Kiitos, että kävit Nature.com-sivustolla. Käyttämäsi selainversio tukee CSS:ää rajoitetusti. Parhaan tuloksen saavuttamiseksi suosittelemme, että käytät uudempaa selainversiota (tai poistat yhteensopivuustilan käytöstä Internet Explorerissa). Sillä välin näytämme sivuston ilman tyylittelyä tai JavaScriptiä jatkuvan tuen varmistamiseksi.
Propionihappoa (PPA) käytetään tutkimaan mitokondrioiden toimintahäiriöiden roolia neurologisissa kehityshäiriöissä, kuten autismin kirjon häiriössä. PPA:n tiedetään häiritsevän mitokondrioiden biosynteesiä, aineenvaihduntaa ja vaihtuvuutta. PPA:n vaikutukset mitokondrioiden dynamiikkaan, fissioon ja fuusioon ovat kuitenkin edelleen ongelmallisia näiden mekanismien monimutkaisen ajallisen luonteen vuoksi. Tässä tutkimuksessa käytämme täydentäviä kvantitatiivisia kuvantamistekniikoita tutkiaksemme, miten PPA vaikuttaa mitokondrioiden ultrastruktuuriin, morfologiaan ja dynamiikkaan hermosolujen kaltaisissa SH-SY5Y-soluissa. PPA (5 mM) aiheutti merkittävän mitokondrioiden pinta-alan (p < 0,01), Feretin halkaisijan ja ympärysmitan (p < 0,05) sekä pinta-alan 2 (p < 0,01) pienenemisen. Mitokondrioiden tapahtumalokaattorianalyysi osoitti merkittävää lisääntymistä (p < 0,05) fissio- ja fuusiotapahtumissa, mikä säilytti mitokondrioverkoston eheyden stressiolosuhteissa. Lisäksi cMYC:n (p < 0,0001), NRF1:n (p < 0,01), TFAM:n (p < 0,05), STOML2:n (p < 0,0001) ja OPA1:n (p < 0,05) mRNA:n ilmentyminen oli merkittävästi vähentynyt. 01). Tämä havainnollistaa mitokondrioiden morfologian, biogeneesin ja dynamiikan uudelleenmuotoutumista toiminnan ylläpitämiseksi stressiolosuhteissa. Tietomme tarjoavat uutta tietoa PPA:n vaikutuksista mitokondrioiden dynamiikkaan ja korostavat kuvantamistekniikoiden hyödyllisyyttä mitokondrioiden stressivasteisiin liittyvien monimutkaisten säätelymekanismien tutkimisessa.
Mitokondriot ovat olennainen osa useissa solutoiminnoissa tyypillisten energiantuotannon ja biosynteesin rooliensa lisäksi. Mitokondrioiden aineenvaihdunta on keskeinen kalsiumsignaloinnin, aineenvaihdunnan ja redoksihomeostaasin, tulehdussignaloinnin, epigeneettisten modifikaatioiden, solujen lisääntymisen, erilaistumisen ja ohjelmoidun solukuoleman säätelijä1. Mitokondrioiden aineenvaihdunta on erityisesti kriittinen hermosolujen kehitykselle, selviytymiselle ja toiminnalle, ja sillä on laajalti yhteys neuropatologian erilaisiin ilmentymiin2,3,4.
Viimeisen vuosikymmenen aikana aineenvaihdunnan tilasta on tullut keskeinen neurogeneesin, erilaistumisen, kypsymisen ja plastisuuden säätelijä5,6. Viime aikoina mitokondrioiden morfologiasta ja dynamiikasta on tullut erityisen tärkeitä komponentteja mitoosissa, dynaamisessa prosessissa, joka ylläpitää terveiden mitokondrioiden määrää soluissa. Mitokondrioiden dynamiikkaa säätelevät monimutkaiset, toisistaan ​​riippuvat reitit, jotka vaihtelevat mitokondrioiden biogeneesistä ja bioenergetiikasta mitokondrioiden fissioon, fuusioon, kuljetukseen ja puhdistumaan7,8. Minkä tahansa näistä integroivista mekanismeista häiriintyminen heikentää terveiden mitokondrioverkostojen ylläpitoa ja sillä on syvällisiä toiminnallisia seurauksia neurologiselle kehitykselle9,10. Mitokondrioiden dynamiikan säätelyhäiriöitä havaitaankin monissa psykiatrisissa, neurodegeneratiivisissa ja neurologisen kehityksen häiriöissä, mukaan lukien autismin kirjon häiriöt (ASD)11,12.
