenvaihduntaa. MFN2:n voimakas ilmentyminen voi täysin pelastaa terminaalisesti rappeutuvan neuropatian, johon liittyy vaikea OXPHOS-puutos, massiivinen mitokondriaalisen DNA:n kulutus ja näennäisesti rikkoutunut mitokondrioverkosto. Tämä korostaa entisestään sitä, että tämä neurodegeneraation muoto voi toipua jopa taudin pitkälle edenneessä vaiheessa ennen solukuolemaa.
Visualisoidaksemme Mfn2-geenin poistogeenisissä hermosoluissa olevia mitokondrioita käytimme hiirikantaa, joka sallii Cre-riippuvaisten mitokondrioiden kohdistua keltaisen fluoresoivan proteiinin (YFP) (mtYFP) (20) Cre-ilmentymiseen, ja tarkistimme mitokondrioiden morfologian in vivo. Havaitsimme, että Mfn2-geenin tuhoutuminen hermosoluissa johtaa mitokondrioverkoston asteittaiseen jakautumiseen (kuva S1A), ja varhaisin muutos havaittiin 3 viikon iässä. Sitä vastoin hermosolukerroksen merkittävä rappeutuminen, kuten calbindin-immunovärjäyksen menetys osoitti, alkoi vasta 12 viikon iässä (kuva 1, A ja B). Aikaero mitokondrioiden morfologian varhaisimpien muutosten ja hermosolujen kuoleman näkyvän alkamisen välillä sai meidät tutkimaan mitokondrioiden toimintahäiriön laukaisemia metabolisia muutoksia ennen solukuolemaa. Kehitimme fluoresenssiin aktivoituun solulajitteluun (FACS) perustuvan strategian YFP:tä (YFP+) ilmentävien PN-solujen eristämiseksi (kuva 1C) ja kontrollihiirissä (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), joista jäljempänä käytetään nimitystä CTRL (kuva S1B). YFP-signaalin suhteelliseen intensiteettiin perustuvan portoitusstrategian optimointi mahdollistaa YFP-signaalin suhteellisen intensiteetin perusteella YFP+-rungon (YFPhigh) puhdistamisen ei-PN-soluista (YFPneg) (kuva S1B) tai oletetuista fluoresoivista aksoni-/dendriittifragmenteista (YFPlow; kuva S1D, vasen), mikä vahvistettiin konfokaalimikroskoopilla (kuva S1D, oikea). Luokitellun populaation identiteetin varmistamiseksi suoritimme LFQ-proteomiikka- ja sitten pääkomponenttianalyysin ja havaitsimme, että YFPhigh- ja YFPneg-solujen välillä on selvä ero (kuva S1C). YFPhigh-soluissa havaittiin tunnettujen PN-merkkiaineiden (eli Calb1, Pcp2, Grid2 ja Itpr3) nettorikastumista (21, 22), mutta ei neuroneissa tai muissa solutyypeissä yleisesti ilmentyvien proteiinien rikastumista (kuva 1D). Vertailu luokiteltujen YFPhigh-solujen näytteiden välillä, jotka oli kerätty riippumattomissa kokeissa, osoitti korrelaatiokertoimen > 0,9, mikä osoittaa hyvää toistettavuutta biologisten replikaattien välillä (kuva S1E). Yhteenvetona voidaan todeta, että nämä tiedot validoivat suunnitelmamme mahdollisten PN-solujen akuuttiin ja spesifiseen eristämiseen. Koska käytetty L7-cre-ajurijärjestelmä indusoi mosaiikkirekombinaatiota ensimmäisen viikon aikana synnytyksen jälkeen (23), aloimme hiiriä karsia CTRL-ryhmästä ja kerätä ehdollisia (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) neuroneja. Rekombinaation valmistuttua sitä kutsutaan Mfn2cKO:ksi 4 viikon iässä. Päätepisteeksi valitsimme 8 viikon iän, jolloin PN-kerros oli ehjä ilmeisestä mitokondrioiden fragmentoitumisesta huolimatta (kuva 1B ja kuva S1A). Yhteensä kvantifioimme 3013 proteiinia, joista noin 22 % perustui MitoCarta 2.0 -merkintöihin, jotka perustuivat mitokondrioiden proteomiin mitokondrioina (kuva 1E) (24). Viikolla 8 suoritettu differentiaalinen geeniekspressioanalyysi osoitti, että vain 10,5 %:lla kaikista proteiineista oli merkittäviä muutoksia (kuva 1F ja kuva S1F), joista 195 proteiinia ilmentyi alaspäin ja 120 proteiinia ilmentyi ylöspäin (kuva 1F). On syytä huomata, että tämän aineiston "innovatiivinen reittianalyysi" osoittaa, että differentiaalisesti ilmentyvät geenit kuuluvat pääasiassa rajoitettuun joukkoon spesifisiä aineenvaihduntareittejä (kuva 1G). Mielenkiintoista on, että vaikka OXPHOS:iin ja kalsiumsignalointiin liittyvien reittien alasääntely vahvistaa mitokondrioiden toimintahäiriöiden induktion fuusiopuutteisissa neuroendokriinisissä soluissa, muut luokat, jotka liittyvät pääasiassa aminohappojen aineenvaihduntaan, ilmentyvät merkittävästi ylöspäin, mikä on linjassa mitokondrioiden neuroendokriinisten soluissa tapahtuvan aineenvaihdunnan kanssa. Uudelleenjohdonmukainen uudelleenjohdonmukaisuus.
(A) Edustavat konfokaalikuvat CTRL- ja Mfn2cKO-hiirten pikkuaivoleikkeistä, jotka osoittavat perifeeristen nukleosyyttien (PN) progressiivista häviämistä (kalbindiini, harmaa); tumat vastavärjättiin DAPI:lla. (B) Kohdan (A) kvantifiointi (yksisuuntainen varianssianalyysi, ***P<0,001; n = 4–6 ympyrää kolmelta hiireltä). (C) Kokeellinen työnkulku. (D) Purkinjen (ylhäällä) ja muiden solutyyppien (keskellä) spesifisten markkereiden lämpökarttajakauma. (E) Venn-diagrammi, joka näyttää luokitellussa PN:ssä tunnistettujen mitokondriaalisten proteiinien lukumäärän. (F) Mfn2cKO-neuronien erilaisesti ilmentyneiden proteiinien tulivuorikäyrä 8 viikon kohdalla (merkitsevyysraja-arvo 1,3). (G) Luovuusreittianalyysi näyttää viisi tärkeintä ylös- (punainen) ja alas- (sininen) -reittiä Mfn2cKO-PN:ssä, joka on luokiteltu 8 viikon ikään. Kunkin havaitun proteiinin keskimääräinen ilmentymistaso on esitetty. Harmaasävylämpökartta: oikaistu P-arvo. ns, ei tärkeä.
Proteomiikkatiedot osoittivat, että kompleksien I, III ja IV proteiiniekspressio väheni vähitellen. Kompleksit I, III ja IV sisälsivät kaikki välttämättömiä mitokondriaalisen DNA:n koodaamia alayksiköitä, kun taas kompleksi II, joka oli koodattu vain tumassa, pysyi käytännössä muuttumattomana (kuva 2A ja kuva S2A). . Proteomiikkatulosten mukaisesti pikkuaivokudosleikkeiden immunohistokemia osoitti, että kompleksin IV MTCO1-alayksikön (mitokondrioiden sytokromi C-oksidaasin alayksikkö 1) taso PN:ssä väheni vähitellen (kuva 2B). Mitokondriaalisen DNA:n koodaama alayksikkö Mtatp8 väheni merkittävästi (kuva S2A), kun taas tumassa koodaaman ATP-syntaasin alayksikön vakaan tilan taso pysyi muuttumattomana, mikä on yhdenmukaista tunnetun stabiilin ATP-syntaasin alayksikön F1-kompleksin kanssa, kun mitokondriaalisen DNA:n ilmentyminen on vakaata. Muodostuminen on yhdenmukaista. Keskeytys (7). Mitokondriaalisen DNA:n tason arviointi lajitelluissa Mfn2cKO-PN:issä reaaliaikaisella polymeraasiketjureaktiolla (qPCR) vahvisti mitokondriaalisen DNA:n kopioiden määrän asteittaisen vähenemisen. Verrattuna kontrolliryhmään, 8 viikon iässä vain noin 20 % mtDNA:n tasosta oli säilynyt (kuva 2C). Näiden tulosten mukaisesti Mfn2cKO-PN-solujen konfokaalimikroskopiavärjäystä käytettiin DNA:n havaitsemiseen, mikä osoitti mitokondriaalisten nukleotidien ajasta riippuvan kulutuksen (kuva 2D). Havaitsimme, että vain joidenkin mitokondriaalisten proteiinien hajoamiseen ja stressivasteeseen osallistuvien ehdokkaiden, mukaan lukien Lonp1:n, Afg3l2:n ja Clpx:n sekä OXPHOS-kompleksin kokoonpanotekijöiden, ilmentyminen lisääntyi. Apoptoosiin osallistuvien proteiinien tasoissa ei havaittu merkittäviä muutoksia (kuva S2B). Samoin havaitsimme, että kalsiumin kuljetukseen osallistuvissa mitokondrioissa ja endoplasmisessa retikulumissa on vain vähäisiä muutoksia (kuva S2C). Lisäksi autofagiaan liittyvien proteiinien arvioinnissa ei havaittu merkittäviä muutoksia, mikä on yhdenmukaista immunohistokemialla ja elektronimikroskopialla in vivo havaitun autofagosomien näkyvän induktion kanssa (kuva S3). PN-solujen progressiiviseen OXPHOS-toimintahäiriöön liittyy kuitenkin selviä ultrastruktuurisia mitokondriaalisia muutoksia. Mitokondrioiden klustereita voidaan nähdä 5 ja 8 viikon ikäisten Mfn2cKO-PN-solujen solurungoissa ja dendriittipuissa, ja sisäkalvon rakenne on muuttunut merkittävästi (kuva S4, A ja B). Näiden ultrastruktuuristen muutosten ja mtDNA:n merkittävän vähenemisen mukaisesti akuuttien aivojen pikkuaivoviipaleiden analyysi tetrametyylirodamiinimetyyliesterillä (TMRM) osoitti, että Mfn2cKO-PN-solujen mitokondriaalinen kalvopotentiaali oli merkittävästi heikentynyt (kuva S4C).
(A) OXPHOS-kompleksin ilmentymistasoanalyysi aikakuluanalyysinä. Huomioi vain proteiinit, joiden P < 0,05 8 viikon kohdalla (kaksisuuntainen ANOVA). Katkoviiva: Ei muutosta verrattuna CTRL-kontrolliin. (B) Vasen: Esimerkki pikkuaivoleikkeestä, joka on merkitty anti-MTCO1-vasta-aineella (skaalapalkki, 20 μm). Purkinjen solujen peittämä alue on peitetty keltaisella. Oikea: MTCO1-tasojen kvantifiointi (yksisuuntainen varianssianalyysi; n = 7–20 solua analysoituna kolmesta hiirestä). (C) qPCR-analyysi mitoDNA:n kopioiden määrästä lajitellussa perinukleaarisessa solussa (yksisuuntainen varianssianalyysi; n = 3–7 hiirtä). (D) Vasen: Esimerkki pikkuaivoleikkeestä, joka on merkitty anti-DNA-vasta-aineella (skaalapalkki, 20 μm). Purkinjen solujen peittämä alue on peitetty keltaisella. Oikea: mitoDNA-vaurioiden kvantifiointi (yksisuuntainen varianssianalyysi; n = 5–9 solua kolmesta hiirestä). (E) Esimerkki akuutista pikkuaivoleikkauksesta, joka näyttää mitoYFP + Purkinjen solut (nuoli) kokosolupatch clamp -rekisteröinnissä. (F) IV-käyrän kvantifiointi. (G) Depolarisoivan virran injektion edustavat tallenteet CTRL- ja Mfn2cKO-Purkinjen soluissa. Yläkäyrä: Ensimmäinen pulssi, joka laukaisi AP:n. Alinkäyrä: AP:n maksimitaajuus. (H) Postsynaptisten spontaanien syötteiden (sPSP) kvantifiointi. Edustava tallennuskäyrä ja sen zoomaussuhde on esitetty kohdassa (I). Yksisuuntainen varianssianalyysi analysoi n = 5–20 solua kolmelta hiireltä. Tiedot on ilmaistu keskiarvona ± SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Spontaanin AP:n edustavat käyrät, jotka on tallennettu rei'itetyllä patch clamp -tilalla. Yläkäyrä: AP:n maksimitaajuus. Alinkäyrä: yksittäisen AP:n zoomaus. (K) Kvantifioi keskimääräinen ja suurin AP-taajuus kohdan (J) mukaisesti. Mann-Whitney-testi; n = 5 solua analysoitiin neljältä hiireltä. Tiedot on ilmaistu keskiarvona ± SEM; ei tärkeää.
Kahdeksan viikon ikäisellä Mfn2cKO-neuronilla havaittiin selviä OXPHOS-vaurioita, mikä viittaa siihen, että hermosolujen fysiologinen toiminta on vakavasti poikkeavaa. Siksi analysoimme OXPHOS-puutteisten hermosolujen passiivisia sähköisiä ominaisuuksia 4–5 viikon ja 7–8 viikon iässä suorittamalla kokonaisten solujen patch clamp -rekisteröintejä akuuteissa pikkuaivoleikkeissä (kuva 2E). Yllättäen Mfn2cKO-neuronien keskimääräinen lepokalvon potentiaali ja tuloresistanssi olivat samankaltaisia ​​kuin kontrollilla, vaikka solujen välillä oli hienoisia eroja (taulukko 1). Vastaavasti 4–5 viikon iässä ei havaittu merkittäviä muutoksia virta-jännitesuhteessa (IV-käyrä) (kuva 2F). Yksikään 7–8 viikon ikäinen Mfn2cKO-neuroni ei kuitenkaan selvinnyt IV-hoidosta (hyperpolarisaatiovaihe), mikä osoittaa, että tässä myöhäisessä vaiheessa on selkeä herkkyys hyperpolarisaatiopotentiaalille. Sitä vastoin Mfn2cKO-neuroneissa toistuvia aktiopotentiaalin (AP) purkauksia aiheuttavat depolarisoivat virrat ovat hyvin siedettyjä, mikä osoittaa, että niiden kokonaispurkauskuviot eivät eroa merkittävästi 8 viikon ikäisten kontrollineuronien vastaavista (taulukko 1 ja kuva 2G). Vastaavasti spontaanien postsynaptisten virtojen (sPSC) taajuus ja amplitudi olivat verrattavissa kontrolliryhmän vastaaviin, ja tapahtumien taajuus kasvoi 4 viikosta 5 viikkoon ja sitten 7 viikkoon ja 8 viikkoon samalla tavalla (kuva 2, H ja I). ​​Synaptisen kypsymisen kesto PN-neuroneissa (25). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin rei'itettyjen PN-laastarien jälkeen. Tämä konfiguraatio estää solujen ATP-defektien mahdollisen kompensoitumisen, kuten voi tapahtua kokosolu-laastarin rekisteröinnissä. Erityisesti Mfn2cKO-neuronien lepokalvopotentiaali ja spontaani laukaisutaajuus eivät muuttuneet (kuva 2, J ja K). Yhteenvetona voidaan todeta, että nämä tulokset osoittavat, että ilmeistä OXPHOS-toimintahäiriötä omaavat PN:t pystyvät selviytymään korkeataajuisista purkauskuvioista hyvin, mikä osoittaa, että on olemassa kompensaatiomekanismi, jonka avulla ne voivat ylläpitää lähes normaaleja elektrofysiologisia vasteita.
Tiedot on ilmaistu keskiarvona ± SEM (yksisuuntainen varianssianalyysi, Holm-Sidakin monivertailutesti; *P<0,05). Yksikkönumero on merkitty suluilla.
Ryhdyimme tutkimaan, sisältääkö mikään proteomiikka-aineiston kategoria (kuva 1G) reittejä, jotka voivat torjua vakavaa OXPHOS-puutosta, selittäen siten, miksi sairastunut perifeerinen neuriitti voi ylläpitää lähes normaalia elektrofysiologiaa (kuva 2, E–K). . Proteomiikka-analyysi osoitti, että haaraketjuisten aminohappojen (BCAA) kataboliaan osallistuvien entsyymien ilmentyminen lisääntyi merkittävästi (kuva 3A ja kuva S5A), ja lopputuote asetyyli-CoA (CoA) tai sukkinyyli-CoA voi täydentää trikarboksylaatteja arterioskleroosin happokierrossa (TCA). Havaitsimme, että sekä BCAA-transaminaasi 1:n (BCAT1) että BCAT2:n pitoisuus lisääntyi. Ne katalysoivat BCAA-katabolian ensimmäistä vaihetta tuottamalla glutamaattia α-ketoglutaraatista (26). Kaikki haaraketjuisen ketohappodehydrogenaasin (BCKD) kompleksin muodostavat alayksiköt lisääntyvät (kompleksi katalysoi syntyvän BCAA-hiilirungon myöhempää ja peruuttamatonta dekarboksylaatiota) (kuva 3A ja kuva S5A). Lajitelluissa nanosoluissa ei kuitenkaan havaittu selviä muutoksia itse haaroittuneen aminohapon (BCAA) pitoisuudessa, mikä voi johtua näiden välttämättömien aminohappojen lisääntyneestä soluotosta tai muiden lähteiden (glukoosi tai maitohappo) käytöstä TCA-syklin täydentämiseksi (kuva S5B). OXPHOS:n puuttuvilla nanosoluilla havaittiin myös lisääntynyttä glutamiinin hajoamista ja transaminaatioaktiivisuutta 8 viikon iässä, mikä voi näkyä mitokondrioiden entsyymien glutaminaasi (GLS) ja glutamiinipyruvaattitransaminaasi 2:n (GPT2) lisääntyneenä ilmentymisenä (kuva 3, A ja C). On syytä huomata, että GLS:n lisääntynyt ilmentyminen rajoittuu silmukoituun isoformi glutaminaasi C:hen (GLS-GAC) (Mfn2cKO/CTRL:n muutos on noin 4,5-kertainen, P = 0,05), ja sen spesifinen lisääntynyt ilmentyminen syöpäkudoksissa voi tukea mitokondrioiden bioenergiaa. (27).
(A) Lämpökartta näyttää proteiinitason kerrannaisen muutoksen määritellyllä reitillä 8 viikon kuluttua. (B) Esimerkki anti-PCx-vasta-aineella merkitystä pikkuaivoleikkeestä (skaalapalkki, 20 μm). Keltainen nuoli osoittaa Purkinjen solurunkoon. (C) Aikakuluanalyysi proteiinien ilmentymisestä, joka tunnistettiin tärkeäksi ateroskleroosin ehdokkaaksi (moninkertainen t-testi, *FDR <5 %; n = 3-5 hiirtä). (D) Yllä: Kaaviokuva, joka esittää eri tapoja, joilla [1-13C]pyruvaatti-merkkiaineen sisältämä merkitty hiili pääsee soluun (eli PDH:n tai transarteriaalisen reitin kautta). Ala: Viulukaavio näyttää prosenttiosuuden yksinkertaisesti merkitystä hiilestä (M1), joka on muuttunut asparagiinihapoksi, sitruunahapoksi ja omenahapoksi sen jälkeen, kun akuutit pikkuaivoleikkeet on merkitty [1-13C]pyruvaatilla (paritettu t-testi; ** P <0,01). (E) Kattava aikakuluanalyysi ilmoitetusta reitistä. Ota huomioon vain proteiinit, joiden P < 0,05 8 viikon kuluttua. Katkoviiva: ei säätöarvoa (kaksisuuntainen varianssianalyysi; * P < 0,05; *** P < 0,001). Tiedot on ilmaistu keskiarvona ± SEM.
Analyysissämme haaroittuneiden aminohappojen (BCAA) kataboliasta on tullut yksi keskeisistä ylössäätelyreiteistä. Tämä viittaa vahvasti siihen, että TCA-sykliin tuleva ventilaatiotilavuus voi muuttua OXPHOS-puutteisessa neuropatiasolussa. Tämä voi edustaa merkittävää hermosolujen aineenvaihdunnan uudelleenjohdotuksen muotoa, jolla voi olla suora vaikutus hermosolujen fysiologiaan ja eloonjäämiseen vaikean OXPHOS-toimintahäiriön ylläpidon aikana. Tämän hypoteesin mukaisesti havaitsimme, että tärkein antiateroskleroottinen entsyymi PCx:n ilmentyminen lisääntyy (Mfn2cKO/CTRL muuttuu noin 1,5-kertaisesti; kuva 3A), mikä katalysoi pyruvaatin muuntumista oksaloasetaatiksi (28), jonka uskotaan olevan aivokudoksessa. Ilmentyminen rajoittuu astrosyytteihin (29, 30). Proteomiikkatulosten mukaisesti konfokaalimikroskopia osoitti, että PCx:n ilmentyminen lisääntyi spesifisesti ja merkittävästi OXPHOS-puutteisissa neuropatiasoluissa, kun taas PCx:n reaktiivisuus rajoittui pääasiassa viereisiin Bergmannin gliasoluihin kontrollissa (kuva 3B). Havaitun PCx:n lisääntyneen säätelyn toiminnalliseksi testaamiseksi käsittelimme akuutteja pikkuaivoleikkeitä [1-13C]pyruvaatti-merkkiaineella. Kun pyruvaatti hapettui pyruvaattidehydrogenaasilla (PDH), sen isotooppileima katosi, mutta se liitetään TCA-syklin välituotteisiin, kun pyruvaatti metaboloituu verisuonireaktioiden kautta (kuva 3D). Proteomiikkatietojemme tueksi havaitsimme suuren määrän tämän merkkiaineen markkereita Mfn2cKO-viipaleiden asparagiinihapossa, kun taas sitruunahapolla ja omenahapolla oli myös kohtalainen, vaikkakaan ei merkitsevä, trendi (kuva 3D).
MitoPark-hiirten dopamiinineuroneissa, joilla oli mitokondrioiden toimintahäiriö, jonka aiheutti dopamiinineuronit spesifisesti tuhoamalla mitokondriaalisen transkriptiotekijä A:n geenin (Tfam) (kuva S6B), PCx:n ilmentyminen oli myös merkittävästi lisääntynyt (31), mikä viittaa siihen, että asetonihappoarterioskleroosi. Taudin esiintymistä säädellään hermosolujen OXPHOS:n toimintahäiriön aikana kehossa. On syytä huomata, että on havaittu, että ainutlaatuiset entsyymit (32–34), joita voidaan ilmentää hermosoluissa, jotka voivat liittyä arterioskleroosiin, ovat merkittävästi lisääntyneet OXPHOS:n puuttuvissa hermosoluissa, kuten propionyyli-CoA-karboksylaasi (PCC-A), malonyyli-CoA muuntaa propionyyli-CoA:n sukkinyyli-CoA:ksi ja mitokondriaalinen malaattientsyymi 3 (ME3), jonka päätehtävänä on pyruvaatin talteenotto malaatista (kuva 3, A ja C) (33, 35). Lisäksi havaitsimme merkittävän lisääntymisen Pdk3-entsyymissä, joka fosforyloi ja siten inaktivoi PDH:n (36), kun taas Pdp1-entsyymissä, joka aktivoi PDH:n, tai itse PDH-entsyymikompleksissa ei havaittu muutoksia (kuva 3A). Johdonmukaisesti Mern2cKO-PN-soluissa Ser293:ssa sijaitsevan PDH-kompleksin pyruvaattidehydrogenaasi E1 -komponentin α1-alayksikön α (PDHE1α) fosforylaatio tehostui (kuva S6C). Pyruvaatilla ei ole verisuoniyhteyttä.
Lopuksi havaitsimme, että seriini- ja glysiinibiosynteesin superreitti, niihin liittyvä mitokondriaalinen folaattisykli (1C) ja proliinibiosynteesi (kuva 1G ja kuva S5C) ovat kaikki merkittävästi ylössäädeltyjä raporttien mukaan aktivaatioprosessin aikana. Ympäröivät kudokset aktivoituvat mitokondrioiden toimintahäiriön yhteydessä (5-7). Näitä proteomiikkatietoja tukeva konfokaalianalyysi osoitti, että OXPHOS:n puuttuessa PN:ssä 8 viikon ikäisten hiirien pikkuaivoleikkeisiin kohdistettiin seriinihydroksimetyylitransferaasi 2:ta (SHMT2), joka on mitokondriaalisen folaattisyklin keskeinen entsyymi. Merkittävä immuunivaste (kuva S5D). 13 CU-glukoosilla inkuboidussa akuutissa pikkuaivoleikkeessä aineenvaihduntajäljityskokeet vahvistivat edelleen seriinin ja proliinin biosynteesin ylössäätelyn, mikä osoittaa, että hiili-isoformien virtaus seriiniksi ja proliiniksi lisääntyi (kuva S5E). Koska GLS:n ja GPT2:n edistämät reaktiot vastaavat glutamaatin synteesistä glutamiinista ja glutamaatin ja α-ketoglutaraatin välisestä transaminaatiosta, niiden lisääntynyt ilmentyminen osoittaa, että OXPHOS-puutteisilla neuroneilla on lisääntynyt glutamaatin tarve. Tämä voi pyrkiä ylläpitämään proliinin lisääntynyttä biosynteesiä (kuva S5C). Näistä muutoksista poiketen PN-spesifisten Mfn2cKO-hiirten pikkuaivoastrosyyttien proteomiikka-analyysi osoitti, että näiden reittien (mukaan lukien kaikki antiperoksidaasit) ilmentyminen ei muuttunut merkittävästi, mikä osoittaa, että tämä metabolinen uudelleenohjaus on selektiivinen hajotetulle PN:lle (kuva S6, D - G).
Yhteenvetona voidaan todeta, että nämä analyysit paljastivat merkittävästi erilaisia ​​​​malleja spesifisten aineenvaihduntareittien ajallisessa aktivaatiossa hermosoluissa. Vaikka epänormaali hermosolujen mitokondrioiden toiminta voi johtaa varhaiseen ateroskleroosiin ja 1C-remodelointiin (kuva 3E ja kuva S5C) ja jopa ennustettaviin muutoksiin I- ja IV-kompleksien ilmentymisessä, muutokset seriini de novo -synteesissä ovat vain OXPHOS-toimintahäiriöitä (kuva 3E ja kuva S5C). Nämä löydökset määrittelevät peräkkäisen prosessin, jossa stressin aiheuttama mitokondrio (1C-sykli) ja sytoplasma (seriinibiosynteesi) reagoivat synergistisesti ateroskleroosin lisääntymisen kanssa TCA-syklissä muokkaaen hermosolujen aineenvaihduntaa.