ASD on heterogeeninen neurologinen kehityshäiriö, jolla on monimutkainen geneettinen ja epigeneettinen arkkitehtuuri. ASD:n periytyvyys on kiistaton, mutta taustalla olevaa molekyylitason etiologiaa ymmärretään edelleen huonosti. Prekliinisistä malleista, kliinisistä tutkimuksista ja multi-omiikka-molekyyliaineistoista kertyvä data antaa yhä enemmän näyttöä mitokondrioiden toimintahäiriöistä ASD:ssä13,14. Aiemmin suoritimme genominlaajuisen DNA-metylaatioseulonnan ASD-potilaiden kohortissa ja tunnistimme eri tavoin metyloituneita geenejä, jotka olivat ryhmittyneet mitokondrioiden aineenvaihduntareittien varrelle15. Myöhemmin raportoimme mitokondrioiden biogeneesin ja dynamiikan keskussäätelijöiden eriytyneestä metylaatiosta, joka liittyi lisääntyneeseen mito-DNA:n kopiomäärään ja muuttuneeseen virtsan aineenvaihduntaprofiiliin ASD:ssä16. Datamme antavat yhä enemmän näyttöä siitä, että mitokondrioiden dynamiikalla ja homeostaasilla on keskeinen rooli ASD:n patofysiologiassa. Siksi mitokondrioiden dynamiikan, morfologian ja toiminnan välisen suhteen mekanistisen ymmärtämisen parantaminen on keskeinen tavoite meneillään olevassa tutkimuksessa, joka koskee neurologisia sairauksia, joille on ominaista sekundaarinen mitokondrioiden toimintahäiriö.
Molekyylitekniikoita käytetään usein tutkimaan tiettyjen geenien roolia mitokondrioiden stressivasteissa. Tätä lähestymistapaa voivat kuitenkin rajoittaa mitoosin säätelymekanismien monitahoinen ja ajallinen luonne. Lisäksi mitokondrioiden geenien erilainen ilmentyminen on epäsuora indikaattori toiminnallisista muutoksista, varsinkin kun tyypillisesti analysoidaan vain rajallinen määrä geenejä. Siksi on ehdotettu suorempia menetelmiä mitokondrioiden toiminnan ja bioenergetiikkaan tutkimiseksi17. Mitokondrioiden morfologia liittyy läheisesti mitokondrioiden dynamiikkaan. Mitokondrioiden muoto, kytkeytyneisyys ja rakenne ovat ratkaisevan tärkeitä energian tuotannolle sekä mitokondrioiden ja solujen selviytymiselle5,18. Lisäksi mitoosin eri komponentit keskittyvät mitokondrioiden morfologian muutoksiin, jotka voivat toimia hyödyllisinä mitokondrioiden toimintahäiriöiden päätepisteinä ja tarjota perustan myöhemmille mekanistisille tutkimuksille.
Mitokondrioiden morfologiaa voidaan havaita suoraan transmissioelektronimikroskopialla (TEM), mikä mahdollistaa solujen ultrastruktuurin yksityiskohtaisen tutkimisen. TEM visualisoi suoraan mitokondrioiden kristojen morfologian, muodon ja rakenteen yksittäisten mitokondrioiden tarkkuudella sen sijaan, että luotettaisiin pelkästään geenien transkriptioon, proteiinien ilmentymiseen tai mitokondrioiden toiminnallisiin parametreihin solupopulaatioissa17,19,20. Lisäksi TEM helpottaa mitokondrioiden ja muiden organellien, kuten endoplasmisen retikulumin ja autofagosomien, välisten vuorovaikutusten tutkimista, joilla on keskeinen rooli mitokondrioiden toiminnassa ja homeostaasissa21,22. Näin ollen TEM on hyvä lähtökohta mitokondrioiden toimintahäiriöiden tutkimiselle ennen keskittymistä tiettyihin reitteihin tai geeneihin. Koska mitokondrioiden toiminnasta tulee yhä merkityksellisempää neuropatologiassa, on selvä tarve pystyä tutkimaan suoraan ja kvantitatiivisesti mitokondrioiden morfologiaa ja dynamiikkaa in vitro -hermosolumalleissa.
Tässä artikkelissa tarkastelemme mitokondrioiden dynamiikkaa neuronaalisessa mitokondrioiden toimintahäiriön mallissa autismin kirjon häiriössä. Olemme aiemmin raportoineet propionyyli-CoA-karboksylaasi beetan (PCCB) erilaisesta metylaatiosta ASD15:ssä, joka on mitokondriaalisen propionyyli-CoA-karboksylaasientsyymin PCC:n alayksikkö. PCC:n säätelyn häiriintymisen tiedetään aiheuttavan propionyylijohdannaisten, mukaan lukien propionihapon (PPA), myrkyllistä kertymistä23,24,25. PPA:n on osoitettu häiritsevän hermosolujen aineenvaihduntaa ja muuttavan käyttäytymistä in vivo, ja se on vakiintunut eläinmalli ASD:hen liittyvien neurologisten kehitysmekanismien tutkimiseen26,27,28. Lisäksi PPA:n on raportoitu häiritsevän mitokondrioiden kalvopotentiaalia, biosynteesiä ja hengitystä in vitro, ja sitä on käytetty laajalti neuronien mitokondrioiden toimintahäiriön mallintamiseen29,30. PPA:n aiheuttaman mitokondrioiden toimintahäiriön vaikutus mitokondrioiden morfologiaan ja dynamiikkaan on kuitenkin edelleen huonosti ymmärretty.