Kahdeksan viikon ikäiset OXPHOS-puutteiset neuronukleaariset solut pystyvät ylläpitämään korkeataajuista viritysaktiivisuutta ja läpikäymään merkittävän metabolisen uudelleenkytkeytymisen kompensoidakseen mitokondrioiden toimintahäiriöitä. Tämä löytö herättää mielenkiintoisen mahdollisuuden, että jopa tällä hetkellä nämä solut saattavat saada terapeuttista interventiota neurodegeneraation viivästyttämiseksi tai estämiseksi. Ratkaisimme tämän mahdollisuuden kahdella toisistaan ​​riippumattomalla interventiolla. Ensimmäisessä menetelmässä suunnittelimme Cre-riippuvaisen adeno-assosioituneen viruksen (AAV) vektorin, jotta MFN2:ta voidaan selektiivisesti ilmentää OXPHOS-puutteisissa neuronukleaarisissa soluissa in vivo (kuva S7A). MFN2:ta koodaava AAV ja fluoresoiva reportterigeeni mCherry (Mfn2-AAV) varmistettiin primaarisissa hermosoluviljelmissä in vitro, mikä aiheutti MFN2:n ilmentymisen Cre-riippuvaisella tavalla ja pelasti mitokondrioiden morfologian, estäen siten neuromutaation Mfn2cKO-neuroneissa (kuva S7, B, D ja E). Seuraavaksi teimme in vivo -kokeita, joissa stereotaktisesti annostelimme 8 viikon ikäisiä Mfn2-AAV:ta Mfn2cKO- ja kontrollihiirten pikkuaivoaivokuoreen, ja analysoimme 12 viikon ikäisiä hiiriä (kuva 4A). Käsitellyt Mfn2cKO-hiiret kuolivat (kuva 1, A ja B) (16). Viruksen transduktio in vivo johti PN:n selektiiviseen ilmentymiseen joissakin pikkuaivorenkaissa (kuva S7, G ja H). Vain mCherryä ilmentävän kontrolli-AAV:n injektiolla (Ctrl-AAV) ei ollut merkittävää vaikutusta neurodegeneraation asteeseen Mfn2cKO-eläimillä. Sitä vastoin Mfn2-AAV:lla transdusoitujen Mfn2cKO-solujen analyysi osoitti PN-solukerroksen merkittävän suojaavan vaikutuksen (kuva 4, B ja C). Erityisesti hermosolujen tiheys näyttää olevan lähes erottamaton kontrollieläimistä (kuva 4, B ja C sekä kuva S7, H ja I). MFN1:n, mutta ei MFN2:n, ilmentyminen on yhtä tehokas hermosolujen kuoleman estämisessä (kuva 4C ja kuva S7, C ja F), mikä osoittaa, että ektooppisen MFN1:n ilmentyminen voi tehokkaasti korvata MFN2:n puutteen. Yksittäisen neuropatian tasolla tehty lisäanalyysi osoitti, että Mfn2-AAV suurelta osin korjasi mitokondrioiden ultrastruktuurin, normalisoi mitokondrioiden DNA:n tasot ja korjasi angiogeneesiä estävän markkerin PCx ​​-proteiinin korkean ilmentymisen (kuva 4, C-E). Lepotilassa olevien pelastettujen Mfn2cKO-hiirten visuaalinen tarkastelu osoitti, että niiden ryhti ja motoriset oireet (liikkeet S1-S3) paranivat. Yhteenvetona voidaan todeta, että nämä kokeet osoittavat, että MFN2:n viivästynyt palauttaminen neuropatiasoluihin, joista on vakava OXPHOS-puutos, riittää kääntämään mitokondrioiden DNA:n kulutuksen ja indusoimaan ateroskleroosin, estäen siten aksonien rappeutumisen ja hermosolujen kuoleman in vivo.
(A) Kaavio, joka esittää kokeellisen aikataulun MFN2:ta koodaavan AAV:n injektoimiseksi, kun osoitettu metaboliareitti on aktivoitunut. (B) Edustavat konfokaalikuvat 12 viikon ikäisistä pikkuaivoleikkeistä, jotka on transdusoitu 8 viikon iässä Mfn2cKO-hiiriin ja merkitty anti-Calbindin-vasta-aineella. Oikea: Aksonikuitujen skaalaus. Aksonizoomin skaala on 450 ja 75 μm. (C) Vasen: Purkinjen solutiheyden kvantifiointi AAV-transduktiosilmukassa (AAV+) (yksisuuntainen varianssianalyysi; n = 3 hiirtä). Oikea: mtDNA:n fokusanalyysi transdusoiduissa perifeerisissä soluissa viikolla 12 (parittamaton t-testi; n = 6 solua kolmelta hiireltä). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Edustavat transmissioelektronimikroskooppikuvat Mfn2cKO-pikkuaivoleikkeiden perifeerisistä soluista, jotka on transdusoitu osoitetuilla virusvektoreilla. Vaaleanpunainen maski kuvaa dendriittien käyttämää aluetta ja keltainen pisteviiva neliö kuvaa oikealla olevaa zoomausta; n edustaa tumaa. Skaalapalkki, 1 μm. (E) näyttää esimerkin PCx-värjäyksestä PN:ssä, joka on transdusoitu 12 viikon kohdalla. Skaalapalkki, 20 μm. OE, yliekspressio; FC, muutos kerroin.
Lopuksi tutkimme peroksidaasin indusoiman solujen eloonjäämisen merkitystä OXPHOS-toimintahäiriöitä kokeneilla perifeerisillä soluilla. Loimme mCherry-proteiinin, joka koodaa AAV-shRNA:ta (lyhyt hiuspinni-RNA), joka kohdistuu spesifisesti hiiren PCx-mRNA:han (AAV-shPCx), ja injektoimme virusta tai sen sekoitettua kontrollia (AAV-scr) Mfn2cKO-hiirten pikkuaivoihin. Injektio suoritettiin neljännen viikon iässä (kuva 5A), jotta PCx-geenin ilmentyminen saataisiin tehokkaasti alas aikana, jolloin PCx-geenin ilmentyminen lisääntyi (kuva 3C) ja perifeerinen solukerros oli vielä ehjä (kuva 1A). On syytä huomata, että PCx-geenin alasajo (kuva S8A) johtaa perifeeristen solujen kuoleman merkittävään kiihtymiseen, joka rajoittuu infektoituneeseen renkaaseen (kuva 5, B ja C). Ymmärtääksemme PCx-ylössäätelyn aiheuttamien metabolisten vaikutusten mekanismia, tutkimme PCx-ylössäätelyn aiheuttamien hermosolujen (PN) redox-statusta PCx-ylössäätelyn alasajon jälkeen ja AAV-välitteistä optista biosensoria Grx1-roGFP2 ilmennettiin samanaikaisesti (kuva S8, B-D) glutationin arvioimiseksi. Peptidiredox-potentiaalin suhteellinen muutos oli 38. Tämän jälkeen suoritimme kaksifotonisen fluoresenssi-elinaikakuvantamuskroskopian (FLIM) 7 viikon ikäisten Mfn2cKO-poikueiden tai kontrollipoikueiden akuuteissa aivoleikkeissä havaitaksemme mahdolliset muutokset sytoplasmisessa redox-statuksessa FLIM-olosuhteiden varmentamisen jälkeen (kuva S8, E-G). Analyysi osoitti merkittävää hapetusasteen nousua yksittäisillä Mfn2cKO-PN-soluilla, joilla ei ollut PCx-ilmentymistä. Tämä eroaa kontrollisoluista tai vain sekoitettua shRNA:ta ilmentävistä Mfn2cKO-PN-soluista (kuva 5, D ja E). Kun PCx-ilmentymistä säädettiin alaspäin, erittäin hapettunutta tilaa osoittavien Mfn2cKO-PN-molekyylien prosenttiosuus kasvoi yli kolme kertaa (kuva 5E), mikä osoittaa, että PCx-solujen ylössäätely säilytti degeneroituneiden hermosolujen redokskapasiteetin.
(A) Kaavio, joka esittää kokeellisen aikataulun shPCx:ää koodaavan AAV:n injektoimiseksi, kun osoitettu metaboliareitti on aktivoitunut. (B) Edustavat konfokaalikuvat 8 viikon ikäisistä Mfn2cKO-hiirten pikkuaivoleikkeistä, jotka on transdusoitu ja merkitty kalsineuriinivasta-aineella 4 viikon iässä. Skaalapalkki, 450 μm. (C) Purkinjen solutiheyden kvantifiointi AAV-transdusoiduissa silmukoissa (yksisuuntainen varianssianalyysi; n = 3-4 hiirtä). Tiedot on ilmaistu keskiarvona ± SEM; ***P < 0,001. (D) Edustava FLIM-kuva näyttää 7 viikon ikäisten glutationi-redox-sensoria Grx1-roGFP2 ilmentävien perifeeristen solulymfoomien keskimääräisen eliniän määritellyissä koeolosuhteissa. LUT (hakutaulukko) -suhde: eloonjäämisaika (pikosekunteina). Skaalapalkki, 25 μm. (E) Histogrammi näyttää Grx1-roGFP2:n elinajan arvojen jakauman (D):stä (n = 158 - 368 solua kahdessa hiiressä kussakin olosuhteessa). Kunkin histogrammin yläpuolella oleva ympyrädiagrammi näyttää niiden solujen lukumäärän, joilla on merkittävästi pidempi (punainen, hapettunut) tai lyhyempi (sininen, lyhentynyt) elinajan arvo, joka ylittää yhden keskihajontaa CTRL-AAV-scr:n keskimääräisestä elinajan arvosta. (F) Ehdotettu malli osoittaa hermosolujen PCx:n ylössäätelyn suojaavan vaikutuksen.
Kaiken kaikkiaan tässä esittämämme tiedot osoittavat, että MFN2:n uudelleen ilmentyminen voi täysin pelastaa pitkälle edenneen neuropatian, jossa on vaikea OXPHOS-puutos, vaikea mitokondriaalisen DNA:n ehtyminen ja erittäin epänormaali ista-tyyppinen morfologia, mikä mahdollistaa jatkuvan etenemisen jopa pitkälle edenneissä sairauksissa. Neurodegeneraatio tarjoaa palautuvan todistuksen solukuolemaa edeltävästä vaiheesta. Tätä metabolisen joustavuuden astetta korostaa entisestään neuronien kyky indusoida ateroskleroosia (TCA-syklin uudelleenjohdotus), mikä estää PCx:n ilmentymistä OXPHOS-puutteisissa neuropatiasoluissa ja lisää solukuolemaa, jolloin sillä on suojaava rooli (kuva 5F).
Tässä tutkimuksessa esitimme todisteita siitä, että hermosolujen vaste OXPHOS-toimintahäiriöön on vähitellen konvergoitua TCA-syklin ateroskleroosiin aineenvaihduntaohjelmien aktivoiman differentiaalisen aktivaatioreitin kautta. Vahvistimme proteomiikka-analyysin monilla täydentävillä menetelmillä ja paljastimme, että vakavan mitokondrioiden toimintahäiriön alaisena hermosoluilla on aiemmin tuntematon metabolisen elastisuuden muoto. Yllätykseksemme koko uudelleenjohdotusprosessi ei välttämättä merkitse neurodegeneraatioon vähitellen ja peruuttamattomasti liittyvää terminaalista metabolista tilaa, mutta tietomme viittaavat siihen, että se voi muodostaa ylläpitosolun jopa solukuolemaa edeltävässä vaiheessa (funktionaalinen kompensaatiomekanismi). Tämä havainto osoittaa, että hermosoluilla on huomattava metabolinen plastisuus kehossa. Tämä tosiasia todistaa, että MFN2:n myöhempi uudelleen käyttöönotto voi kääntää keskeisten aineenvaihduntamerkkien ilmentymisen ja estää hermosolujen rappeutumisen. Päinvastoin, se estää ateroskleroosia ja kiihdyttää hermoja. transseksuaali.
Yksi tutkimuksemme kiehtovimmista löydöksistä on, että OXPHOS:ia vailla olevat perifeeriset hermosolut voivat muuttaa TCA-syklin aineenvaihduntaa lisäämällä sellaisten entsyymien määrää, jotka spesifisesti stimuloivat arterioskleroosia. Aineenvaihdunnan uudelleenjärjestely on yleinen piirre syöpäsoluissa, joista jotkut tarvitsevat glutamiinia TCA-syklin välituotteiden täydentämiseen tuottaakseen pelkistäviä vastineita, jotka ohjaavat hengitysketjua ja ylläpitävät lipidi- ja nukleotidisynteesin esiasteiden tuotantoa (39, 40). Äskettäin tehdyssä tutkimuksessa osoitettiin, että OXPHOS-toimintahäiriöistä kärsivissä perifeerisissä kudoksissa glutamiini/glutamaattiaineenvaihdunnan uudelleenkytkeytyminen on myös merkittävä piirre (5, 41), jossa glutamiinin liittymisen suunta TCA-sykliin riippuu OXPHOS-vaurion vakavuudesta (41). Hermosolujen aineenvaihdunnan plastisuuden samankaltaisuudesta kehossa ja sen mahdollisesta merkityksestä sairauden yhteydessä ei kuitenkaan ole selkeää näyttöä. Äskettäisessä in vitro -tutkimuksessa osoitettiin, että primaariset aivokuoren hermosolut mobilisoivat glutamaattivarastoja hermovälitteiseen signaalinsiirtoon, mikä edistää oksidatiivista aineenvaihduntaa ja ateroskleroosia metabolisen stressin olosuhteissa (42). On syytä huomata, että TCA-syklin entsyymin sukkinaattidehydrogenaasin farmakologisen eston alaisena pyruvaattikarboksylaation uskotaan ylläpitävän oksaloasetaatin synteesiä viljellyissä pikkuaivojen jyväsneuroneissa (34). Näiden mekanismien fysiologinen merkitys aivokudokselle (jossa ateroskleroosin uskotaan rajoittuvan pääasiassa astrosyytteihin) on kuitenkin edelleen tärkeä (43). Tässä tapauksessa tietomme osoittavat, että OXPHOS:n vaurioittamat neuronukleaariset solut kehossa voidaan kytkeä haaroittuneiden aminohappojen (BCAA) hajottamiseen ja pyruvaattikarboksylaatioon, jotka ovat kaksi tärkeintä TCA-välituotteiden täydennyslähdettä. Vaikka haaroittuneiden aminohappojen katabolian oletettua vaikutusta hermosolujen energiametaboliaan on ehdotettu glutamaatin ja GABA:n roolin lisäksi hermovälitteisessä välityksessä (44), näistä mekanismeista ei ole vielä näyttöä in vivo. Siksi on helppo olettaa, että toimintahäiriöiset neuronukleaariset solut voivat automaattisesti kompensoida assimilaatioprosessin ohjaamaa TCA-välituotteiden kulutusta lisäämällä ateroskleroosia. Erityisesti PCx:n ylössäätelyä voidaan tarvita asparagiinihapon lisääntyneen kysynnän ylläpitämiseksi, mitä ehdotetaan mitokondrioiden toimintahäiriöistä kärsivissä proliferatiivisissa soluissa (45). Metabolomiikka-analyysimme ei kuitenkaan paljastanut merkittäviä muutoksia asparagiinihapon vakaan tilan tasossa Mfn2cKO-neuroneissa (kuva S6A), mikä oletettavasti heijastaa asparagiinihapon erilaista metabolista käyttöä proliferatiivisten solujen ja postmitoottisten neuronien välillä. Vaikka PCx:n ylössäätelyn tarkkaa mekanismia toimintahäiriöisissä neuroneissa in vivo on vielä karakterisoimatta, osoitimme, että tällä ennenaikaisella vasteella on tärkeä rooli neuronien redox-tilan ylläpitämisessä, mikä osoitettiin FLIM-kokeissa pikkuaivoleikkeillä. Erityisesti PCx:n ylössäätelyn estäminen voi johtaa hapettuneempaan tilaan ja nopeuttaa solukuolemaa. BCAA:n hajoamisen aktivointi ja pyruvaatin karboksylaatio eivät ole tapoja karakterisoida mitokondrioiden toimintahäiriöistä kärsiviä perifeerisiä kudoksia (7). Siksi ne näyttävät olevan OXPHOS-puutteisten neuronien ensisijainen ominaisuus, vaikkakaan ei ainoa ominaisuus, joka on tärkeä neurodegeneraatiolle.
Pikkuaivosairaus on heterogeeninen neurodegeneratiivinen sairaus, joka ilmenee yleensä ataksiana ja vaurioittaa usein perineuronaalisia hermosoluja (PN) (46). Tämä hermosolupopulaatio on erityisen altis mitokondrioiden toimintahäiriöille, koska niiden selektiivinen rappeutuminen hiirillä riittää toistamaan monia ihmisen spinocerebellaariselle ataksialle tyypillisiä motorisia oireita (16, 47, 48). Raporttien mukaan transgeeninen hiirimalli, jossa on mutanttigeeni, liittyy ihmisen spinocerebellaariseen ataksiaan ja sillä on mitokondrioiden toimintahäiriö (49, 50), mikä korostaa OXPHOS-puutoksen seurausten tutkimisen tärkeyttä PNPH:ssa. Siksi se on erityisen sopiva tämän ainutlaatuisen hermosolupopulaation tehokkaaseen eristämiseen ja tutkimiseen. Koska PN:t ovat kuitenkin hyvin herkkiä paineelle ja muodostavat pienen osan koko pikkuaivosolupopulaatiosta, niiden selektiivinen erottaminen kokonaisiksi soluiksi on edelleen haastava näkökohta monissa omiikkapohjaisissa tutkimuksissa. Vaikka muiden solutyyppien (erityisesti aikuisten kudosten) täydellinen kontaminaatiottomuus on lähes mahdotonta saavuttaa, yhdistimme tehokkaan dissosiaatiovaiheen FACS:iin saadaksemme riittävän määrän elinkelpoisia neuroneja myöhempää proteomiikka-analyysiä varten ja saavuttaaksemme melko korkean proteiinipeiton (noin 3000 proteiinia) verrattuna olemassa olevaan koko pikkuaivojen tietojoukkoon (51). Säilyttämällä kokonaisten solujen elinkelpoisuuden tässä tarjoamamme menetelmä mahdollistaa paitsi mitokondrioiden aineenvaihduntareittien muutosten tarkistamisen myös niiden sytoplasmisten vastineiden muutosten tarkistamisen, mikä täydentää mitokondriaalisten kalvomerkkien käyttöä solutyypin rikastamiseksi. Uusi menetelmä mitokondrioiden lukumäärän määrittämiseksi monimutkaisissa kudoksissa (52, 53). Kuvaamamme menetelmä ei liity ainoastaan ​​Purkinjen solujen tutkimukseen, vaan sitä voidaan helposti soveltaa minkä tahansa tyyppisiin soluihin sairaiden aivojen aineenvaihduntamuutosten tutkimiseksi, mukaan lukien muut mitokondrioiden toimintahäiriöiden mallit.
Lopuksi olemme tunnistaneet tämän aineenvaihdunnan uudelleenjärjestelyprosessin aikana terapeuttisen ikkunan, joka voi täysin kääntää solustressin keskeiset merkit ja estää hermosolujen rappeutumisen. Siksi tässä kuvatun uudelleenkytkeytymisen toiminnallisten vaikutusten ymmärtäminen voi tarjota perustavanlaatuista tietoa mahdollisista hoidoista hermosolujen elinkelpoisuuden ylläpitämiseksi mitokondrioiden toimintahäiriön aikana. Tarvitaan tulevaa tutkimusta, jolla pyritään erittelemään energia-aineenvaihdunnan muutoksia muissa aivosolutyypeissä, jotta tämän periaatteen sovellettavuus muihin neurologisiin sairauksiin voidaan täysin paljastaa.
MitoPark-hiiriä on kuvattu aiemmin (31). C57BL/6N-hiiriä, joilla on loxP-geeniä reunustavia Mfn2-geenejä, on kuvattu aiemmin (18), ja niitä on risteytetty L7-Cre-hiirten kanssa (23). Tuloksena olevat kaksoisheterotsygoottiset jälkeläiset risteytettiin sitten homotsygoottisten Mfn2loxP/Mfn2loxP-hiirten kanssa Purkinjen spesifisten Mfn2-geenin poistogeenien aikaansaamiseksi (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Osassa paritteluista Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP-alleeli (stop-mtYFP) lisättiin lisäristeytysten kautta (20). Kaikki eläinkokeet suoritettiin eurooppalaisten, kansallisten ja institutionaalisten ohjeiden mukaisesti, ja ne hyväksyi LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen, Saksa. Eläintyössä noudatetaan myös European Federation of Laboratory Animal Sciences Associationsin ohjeita.
Raskaana olevan naisen kohdunkaulan sijoiltaanmenon nukutuksen jälkeen hiiren alkio eristettiin (E13). Aivokuori dissektioitiin Hanksin tasapainotetussa suolaliuoksessa (HBSS), johon oli lisätty 10 mM Hepesiä, ja kuljetettiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-elatusaineessa, johon oli lisätty papaiinia (20 U/ml) ja kysteiiniä (1 μg/ml). Kudos inkuboitiin DMEM-elatusaineessa (Ml) ja erotettiin se entsymaattisella pilkkomisella (DMEM). Solut kylvettiin polylysiinillä päällystetyille lasipeitelaseille tiheydellä 2 × 106 solua 6 cm:n viljelymaljaa kohden tai tiheydellä 0,5 × 105 solua/cm2 kuvantamisanalyysiä varten. Neljän tunnin kuluttua elatusaine korvattiin seerumittomalla Neurobasal-elatusaineella, joka sisälsi 1 % B27-lisää ja 0,5 mM GlutaMaxia. Neuronien lämpötilaa pidettiin 37 °C:ssa ja 5 % CO2-atmosfäärissä koko kokeen ajan, ja niitä ruokittiin kerran viikossa. Rekombinaation indusoimiseksi in vitro seuraavaa AAV9-virusvektoria käytettiin neuronien hoitoon toisena päivänä in vitro 3 μl:lla (24-kuoppainen viljelymalja) tai 0,5 μl:lla (24-kuoppainen levy): AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene, luettelonumero 105530-AAV9) ja AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, luettelonumero 105545-AAV9).
Hiiren Mfn1- ja Mfn2-komplementaariset DNA:t (saatu vastaavasti Addgene-plasmideista #23212 ja #23213) on merkitty V5-sekvenssillä (GKPIPNPLLGLDST) C-terminaalissa ja fuusioitu mCherryyn lukukehyksessä T2A-sekvenssin kautta. Grx1-roGFP2 on lahja Heidelberg TP Dick DFKZ:lta (Deutsches Krebsforschungszentrum). Korvaamalla tdTomato-kasetti tavanomaisilla kloonausmenetelmillä kasetti subkloonattiin pAAV-CAG-FLEX-tdTomato-runkoon (Addgene-viitenumero 28306) pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5-, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5- ja pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2-vektorien luomiseksi. Samankaltaista strategiaa käytettiin kontrollivektorin pAAV-CAG-FLEX-mCherry luomiseen. AAV-shPCx-konstruktin luomiseksi tarvitaan plasmidi-AAV-vektori (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), joka sisältää hiiren PCx:ään kohdistuvaa shRNA:ta koodaavan DNA-sekvenssin (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). U6-promoottorin säätelemänä käytetään mCherryä CMV-promoottorin säätelemänä. AAV-apuvektorien tuotanto suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti (Cell Biolabs). Lyhyesti sanottuna, käytä siirtoplasmidia, joka sisältää mCherry-T2A-MFN2-V5:n (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5:n (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) tai Grx-roGFP2:n (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) koodaavan geenin, sekä koodaavan AAV1-kapsidiproteiinin ja apuproteiinin pakkausplasmidiplasmidin kalsiumfosfaattimenetelmällä. Raaka virussupernatantti saatiin pakastus-sulatussykleillä kuivajää/etanolihauteessa ja lysoitiin solut fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS). AAV-vektori puhdistettiin epäjatkuvalla jodiksanoligradienttiultrasentrifugoinnilla (24 tuntia nopeudella 32 000 rpm ja 4 °C:ssa) ja konsentroitiin Amicon ultra-15 -keskipakosuodattimella. AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5:n genomitiitteri [2,9 × 1013 genomikopiota (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherryn (6,1 × 1012 GC/ml) ja AAV1-CAG-FLEXin genomitiitteri oli aiemmin kuvatun mukainen (54), mitattuna reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR:llä (qPCR) -MFN1-V5 (1,9 × 1013 GC/ml) ja AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9 × 1012 GC/ml).
Primaariset neuronit kaavittiin pois jääkylmässä 1x PBS:ssä, pelletoitiin ja homogenisoitiin sitten 0,5 % Triton X-100 / 0,5 % natriumdeoksikolaatti/PBS-lyysipuskurissa, joka sisälsi fosfataasia ja proteaasi-inhibiittoria (Roche). Proteiinien kvantifiointi suoritettiin käyttämällä bikinkoniinihappomääritystä (Thermo Fisher Scientific). Proteiinit eroteltiin sitten SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja blotattiin sitten polyvinylideenifluoridikalvolle (GE Healthcare). Estä epäspesifiset kohdat ja inkuboi primaarisen vasta-aineen kanssa (katso yksityiskohdat taulukosta S1) 5 % maidossa TBST:ssä (Tris-puskuroitu suolaliuos Tweenillä), pesuvaiheet ja sekundaarisen vasta-aineen kanssa TBST-inkubaatiossa. Inkuboitiin primaarisen vasta-aineen kanssa yön yli +4 °C:ssa. Pesun jälkeen sekundaarinen vasta-aine levitettiin 2 tunniksi huoneenlämmössä. Myöhemmin inkuboimalla sama blotti anti-β-aktiini-vasta-aineen kanssa varmistettiin sama lataus. Detektio muuntamalla kemiluminesenssiksi ja tehostamalla kemiluminesenssia (GE Healthcare).
Lasisille peitinlaseille aiemmin kylvetyt neuronit fiksoitiin 4 % paraformaldehydillä (PFA)/PBS:llä määritettynä ajankohtana huoneenlämmössä 10 minuutin ajan. Peitelasit läpäistään ensin 0,1 % Triton X-100/PBS:llä 5 minuutin ajan huoneenlämmössä ja sitten estopuskurissa [3 % naudan seerumin albumiinia (BSA)/PBS]. Toisena päivänä peitinlasit pestiin estopuskurilla ja inkuboitiin sopivan fluoroforikonjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa 2 tunnin ajan huoneenlämmössä; lopuksi näytteet pestiin huolellisesti PBS:ssä, jossa oli 4',6-diamidino-2-fenyyli-indolia (DAPI), vastavärjättiin ja fiksoitiin sitten mikroskooppilasilevylle Aqua-Poly/Mount-värillä.
Hiiret (uros- ja naaraspuoliset) nukutettiin antamalla vatsaontelonsisäisesti ketamiinia (130 mg/kg) ja ksylatsiinia (10 mg/kg) ja ihon alle karprofeenikipulääkettä (5 mg/kg). Hiiret asetettiin stereotaktiseen instrumenttiin (Kopf), jossa oli lämmin tyyny. Kallo paljastettiin ja hammasporalla ohennettiin pikkuaivokuoren osaa, joka vastaa pikkuluuta (lambdasta: häntä 1.8, lateraalinen 1, vastaa lobuluksia IV ja V). Kalloon tehtiin varovasti pieni reikä kaarevalla ruiskuneulalla, jotta alla oleva verisuonisto ei vaurioidu. Sitten ohut lasinen kapillaari työnnettiin hitaasti mikroreikään (-1.3:sta -1:een kovakalvon vatsapuolella), ja mikroinjektoriin (Narishige) ruiskutettiin manuaalisilla ruiskuilla (Narishige) useita kertoja alhaisella paineella 10–20 minuutin aikana. Infuusion jälkeen kapillaari asetetaan vielä 10 minuutiksi, jotta virus leviää kokonaan. Kun kapillaarit on poistettu, iho ommellaan huolellisesti haavan tulehduksen minimoimiseksi ja eläimen toipumisen mahdollistamiseksi. Eläimiä hoidettiin kipulääkkeillä (kaspofeeni) useita päiviä leikkauksen jälkeen, jonka aikana niiden fyysistä kuntoa seurattiin tarkasti, ja sitten ne lopetettiin ilmoitettuna ajankohtana. Kaikki toimenpiteet suoritettiin eurooppalaisten, kansallisten ja institutionaalisten ohjeiden mukaisesti, ja ne oli hyväksynyt LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen, Saksa.
Eläimet nukutettiin ketamiinilla (100 mg/kg) ja ksylatsiinilla (10 mg/kg), ja sydän perfusoitiin ensin 0,1 M PBS:llä ja sitten 4 % PFA:lla PBS:ssä. Kudos dissektioitiin ja fiksoitiin 4 % PFA/PBS:ssä yön yli 4 °C:ssa. Värähtelevällä veitsellä (Leica Microsystems GmbH, Wien, Itävalta) valmistettiin sagittaaliset leikkeet (50 μm paksut) fiksoiduista aivoista PBS:ssä. Ellei toisin mainita, vapaasti kelluvien leikkeiden värjäys suoritettiin edellä kuvatulla tavalla (13) huoneenlämmössä ja sekoittaen. Lyhyesti sanottuna saadut viipaleet permeabilisoitiin ensin 0,5 % Triton X-100/PBS:llä 15 minuutin ajan huoneenlämmössä; joidenkin epitooppien (Pcx ja Shmt2) kohdalla tris-EDTA-puskurissa 80 °C:ssa (pH 9) ja viipaleita lämmitettiin 25 minuuttia tämän vaiheen sijaan. Seuraavaksi leikkeitä inkuboitiin primaarisen vasta-aineen (katso taulukko S1) kanssa estopuskurissa (3 % BSA/PBS) 4 °C:ssa yön yli sekoittaen. Seuraavana päivänä leikkeet pestiin estopuskurilla ja inkuboitiin sopivan fluoroforikonjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa 2 tuntia huoneenlämmössä; lopuksi leikkeet pestiin huolellisesti PBS:ssä, vastavärjättiin DAPI:lla ja fiksoitiin sitten AquaPolymountilla mikroskooppilasilla.
Näytteen kuvantamiseen käytettiin laserskannauskonfokaalimikroskooppia (TCS SP8-X tai TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems), joka oli varustettu valkoisella valolaserilla ja 405-diodiultraviolettilaserilla. LAS-X-ohjelmistolla kerättiin pinottuja kuvia Nyquist-näytteenoton mukaisesti peräkkäisessä tilassa virittämällä fluorofori ja keräämällä signaali hybrididetektorilla (HyDs): ei-kvantitatiivisissa paneeleissa kyseessä ovat erittäin dynaamiset signaalit (esimerkiksi somaattisissa soluissa ja dendriiteissä) (mtYFP). HyD:tä käytetään PN-solujen lukumäärän havaitsemiseen BrightR-tilassa. Taustan vähentämiseksi käytetään 0,3–6 ns:n portoitusta.
Lajiteltujen solujen reaaliaikainen kuvantaminen. Lajittelun jälkeen Neurobasal-A-elatusaineessa, joka sisälsi 1 % B27-lisää ja 0,5 mM GlutaMaxia, solut kylvettiin välittömästi poly-l-lysiinillä päällystetyille lasilevyille (μ-Slide8 Well, Ibidi, luettelonumero 80826). Sen jälkeen niitä pidettiin 37 °C:ssa ja 5 % CO2:ssa yhden tunnin ajan, jotta solut saivat asettua. Reaaliaikainen kuvantaminen suoritettiin Leica SP8 -laserpyyhkäisykonfokaalimikroskoopilla, joka oli varustettu valkoisella laserilla, HyD:llä, 63×[1,4 numeerisen aukon (NA)] öljyobjektiivilla ja lämmityspöydällä.
Hiiri nukutettiin nopeasti hiilidioksidilla ja dekapitoitiin, aivot irrotettiin nopeasti kallosta ja leikattiin 200 μm:n paksuisiksi (13C-leimauskoetta varten) tai 275 μm:n paksuisiksi (kahta fotonikoetta varten) sagittaalisiksi leikkeiksi, jotka täytettiin seuraavilla aineilla. Jäätelö (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Saksa) täytettiin seuraavilla aineilla: 125 mM jääkylmää, hiilikyllästettyä (95 % O2 ja 5 % CO2), vähän kalsiumia sisältävää keinotekoista aivo-selkäydinnestettä (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfaattipuskuria, 25 mM NaHCO3, 25 mM glukoosia, 0,5 mM CaCl2 ja 3,5 mM MgCl2 (osmoottinen paine 310–330 mmol). Siirrä saadut aivosiivut esiinkubaatiokammioon, joka sisältää korkeamman Ca2-pitoisuuden omaavaa ACSF:ää (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfaattipuskuria, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukoosia, 1,0 mM CaCl2 ja 2,0 mM MgCl2), pH 7,4 ja 310–320 mmol.
Kuvantamisprosessin aikana viipaleet siirrettiin kuvantamishuoneeseen, ja koe suoritettiin jatkuvassa ACSF-perfuusiossa 32–33 °C:n vakiolämpötilassa. Viipaleiden kuvantamiseen käytettiin monifotonilaserpyyhkäisymikroskooppia (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems), joka oli varustettu Leica 25x objektiivilla (NA 0,95, vesi) ja titaanisafiirilaserilla (Chameleon Vision II, Coherent). FLIM-moduuli (PicoHarp300, PicoQuant).
Grx1-roGFP2:n FLIM. PN-solujen sytoplasmisen redox-tilan muutoksia mitattiin kahden fotonin FLIMillä sagittaalisissa aivoleikkeissä, joissa Grx1-roGFP2-biosensori kohdisti PN-soluihin. PN-kerroksessa hankintakenttä valitaan noin 50–80 μm leikkeen pinnan alapuolelle sen varmistamiseksi, että PN on elinkelpoinen (eli ei ole helmimäistä rakennetta tai neuronaalisia morfologisia muutoksia dendriiteillä) ja että kaksoispositiivinen roGFP2-sensori ja AAV:ta koodaava shRNA PCx tai sen kontrollisekvenssi (kumpikin ilmentää yhdessä mCherryä) ovat läsnä. Kerää yksipinokuvia 2x digitaalisella zoomilla [viritysaallonpituus: 890 nm; 512 nm 512 pikseliä]. Detektio: sisäinen HyD, fluoreskeiini-isotiosyanaatti (FITC) -suodatinryhmä ja kuvien keskiarvoistus 2–3 minuutin kuluessa varmistavat, että kerätään riittävästi fotoneja (yhteensä 1000 fotonia) käyrän sovitusta varten. Grx1-roGFP2-koettimen herkkyyttä ja FLIM-olosuhteiden varmennusta tehtiin seuraamalla roGFP2:n elinikää, kun perfuusio-ACSF:ään lisättiin eksogeenistä 10 mM H2O2:ta (hapettumisen maksimoimiseksi, mikä pidentää elinikää) ja sitten lisättiin 2 mM ditiotreitolia (minimoi pelkistymisen asteen, mikä lyhentää elinikää) (kuva S8, D–G). Analysoi saadut tulokset FLIMfit 5.1.1 -ohjelmistolla, sovita koko kuvan yksittäinen eksponentiaalinen hajoamiskäyrä mitattuun IRF:ään (instrumentin vastefunktio), ja χ2 on noin 1. Yksittäisen PN:n eliniän laskemiseksi piirrettiin manuaalisesti maski hermorungon ympärille ja kunkin maskin keskimääräistä elinikää käytettiin kvantifiointiin.
Mitokondriopotentiaalin analyysi. Kun akuuttia leikettä oli inkuboitu suoraan perfusoituun ACSF:ään lisätyn 100 nM TMRM:n kanssa 30 minuutin ajan, PN-solujen mitokondriopotentiaalin muutokset mitattiin kaksoisfotonimikroskoopilla. TMRM-kuvantaminen suoritettiin virittämällä koetin 920 nm:ssä ja käyttämällä sisäistä HyD:tä (tetrametyylirodamiini-isotiosyanaatti: 585/40 nm) signaalien keräämiseen; käyttäen samaa viritysaallonpituutta, mutta eri sisäistä HyD:tä (FITC: 525/50) mtYFP:n kuvaamiseen. Käytä ImageJ:n Image Calculator -laajennusta mitokondriopotentiaalin arvioimiseen yksittäisten solujen tasolla. Lyhyesti sanottuna laajennusyhtälöä: signaali = min (mtYFP, TMRM) käytetään tunnistamaan mitokondrioalue, joka osoittaa TMRM-signaalin Purkinjen somalissa vastaavan kanavan yksipinoisessa konfokaalikuvassa. Sitten tuloksena olevan maskin pikselialue kvantifioidaan ja normalisoidaan sitten mtYFP-kanavan vastaavaan kynnysarvoiseen yksipinoiseen kuvaan, jotta saadaan mitokondriopotentiaalia osoittava mitokondriofraktio.
Kuva dekonvoluutioitiin Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) -ohjelmistolla. Skannattujen laattakuvien osalta yksittäisen laatan montaasi tehdään LAS-X-ohjelmiston automaattisella nidonta-algoritmilla. Kuvan kalibroinnin jälkeen kuvaa käsitellään edelleen ImageJ:llä ja Adobe Photoshopilla, ja kirkkaus ja kontrasti säädetään tasaisesti. Graafiseen esikäsittelyyn käytetään Adobe Illustratoria.
mtDNA-kohdeanalyysi. mtDNA-vaurioiden lukumäärä kvantifioitiin konfokaalimikroskoopilla pikkuaivoleikkeistä, jotka oli merkitty DNA:ta vastaan ​​​​suunnatuilla vasta-aineilla. Jokainen kohdealue luotiin kunkin solun solurunkoa ja tumaa varten, ja vastaava alue laskettiin Multi Measure -laajennuksella (ImageJ-ohjelmisto). Vähennä tuman alue solurunkoalueesta saadaksesi sytoplasmisen alueen. Lopuksi Analyze Particles -laajennusta (ImageJ-ohjelmisto) käytettiin mtDNA:ta osoittavien sytoplasmisten DNA-pisteiden automaattiseen kvantifiointiin kynnysarvokuvassa, ja saadut tulokset normalisoitiin CTRL-hiirten PN-keskiarvoon. Tulokset ilmaistaan ​​​​keskimääräisenä nukleosidien lukumääränä solua kohden.
Proteiinien ilmentymisen analyysi. Käytä ImageJ:n Image Calculator -laajennusta arvioidaksesi proteiinien ilmentymistä PN:ssä yksittäisten solujen tasolla. Lyhyesti sanottuna vastaavan kanavan yksikerroksisessa konfokaalikuvassa yhtälön signaali = min (mtYFP, vasta-aine) avulla tunnistetaan mitokondriaalinen alue, joka osoittaa immunoreaktiivisuutta tietylle Purkinan vasta-aineelle. Sitten tuloksena olevan maskin pikselipinta-ala kvantifioidaan ja normalisoidaan mtYFP-kanavan vastaavaan kynnysarvoon perustuvaan yksipinokuvaan, jotta saadaan näytetyn proteiinin mitokondriaalinen osuus.
Purkinjen solujen tiheysanalyysi. Purkinjen tiheys arvioitiin ImageJ:n Cell Counter -laajennuksella jakamalla laskettujen Purkinjen solujen lukumäärä laskettujen solujen täyttämän pikkuaivorenkaan pituudella.
Näytteen valmistus ja kerääminen. Kontrolliryhmän ja Mfn2cKO-hiirten aivot fiksoitiin 2 % PFA:ssa/2,5 % glutaraldehydissä 0,1 M fosfaattipuskurissa (PB), ja sitten koronaaleikkeet valmistettiin ripsieläimillä (Leica Mikrosysteme GmbH, Wien, Itävalta) (paksuus 50–60 μm). Tämän jälkeen leikkeet fiksoitiin PB-puskurissa, jossa oli 1 % os-tetraoksidia ja 1,5 % kaliumferrosyanidia, huoneenlämmössä 1 tunnin ajan. Leikkeet pestiin kolme kertaa tislatulla vedellä ja värjättiin sitten 70 % etanolilla, joka sisälsi 1 % uranyyliasetaattia, 20 minuutin ajan. Sitten leikkeet kuivattiin asteittaisessa alkoholissa ja upotettiin Durcupan ACM (Araldite casting hartsi M) -epoksihartsiin (Electron Microscopy Sciences, luettelonumero 14040) silikonipäällysteisten lasilevyjen väliin ja lopuksi polymeroitiin uunissa 60 °C:ssa 48 tuntia. Pikkuaivojen kuorialue valittiin ja siitä leikattiin 50 nm:n ohuet leikkausmateriaalit Leica Ultracut -värimaalilla (Leica Mikrosysteme GmbH, Wien, Itävalta) ja poimittiin 2 × 1 mm:n kupariselle rakohiekalle, joka oli päällystetty polystyreenikalvolla. Leikkeet värjättiin 4 % uranyyliasetaatin liuoksella vedessä 10 minuutin ajan, pestiin useita kertoja vedellä, sitten Reynoldsin lyijysitraatilla vedessä 10 minuutin ajan ja lopuksi useita kertoja vedellä. Mikrokuvaukset otettiin Philips CM100 -läpäisyelektronimikroskoopilla (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) käyttäen TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 -digitaalikameraa (TVIPS GmbH, Gauting, USA, Saksa).
AAV-tartunnan saaneiden hiirten aivot erotettiin ja leikattiin 1 mm:n paksuisiksi sagittaalisiksi paloiksi, ja pikkuaivoja tutkittiin fluoresenssimikroskoopilla AAV-tartunnan saaneen renkaan (eli mCherryä ilmentävän renkaan) tunnistamiseksi. Käytettiin vain kokeita, joissa AAV-injektio johti erittäin korkeaan Purkinjen solukerroksen (eli lähes koko kerroksen) transduktiotehokkuuteen vähintään kahdessa peräkkäisessä pikkuaivorenkaassa. AAV-transdusoitu silmukka mikrodissektoitiin yön yli fiksaation jälkeen (4 % PFA:ta ja 2,5 % glutaraldehydiä 0,1 M kokoaattipuskurissa) ja käsiteltiin edelleen. EPON-upotusta varten kiinnitetty kudos pestiin 0,1 M natriumkokoaattipuskurilla (Applichem) ja inkuboitiin 2 % OsO4:n (os, Science Services; Caco) kanssa 0,1 M natriumkokoaattipuskurissa (Applichem) 4 tuntia, minkä jälkeen pestiin 2 tuntia. Toistettiin 3 kertaa 0,1 M kokamidipuskurilla. Seuraavaksi etanoliliuosta inkuboitiin nousevalla sarjalla 4 °C:ssa 15 minuuttia kudoksen kuivaamiseksi. Kudos siirrettiin propyleenioksidiin ja inkuboitiin yön yli EPON-liuoksessa (Sigma-Aldrich) 4 °C:ssa. Kudos asetettiin tuoreeseen EPON-liuokseen huoneenlämmössä kahdeksi tunniksi ja upotettiin sitten 62 °C:seen 72 tunniksi. Leikkaa ultramikrotomilla (Leica Microsystems, UC6) ja timanttiveitsellä (Diatome, Biel, Sveitsi) 70 nm:n ohuet leikkeet ja värjää ne 1,5 % uranyyliasetaatilla 15 minuuttia 37 °C:ssa ja lyijysitraattiliuoksella 4 minuuttia. Elektronimikroskooppikuvat otettiin JEM-2100 Plus -läpäisyelektronimikroskoopilla (JEOL), joka oli varustettu Camera OneView 4K 16-bittisellä (Gatan) ja DigitalMicrograph-ohjelmistolla (Gatan). Analyysiä varten elektronimikroskooppikuvat otettiin 5000× tai 10 000× digitaalisella zoomilla.
Mitokondrioiden morfologinen analyysi. Kaikissa analyyseissä yksittäisten mitokondrioiden ääriviivat piirrettiin manuaalisesti digitaalisiin kuviin ImageJ-ohjelmistolla. Analysoitiin erilaisia ​​morfologisia parametreja. Mitokondrioiden tiheys ilmaistaan ​​prosentteina, jotka saadaan jakamalla kunkin solun mitokondrioiden kokonaispinta-ala sytoplasman pinta-alalla (sytoplasman pinta-ala = solun pinta-ala - solun tuman pinta-ala) × 100. Mitokondrioiden pyöreys lasketaan kaavalla [4π∙(pinta-ala/kehä 2)]. Mitokondrioiden morfologinen analyysi ja jaettiin kahteen luokkaan ("putkimainen" ja "rakkula") niiden pääasiallisen muodon mukaan.
Autofagosomien/lysosomien lukumäärän ja tiheyden analyysi. Käytä ImageJ-ohjelmistoa piirtääksesi manuaalisesti kunkin autofagosomin/lysosomin ääriviivat digitaaliseen kuvaan. Autofagosomien/lysosomien pinta-ala ilmaistaan ​​prosentteina, jotka lasketaan jakamalla kunkin solun autofagosomien/lysosomien kokonaisrakennepinta-ala sytoplasman pinta-alalla (sytoplasman pinta-ala = solun pinta-ala - tuman pinta-ala) × 100. Autofagosomien/lysosomien tiheys lasketaan jakamalla kokonaismäärä autofagosomien/lysosomien rakenteiden lukumäärällä solua kohden (sytoplasman pinta-alan suhteen) (sytoplasman pinta-ala = solun pinta-ala - tuman pinta-ala).
Akuutin leikkauksen ja näytteenvalmistuksen merkitseminen. Kokeissa, jotka vaativat glukoosimerkintää, siirrä akuutit aivoleikkeet esiinkubaatiokammioon, joka sisältää kylläistä hiiltä (95 % O2 ja 5 % CO2), runsaasti Ca2+ -pitoista ACSF:ää (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfaattipuskuria, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukoosia, 1,0 mM CaCl2 ja 2,0 mM MgCl2, pH säädetty arvoon 7,4 ja 310–320 mOsm), jossa glukoosia 13C6-glukoosikorvataan (Eurisotop, luettelonumero CLM-1396). Kokeissa, jotka vaativat pyruvaattileimausta, siirrä akuutit aivoleikkeet korkeampaan Ca2 + ACSF:ään (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfaattipuskuri, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukoosi, 1,0 mM CaCl2 ja lisää 2,0 mM MgCl2, säädä pH-arvoon 7,4 ja 310–320 mOsm), ja lisää 1 mM 1-[1-13C]pyruvaattia (Eurisotop, luettelonumero CLM-1082). Inkuboi leikkeitä 90 minuuttia 37 °C:ssa. Kokeen lopussa leikkeet pestiin nopeasti vesiliuoksella (pH 7,4), joka sisälsi 75 mM ammoniumkarbonaattia, ja homogenisoitiin sitten 40:40:20 (v:v:v) asetonitriili (ACN): metanoli: vesi -seoksessa. Kun leikkeitä oli inkuboitu jäillä 30 minuuttia, näytteet sentrifugoitiin 21 000 g:n voimalla 10 minuuttia 4 °C:ssa ja kirkas supernatantti kuivattiin SpeedVac-konsentraattorissa. Tuloksena oleva kuivattu metaboliittipelletti säilytettiin -80 °C:ssa analyysiin asti.
13C-leimattujen aminohappojen nestekromatografia-massaspektrometria-analyysi. Nestekromatografia-massaspektrometria-analyysiä (LC-MS) varten metaboliittipelletti suspendoitiin uudelleen 75 μl:aan LC-MS-laatuista vettä (Honeywell). Sentrifugoinnin jälkeen 21 000 g:llä 5 minuutin ajan 4 °C:ssa 20 μl kirkastettua supernatanttia käytettiin aminohappovirtausanalyysiin, kun taas loput uutteesta käytettiin välittömästi anionianalyysiin (katso alla). Aminohappoanalyysi suoritettiin aiemmin kuvatun bentsoyylikloridin derivatisointiprotokollan avulla (55, 56). Ensimmäisessä vaiheessa 10 μl 100 mM natriumkarbonaattia (Sigma-Aldrich) lisättiin 20 μl:aan metaboliittiuutetta, ja sitten 10 μl 2 % bentsoyylikloridia (Sigma-Aldrich) lisättiin LC-laatuiseen ACN:ään. Näytettä vorteksoitiin lyhyesti ja sentrifugoitiin sitten 21 000 g:llä 5 minuutin ajan 20 °C:ssa. Siirrä kirkas supernatantti 2 ml:n automaattisen näytteenottajan injektiopulloon, jossa on kartiomainen lasisisäke (tilavuus 200 μl). Näytteet analysoitiin Acquity iClass erittäin tehokkaalla LC-järjestelmällä (Waters), joka oli kytketty Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) -korkean resoluution tarkkuusmassaspektrometriin (Thermo Fisher Scientific). Analyysiä varten 2 μl derivatisoitua näytettä injektoitiin 100 × 1,0 mm:n lujaan piidioksidi-T3-kolonniin (Waters), joka sisälsi 1,8 μm:n hiukkasia. Virtausnopeus on 100 μl/min, ja puskurijärjestelmä koostuu puskurista A (10 mM ammoniumformiaattia ja 0,15 % muurahaishappoa vedessä) ja puskurista B (ACN). Gradientti on seuraava: 0 %B 0 minuutissa; 0 %B:tä, 0–15 % B 0–0,1 minuutissa; 15–17 % B 0,1–0,5 minuutissa; B 17–55 %:ssa 0,5–14 minuutissa; B 55–70 %:ssa 14–14,5 minuutissa; 14,5–70–100 %:ssa B 18 minuutissa; 100 % B 18–19 minuutissa; 100–0 % B 19–19,1 minuutissa; 0 % B 19,1–28 minuutissa (55, 56). QE-HF-massaspektrometri toimii positiivisessa ionisaatiotilassa ja massa-alue m/z (massa/varaus-suhde) on 50–750. Käytetty resoluutio on 60 000, ja vahvistuksen säädöllä (AGC) saatu ionikohde on 3×106, ja suurin ioniaika on 100 millisekuntia. Lämmitetty sähkösuihkutusionisaatiolähde (ESI) toimii 3,5 kV:n ruiskutusjännitteellä, 250 °C:n kapillaarilämpötilalla, 60 AU:n (satunnaiset yksiköt) vaippailmavirtauksella ja 20 AU:n apuilmavirtauksella. 250 °C. S-linssi on asetettu arvoon 60 AU.
13C-leimattujen orgaanisten happojen anionikromatografia-MS-analyysi. Jäljelle jäänyt metaboliittisakka (55 μl) analysoitiin Dionex-ionikromatografiajärjestelmällä (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific), joka oli kytketty QE-HF-massaspektrometriin (Thermo Fisher Scientific). Lyhyesti sanottuna 5 μl metaboliittiuutetta injektoitiin Dionex IonPac AS11-HC -kolonniin, joka oli varustettu HPLC:llä (2 mm × 250 mm, hiukkaskoko 4 μm, Thermo Fisher Scientific) push-in-osittaisen silmukan tilassa täyttösuhteella 1. Dionex IonPac AG11-HC -suojakolonni (2 mm x 50 mm, 4 μm, Thermo Fisher Scientific). Kolonnin lämpötila pidetään 30 °C:ssa ja automaattinen näytteenotin asetetaan 6 °C:seen. Käytä kaliumhydroksidipatruunaa, joka on varustettu deionisoidulla vedellä, kaliumhydroksidigradientin luomiseksi eluenttigeneraattorin läpi. Metaboliittien erottelu virtausnopeudella 380 μl/min käyttäen seuraavaa gradienttia: 0–3 minuuttia, 10 mM KOH; 3–12 minuuttia, 10–50 mM KOH; 12–19 minuuttia, 50–100 mM KOH; 19–21 minuuttia, 100 mM KOH; 21–21,5 minuuttia, 100–10 mM KOH. Kolonni tasapainotettiin uudelleen 10 mM KOH:lla 8,5 minuutin ajan.
Eluoidut metaboliitit yhdistetään kolonnin jälkeen 150 μl/min isopropanolilisävirtaan ja johdetaan sitten negatiivisessa ionisaatiotilassa toimivaan korkean resoluution massaspektrometriin. MS seuraa massa-aluetta m/z 50:stä 750:een 60 000:n resoluutiolla. AGC on asetettu arvoon 1×106 ja suurin ioniaika pidetään 100 ms:ssa. Lämmitettyä ESI-lähdettä käytettiin 3,5 kV:n ruiskutusjännitteellä. Ionilähteen muut asetukset ovat seuraavat: kapillaarilämpötila 275 °C; suojakaasun virtaus 60 AU; apukaasun virtaus 20 AU 300 °C:ssa ja S-linssin asetus 60 AU:hun.
13C-leimattujen metaboliittien data-analyysi. Käytä TraceFinder-ohjelmistoa (versio 4.2, Thermo Fisher Scientific) isotooppisuhteen data-analyysiin. Kunkin yhdisteen identiteetti varmistettiin luotettavalla referenssiyhdisteellä ja analysoitiin itsenäisesti. Isotooppirikastusanalyysin suorittamiseksi kunkin 13C-isotoopin (Mn) uutetun ionikromatogrammin (XIC) pinta-ala uutettiin [M + H]+:sta, jossa n on kohdeyhdisteen hiililuku, jota käytetään aminohappojen analysointiin tai [MH]+:aa käytetään anionien analysointiin. XIC:n massatarkkuus on alle viisi miljoonasosaa ja RT:n tarkkuus on 0,05 minuuttia. Rikastusanalyysi suoritetaan laskemalla kunkin havaitun isotoopin suhde vastaavan yhdisteen kaikkien isotooppien summaan. Nämä suhteet annetaan prosentuaalisina arvoina kullekin isotoopille, ja tulokset ilmaistaan ​​mooliprosenttisena rikastuksena (MPE), kuten aiemmin on kuvattu (42).
Jäätynyt hermosolupelletti homogenisoitiin jääkylmässä 80-prosenttisessa metanolissa (v/v), vorteksoitiin ja inkuboitiin -20 °C:ssa 30 minuuttia. Sekoita näytettä uudelleen vorteksissa ja sekoita +4 °C:ssa 30 minuuttia. Näyte sentrifugoitiin 21 000 g:llä 5 minuuttia 4 °C:ssa, ja sitten syntynyt supernatantti kerättiin ja kuivattiin SpeedVac-konsentraattorilla 25 °C:ssa myöhempää analyysia varten. Kuten edellä on kuvattu, LC-MS-analyysi suoritettiin lajiteltujen solujen aminohapoille. Käyttämällä TraceFinder-ohjelmistoa (versio 4.2, Thermo Fisher Scientific) data-analyysi suoritettiin käyttämällä kunkin yhdisteen monoisotooppimassaa. Metaboliittidatan kvantiilinormalisointi suoritettiin käyttämällä preprocessCore-ohjelmistopakettia (57).
Leikkeiden valmistus. Hiiri nukutettiin nopeasti hiilidioksidilla ja dekapitoitiin, aivot irrotettiin nopeasti kallosta ja jäällä täytetyllä värähtelevällä veitsellä (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Saksa) leikattiin 300–375 μm:n sagittaalisiksi leikkeiksi. Kylmä hiilikaasutus (95 % O2 ja 5 % CO2), matala Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfaattipuskuri, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukoosi, 1,0 mM CaCl2 ja 6,0 mM MgCl2, pH säädettiin arvoon 7,4 ja paine 310–330 mOsm). Siirrä saadut aivoleikkeet kammioon, joka sisältää korkeamman Ca2-pitoisuuden omaavaa ACSF:ää (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfaattipuskuria, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukoosia, 4,0 mM CaCl2 ja mM 3,5 MgCl2, pH 7,4 ja 310–320 mOsm). Säilytä leikkeita 20–30 minuuttia, jotta ne voidaan palauttaa ennen rekisteröintiä.
tallennus. Kaikissa tallenteissa käytettiin kiinteällä tallennuskamarilla ja 20-kertaisella vesi-immersio-objektiivilla (Scientifica) varustettua mikroskooppipöytää. Oletetut Purkinjen solut tunnistettiin (i) ruumiinkoon, (ii) pikkuaivojen anatomisen sijainnin ja (iii) fluoresoivan mtYFP-reportterigeenin ilmentymisen perusteella. 5–11 megaohmin kärjen resistanssin omaava pipetti vedettiin ulos borosilikaattilasikapillaarilla (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Saksa) ja vaakasuoralla pipetilla Instruments (P-1000, Sutter), Novato, Kalifornia). Kaikki tallenteet tehtiin ELC-03XS npi -laastaripuristinvahvistimella (npi electronic GmbH, Tam, Saksa), jota ohjattiin Signal-ohjelmistolla (versio 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Iso-Britannia). Koe tallennettiin 12,5 kHz:n näytteenottotaajuudella. Signaali suodatetaan kahdella lyhytpäästö-Bessel-suodattimella, joiden katkaisutaajuudet ovat vastaavasti 1,3 ja 10 kHz. Kalvon ja pipetin kapasitanssi kompensoidaan kompensointipiirillä vahvistimen avulla. Kaikki kokeet tehtiin Orca-Flash 4.0 -kameran (Hamamatsu, Gerden, Saksa) ohjauksessa, jota ohjattiin Hokawo-ohjelmistolla (versio 2.8, Hamamatsu, Gerden, Saksa).
Rutiininomainen kokonaisten solujen konfigurointi ja analyysi. Välittömästi ennen mittausta pipetti täytetään sisäisellä liuoksella, joka sisältää seuraavat aineet: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM kaliumglukonaatti, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg2+), 0,5 mM guanosiinitrifosfaatti (GTP) (Na2+) ja 10,0 mM kreatiniinifosfaatti, pH säädettiin arvoon 7,25 ja osmoottinen paine oli 290 mOsm (sakkaroosi). Välittömästi 0 pA:n voiman kohdistamisen jälkeen kalvon lepopotentiaali mitattiin. Tulovastus mitataan käyttämällä hyperpolarisoituja virtoja -40, -30, -20 ja -10 pA. Mittaa jännitevasteen suuruus ja laske tulovastus Ohmin lain avulla. Spontaani aktiivisuus tallennettiin jännitepihdillä viiden minuutin ajan, ja sPSC tunnistettiin ja mitattiin Igor Prolla (versio 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) käyttäen puoliautomaattista tunnistusskriptiä. IV-käyrä ja tasapainovirta mitattiin kytkemällä akku eri potentiaaleihin (alkaen -110 mV:sta) ja lisäämällä jännitettä 5 mV:n askelin. AP:n tuotanto testattiin käyttämällä depolarisoivaa virtaa. Kytke kenno -70 mV:iin samalla, kun syötetään depolarisoivaa virtapulssia. Säädä kunkin tallennusyksikön askelkokoa erikseen (10-60 pA). Laske AP:n maksimitaajuus laskemalla manuaalisesti pulssipiikit, jotka aiheuttavat suurimman AP-taajuuden. AP-kynnys analysoidaan käyttämällä sen depolarisaatiopulssin toista derivaattaa, joka ensimmäisenä laukaisee yhden tai useamman AP:n.
Rei'itetyn laastarin konfigurointi ja analyysi. Suorita rei'itetyn laastarin rekisteröinti standardiprotokollia käyttäen. Käytä ATP- ja GTP-vapaata pipettiä, joka ei sisällä seuraavia ainesosia: 128 mM glukonaatti K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA ja 2 mM MgCl2, ja säädä pH-arvoon 7,2 (käyttäen KOH:ta). ATP ja GTP jätetään pois solunsisäisestä liuoksesta solukalvon hallitsemattoman läpäisevyyden estämiseksi. Laastaripipetti täytetään amfoterisiinia sisältävällä sisäisellä liuoksella (noin 200–250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) rei'itetyn laastarin rekisteröintiä varten. Amfoterisiini liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (loppupitoisuus: 0,1–0,3 %; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Käytetyllä DMSO-pitoisuudella ei ollut merkittävää vaikutusta tutkittuihin neuroneihin. Lävistysprosessin aikana kanavan resistanssia (Ra) seurattiin jatkuvasti, ja koe aloitettiin Ra:n ja AP:n amplitudin vakiintumisen jälkeen (20–40 minuuttia). Spontaani aktiivisuus mitataan jännite- ja/tai virtapihdillä 2–5 minuutin ajan. Data-analyysi suoritettiin Igor Prolla (versio 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excelillä (versio 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) ja GraphPad Prismillä (versio 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Yhdysvallat. Spontaanien AP:iden tunnistamiseen käytetään IgorPron NeuroMatic v3.0c -laajennusta. AP:t tunnistetaan automaattisesti käyttämällä tiettyä kynnysarvoa, jota säädetään erikseen kullekin tietueelle. Piikkivälin avulla määritetään piikkitaajuus, hetkellisen piikkitaajuuden maksimiarvo ja keskimääräinen piikkitaajuus.
PN-eristys. Sovellettaessa aiemmin julkaistua protokollaa, PN-solut puhdistettiin hiiren pikkuaivoista tietyssä vaiheessa (58). Lyhyesti sanottuna pikkuaivot dissektioitiin ja hienonnettiin jääkylmässä dissosiaatioliuoksessa [ilman HBSS:n Ca2+- ja Mg2+-liuoksia, täydennettynä 20 mM glukoosia, penisilliiniä (50 U/ml) ja streptomysiiniä (0,05 mg/ml)], ja sitten liuos digestoitiin papaiinilla [HBSS, täydennettynä 1-kysteiini·HCl:lla (1 mg/ml), papaiinilla (16 U/ml) ja deoksiribonukleaasi I:llä (DNase I; 0,1 mg/ml)]. Käsiteltiin 30 minuuttia 30 °C:ssa. Pese ensin kudokset huoneenlämmössä HBSS-elatusaineessa, joka sisältää kananmunan limaa (10 mg/ml), BSA:ta (10 mg/ml) ja DNaasia (0,1 mg/ml) entsymaattisen pilkkoutumisen estämiseksi, ja sitten 20 mM glukoosia sisältävässä HBSS-elatusaineessa. Jauhamalla varovasti HBSS:ään, penisilliiniin (50 U/ml), streptomysiiniin (0,05 mg/ml) ja DNaasiin (0,1 mg/ml) yksittäisiä soluja. Tuloksena oleva solususpensio suodatettiin 70 μm:n solusuodattimen läpi, minkä jälkeen solut pelletoitiin sentrifugoimalla (1110 rpm, 5 minuuttia, 4 °C) ja suspendoitiin uudelleen lajitteluelatusaineeseen [HBSS, täydennettynä 20 mM glukoosilla, 20 % naudan sikiön seerumilla, penisilliinillä (50 U/ml) ja streptomysiinillä (0,05 mg/ml)]. Arvioi solujen elinkykyisyys propidiumjodidilla ja säädä solutiheys arvoon 1 × 106 – 2 × 106 solua/ml. Ennen virtaussytometriaa suspensio suodatettiin 50 μm:n solusuodattimen läpi.
Virtaussytometri. Solujen lajittelu suoritettiin 4 °C:ssa käyttäen FACSAria III -laitetta (BD Biosciences) ja FACSDiva-ohjelmistoa (BD Biosciences, versio 8.0.1). Solususpensio lajiteltiin käyttämällä 100 μm:n suutinta 20 psi:n paineessa nopeudella ~2800 tapahtumaa/s. Koska perinteiset tahdistuskriteerit (solukoko, bimodaalinen erottelu ja sirontaominaisuudet) eivät voi taata PN:n oikeaa eristämistä muista solutyypeistä, tahdistusstrategia asetetaan mitoYFP+ ​​​​- ja kontrolli-mitoYFP− -hiirten YFP-intensiteetin ja autofluoresenssin suoran vertailun perusteella. YFP viritetään säteilyttämällä näytettä 488 nm:n laserlinjalla, ja signaali havaitaan käyttämällä 530/30 nm:n kaistanpäästösuodatinta. MitoYFP+ ​​​​-hiirissä Rosa26-mitoYFP-reportterigeenin suhteellista voimakkuutta käytetään myös hermosolukappaleiden ja aksonifragmenttien erottamiseen. 7-AAD viritetään 561 nm:n keltaisella laserilla ja detektoidaan 675/20 nm:n kaistanpäästösuodattimella kuolleiden solujen erottamiseksi. Astrosyyttien samanaikaiseksi erottamiseksi solususpensio värjättiin ACSA-2-APC:llä, minkä jälkeen näytettä säteilytettiin 640 nm:n laserlinjalla ja signaalin havaitsemiseen käytettiin 660/20 nm:n kaistanpäästösuodatinta.
Kerätyt solut pelletoitiin sentrifugoimalla (1110 rpm, 5 minuuttia, 4 °C) ja säilytettiin -80 °C:ssa käyttöön asti. Mfn2cKO-hiiret ja niiden pentueet luokitellaan samana päivänä menetelmällisen vaihtelun minimoimiseksi. FACS-tietojen esitys ja analyysi suoritettiin FlowJo-ohjelmistolla (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Kuten edellä mainittiin (59), reaaliaikaista PCR:ää käytetään DNA:n eristämiseen lajitelluista neuroneista myöhempää mitokondriaalisen DNA:n kvantifiointia varten. Lineaarisuus ja kynnysherkkyys testattiin aluksi ajamalla qPCR eri solumäärille. Lyhyesti sanottuna, kerätään 300 PN:ää lysispuskuriin, joka koostuu 50 mM tris-HCl:stä (pH 8,5), 1 mM EDTA:sta, 0,5 % Tween 20:stä ja proteinaasi K:sta (200 ng/ml), ja inkuboidaan 55 °C:ssa 120 minuuttia. Soluja inkuboitiin edelleen 95 °C:ssa 10 minuuttia proteinaasi K:n täydellisen inaktivoinnin varmistamiseksi. Käyttämällä mt-Nd1:lle spesifistä TaqMan-koetinta (Thermo Fisher), mitokondriaalinen DNA mitattiin semi-kvantitatiivisella PCR:llä 7900HT Real-Time PCR -järjestelmässä (Thermo Fisher Scientific). Science, luettelonumero Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, luettelonumero AIVI3E8) ja 18S (Thermo Fisher Scientific, luettelonumero Hs99999901_s1) geenit.
Proteominäytteen valmistus. Lämmitä liuosta 95 °C:ssa 10 minuuttia ja sonikoimalla se lysispuskurissa [6 M guanidiinikloridia, 10 mM tris(2-karboksietyyli)fosfiinihydrokloridia, 10 mM klooriasetamidia ja 100 mM tris-Lyse-pakastetut neuronipelletit HCl:ssa]. Bioruptorilla (Diagenode) 10 minuuttia (30 sekunnin pulssi / 30 sekunnin tauko). Näyte laimennettiin suhteessa 1:10 20 mM tris-HCl:lla (pH 8,0), sekoitettiin 300 ng:aan trypsiinikultaa (Promega) ja inkuboitiin yön yli 37 °C:ssa täydellisen pilkkomisen saavuttamiseksi. Toisena päivänä näyte sentrifugoitiin 20 000 g:llä 20 minuuttia. Supernatantti laimennettiin 0,1 % muurahaishapolla ja liuoksesta poistettiin suola itse tehdyillä StageTip-tipeillä. Näyte kuivattiin SpeedVac-laitteella (Eppendorf-konsentraattori plus 5305) 45 °C:ssa, ja sitten peptidi suspendoitiin 0,1 % muurahaishappoon. Sama henkilö valmisteli kaikki näytteet samanaikaisesti. Astrosyyttinäytteiden analysointia varten 4 μg suolattomia peptidejä merkittiin tandemmassamerkillä (TMT10plex, luettelonumero 90110, Thermo Fisher Scientific) peptidin ja TMT-reagenssin suhteessa 1:20. TMT-leimausta varten 0,8 mg TMT-reagenssia suspendoitiin uudelleen 70 μl:aan vedetöntä ACN:ää, ja kuivattu peptidi liuotettiin 9 μl:aan 0,1 M TEAB:tä (trietyyliammoniumbikarbonaattia), johon lisättiin 7 μl TMT-reagenssia ACN:ssä. Pitoisuus oli 43,75 %. 60 minuutin inkuboinnin jälkeen reaktio sammutettiin 2 μl:lla 5 % hydroksyyliamiinia. Leimatut peptidit kerättiin, kuivattiin, suspendoitiin uudelleen 200 μl:aan 0,1-prosenttista muurahaishappoa (FA), jaettiin kahteen osaan ja sitten suolanpoisto tehtiin itse tehtyjen StageTip-kärkien avulla. Käyttäen UltiMate 3000 -ultra-korkean suorituskyvyn nestekromatografiaa (UltiMate 3000 ultra-korkean suorituskyvyn nestekromatografi), toinen puoliskoista fraktioitiin 1 mm x 150 mm:n Acquity-kromatografiakolonnilla, joka oli täytetty 130 Å1,7 μm:n C18-hiukkasilla (Waters, luettelonro SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific. Erota peptidit virtausnopeudella 30 μl/min, erota 1 %:sta 50 %:iin puskuria B 85 minuutin ajan 96 minuutin porrastetulla gradientilla, 50 %:sta 95 %:iin puskuria B 3 minuutin ajan, sitten 8 minuuttia 95 %:iin puskuria B käyttäen; Puskuri A on 5 % ACN:ää ja 10 mM ammoniumbikarbonaattia (ABC), ja puskuri B on 80 % ACN:ää ja 10 mM ABC:tä. Kerää fraktiot 3 minuutin välein ja yhdistä ne kahteen ryhmään (1 + 17, 2 + 18 jne.) ja kuivaa ne tyhjösentrifugissa.
LC-MS/MS-analyysi. Massaspektrometriaa varten peptidit (numero r119.aq) erotettiin 25 cm:n, 75 μm:n sisähalkaisijaltaan olevalla PicoFrit-analyysikolonnilla (uusi objektiivi, osanumero PF7508250), joka oli varustettu 1,9 μm:n ReproSil-Pur 120 C18-AQ -elatusaineella (Dr. Maisch, mat), käyttö: EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Saksa). Kolonnin lämpötila pidettiin 50 °C:ssa. Puskurit A ja B ovat 0,1 % muurahaishappoa vedessä ja 0,1 % muurahaishappoa 80 % ACN:ssä. Peptidit erotettiin 6 %:sta 31 %:iin puskurissa B 65 minuutin ajan ja 31 %:sta 50 %:iin puskurissa B 5 minuutin ajan gradientilla 200 nl/min. Eluoidut peptidit analysoitiin Orbitrap Fusion -massaspektrometrillä (Thermo Fisher Scientific). Peptidiesiasteen m/z-mittaus suoritetaan 120 000 resoluutiolla alueella 350–1500 m/z. Käyttämällä 27 %:n normalisoitua törmäysenergiaa valitaan voimakkain esiaste, jonka varaustila on 2–6, korkeaenergiseen C-ansan dissosiaatioon (HCD). Sykliaika on asetettu 1 sekuntiin. Peptidifragmentin m/z-arvo mitattiin ioniloukussa käyttämällä pienintä AGC-kohdetta 5×104 ja enimmäisinjektioaikaa 86 ms. Fragmentoinnin jälkeen esiaste asetettiin dynaamiselle poissulkemislistalle 45 sekunniksi. TMT-leimatut peptidit erotettiin 50 cm:n, 75 μm:n Acclaim PepMap -kolonnilla (Thermo Fisher Scientific, luettelonumero 164942), ja migraatiospektrit analysoitiin Orbitrap Lumos Tribrid -massaspektrometrillä (Thermo Fisher Scientific), joka oli varustettu FAIMS-laitteistolla (Thermo Fisher Scientific). Laitteisto toimii kahdella kompensointijännitteellä, −50 ja −70 V. Synkronointiprekursorin perusteella valittua MS3:a käytetään TMT-raportti-ionisignaalin mittaukseen. Peptidien erotus suoritettiin EASY-nLC 1200 -laitteella käyttäen 90 %:n lineaarista gradienttieluointia ja puskuripitoisuuden ollessa 6 % - 31 %; puskuri A oli 0,1 % FA:ta ja puskuri B oli 0,1 % FA:ta ja 80 % ACN:ää. Analyysikolonnia käytetään 50 °C:ssa. Käytä FreeStyle-ohjelmistoa (versio 1.6, Thermo Fisher Scientific) jakaaksesi alkuperäisen tiedoston FAIMS-kompensointijännitteen mukaan.
Proteiinin tunnistus ja kvantifiointi. Alkuperäiset tiedot analysoitiin MaxQuant-ohjelman versiolla 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) käyttäen integroitua Andromeda-hakukonetta. Aequorea victoriasta saatujen Cre-rekombinaasi- ja YFP-sekvenssien lisäksi peptidifragmenttispektreistä etsittiin hiiren referenssiproteomin (proteiinin tunnus UP000000589, ladattu UniProtista toukokuussa 2017) kanoninen sekvenssi ja isoformisekvenssi. Metioniinin hapetus ja proteiinin N-terminaalinen asetylaatio asetettiin muuttuviksi modifikaatioiksi; kysteiinikarbamoyylimetylaatio asetettiin kiinteiksi modifikaatioiksi. Pilkkomisparametrit asetettiin arvoihin "spesifisyys" ja "trypsiini/P". Proteiinin tunnistamiseen käytettyjen peptidien ja partakonepeptidien vähimmäismäärä on 1; ainutlaatuisten peptidien vähimmäismäärä on 0. Peptidikarttojen yhteensovitusolosuhteissa proteiinien tunnistusprosentti oli 0,01. "Toinen peptidi" -vaihtoehto on käytössä. Käytä "yhteensopivuus ajojen välillä" -vaihtoehtoa siirtääksesi onnistuneita tunnistuksia eri alkuperäisten tiedostojen välillä. Käytä LFQ-minimisuhdelukua 1 leimaamattomaan kvantifiointiin (LFQ) (60). LFQ-intensiteetti suodatetaan vähintään kahdelle kelvolliselle arvolle vähintään yhdessä genotyyppiryhmässä kullakin aikapisteellä ja ekstrapoloidaan normaalijakaumasta, jonka leveys on 0,3 ja jota siirretään alaspäin 1,8. Käytä Perseus-laskenta-alustaa (https://maxquant.net/perseus/) ja R-ohjelmaa (https://r-project.org/) LFQ-tulosten analysointiin. Differentiaaliekspressioanalyysissä käytettiin Limma-ohjelmistopaketin kaksisuuntaista kohtalaista t-testiä (61). Eksploratiivinen data-analyysi suoritetaan käyttämällä ggplot-, FactoMineR-, factoextra-, GGally- ja pheatmap-ohjelmia. TMT-pohjainen proteomiikkadata analysoitiin käyttämällä MaxQuant-versiota 1.6.10.43. Hae raakaa proteomiikkadataa UniProtin ihmisen proteomiikkatietokannasta, joka ladattiin syyskuussa 2018. Analyysi sisältää valmistajan toimittaman isotooppipuhtauden korjauskertoimen. Käytä limmaa R:ssä differentiaalisen ilmentymisen analyysiin. Alkuperäiset tiedot, tietokannan hakutulokset sekä data-analyysin työnkulku ja tulokset tallennetaan ProteomeXchange-allianssiin PRIDE-kumppanirepositorion kautta datajoukkotunnuksella PXD019690.
Funktionaaliset merkinnät rikastuttavat analyysia. Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) -työkalua käytettiin määrittämään datajoukon funktionaalisten annotaatiotermien rikkaus 8 viikon kohdalla (kuva 1). Lyhyesti sanottuna LC-MS/MS (tandem-massaspektrometria) -data-analyysistä saatua kvantitatiivista proteiiniluetteloa käytetään seuraavilla suodatuskriteereillä: Lajiksi ja taustaksi valitaan Mus musculus, ja kategoria osoittaa Benjaminin korjaaman P-arvon, jossa rikastusarvoa 0,05 tai sitä alhaisempaa pidetään merkittävänä. Tässä kaaviossa on esitetty kunkin klusterin viisi suurinta ylimääräkategoriaa korjatun P-arvon perusteella. Käyttämällä usean t-testin menetelmää ja Benjaminin, Kriegerin ja Yekutielin kaksivaiheista lineaarista tehostusohjelmaa (Q = 5 %), kussakin kategoriassa tunnistetuille tärkeille ehdokkaille suoritetaan aikakulun proteiinien ilmentymisen analyysi, ja jokainen rivi analysoidaan erikseen. Johdonmukaista keskihajontaa ei tarvitse käyttää.
Jotta voisimme verrata tämän tutkimuksen tuloksia julkaistuihin tietokantoihin ja luoda kuvassa 1 esitetyn Venn-diagrammin, yhdistimme kvantitatiivisen proteiiniluettelon MitoCarta 2.0 -annotaatioihin (24). Käytämme kaavion luomiseen verkkotyökalua Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/).
Yksityiskohtaisia ​​tietoja proteomiikka-analyysissä käytetyistä tilastollisista menetelmistä on vastaavassa Materiaalit ja menetelmät -osiossa. Kaikkien muiden kokeiden yksityiskohtaiset tiedot löytyvät vastaavista selitteistä. Ellei toisin mainita, kaikki tiedot on ilmaistu keskiarvona ± SEM, ja kaikki tilastolliset analyysit tehtiin GraphPad Prism 8.1.2 -ohjelmistolla.
Tämän artikkelin lisämateriaaleja on osoitteessa http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Tämä on avoimen saatavuuden artikkeli, joka on jaettu Creative Commons Nimeä-EiKaupallinen -lisenssin ehtojen mukaisesti. Tämä lisenssi sallii käytön, jakelun ja kopioinnin missä tahansa mediassa, kunhan lopullinen käyttö ei ole kaupallista hyötyä varten ja lähtökohtana on, että alkuperäinen teos on oikein. Viite.
Huomautus: Pyydämme sinua antamaan sähköpostiosoitteesi vain, jotta sivulle suosittelemasi henkilö tietää, että haluat hänen näkevän sähköpostin ja että se ei ole roskapostia. Emme tallenna sähköpostiosoitteita.
Tätä kysymystä käytetään testaamaan, oletko vierailija, ja estämään automaattinen roskapostin lähetys.
Kirjailija: E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Toimintahäiriöisten hermosolujen proteomiikka-analyysi paljasti, että aineenvaihduntaohjelmat aktivoituvat neurodegeneraation torjumiseksi.
Kirjailija: E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Toimintahäiriöisten hermosolujen proteomiikka-analyysi paljasti, että aineenvaihduntaohjelmat aktivoituvat neurodegeneraation torjumiseksi.
©2020 American Association for Advanced of Science. kaikki oikeudet pidätetään. AAAS on HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ja COUNTER kumppani. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.