Tässä tutkimuksessa käytetään täydentäviä kuvantamistekniikoita PPA:n vaikutusten kvantifiointiin mitokondrioiden morfologiaan, dynamiikkaan ja toimintaan SH-SY5Y-soluissa. Ensin kehitimme TEM-menetelmän mitokondrioiden morfologian ja ultrastruktuurin muutosten visualisoimiseksi17,31,32. Mitokondrioiden dynaamisen luonteen33 vuoksi käytimme myös mitokondrioiden tapahtumalokalisaattoria (MEL) kvantifioidaksemme muutoksia fissio- ja fuusiotapahtumien välisessä tasapainossa, mitokondrioiden lukumäärässä ja tilavuudessa PPA-stressin alaisena. Lopuksi tutkimme, liittyvätkö mitokondrioiden morfologia ja dynamiikka biogeneesiin, fissioon ja fuusioon osallistuvien geenien ilmentymisen muutoksiin. Yhteenvetona voidaan todeta, että datamme havainnollistaa mitokondrioiden dynamiikkaa säätelevien mekanismien monimutkaisuuden selvittämisen haastetta. Korostamme TEM:n hyödyllisyyttä mitokondrioiden morfologian tutkimisessa mitattavana mitoosin konvergenttina päätepisteenä SH-SY5Y-soluissa. Lisäksi korostamme, että TEM-data tarjoaa rikkaimmat tiedot yhdistettynä kuvantamistekniikoihin, jotka myös tallentavat dynaamisia tapahtumia metabolisen stressin seurauksena. Hermosolujen mitoosia tukevien molekyylisäätelymekanismien tarkempi karakterisointi voi tarjota tärkeää tietoa hermoston ja neurodegeneratiivisten sairauksien mitokondriokomponentista.
Mitokondriaalisen stressin indusoimiseksi SH-SY5Y-soluja käsiteltiin PPA:lla käyttäen 3 mM ja 5 mM natriumpropionaattia (NaP). Ennen TEM:iä näytteet altistettiin kryogeeniselle näytevalmistelulle käyttäen korkeapainejäädytystä ja pakastusta (kuva 1a). Kehitimme automatisoidun mitokondrioiden kuva-analyysiprosessin, jolla mitattiin kahdeksan mitokondriopopulaatioiden morfologista parametria kolmessa biologisessa toistossa. Havaitsimme, että PPA-käsittely muutti merkittävästi neljää parametria: pinta-alaa 2, pinta-alaa, kehää ja Feretin halkaisijaa (kuva 1b–e). Pinta-ala 2 pieneni merkittävästi sekä 3 mM että 5 mM PPA-käsittelyllä (p = 0,0183 ja p = 0,002) (kuva 1b), kun taas pinta-ala (p = 0,003), kehä (p = 0,0106) ja Feretin halkaisija pienenivät kaikki merkittävästi. 5 mM:n käsittelyryhmässä havaittiin merkittävä pieneneminen (p = 0,0172) verrattuna kontrolliryhmään (kuva 1c–e). Merkittävät pinta-alan ja ympärysmitan pienenemiset osoittivat, että 5 mM PPA:lla käsitellyillä soluilla oli pienemmät ja pyöreämmät mitokondriot ja että nämä mitokondriot olivat vähemmän pitkänomaisia ​​kuin kontrollisoluilla. Tämä on myös yhdenmukaista Feretin halkaisijan merkittävän pienenemisen kanssa, joka on riippumaton parametri, joka osoittaa hiukkasten reunojen välisen suurimman etäisyyden pienenemistä. Kristallien ultrastruktuurissa havaittiin muutoksia: kristallit vaimenivat PPA-stressin vaikutuksesta (kuva 1a, paneeli B). Kaikki kuvat eivät kuitenkaan heijastaneet selvästi kristallien ultrastruktuuria, joten näistä muutoksista ei tehty kvantitatiivista analyysia. Nämä TEM-tiedot voivat heijastaa kolmea mahdollista skenaariota: (1) PPA lisää fissiota tai estää fuusiota, jolloin olemassa olevat mitokondriot kutistuvat; (2) tehostunut biogeneesi luo uusia, pienempiä mitokondrioita tai (3) indusoi molemmat mekanismit samanaikaisesti. Vaikka näitä tiloja ei voida erottaa TEM:llä, merkittävät morfologiset muutokset viittaavat muutoksiin mitokondrioiden homeostaasissa ja dynamiikassa PPA-stressin alaisena. Myöhemmin tutkimme lisäparametreja näiden dynamiikkojen ja niiden taustalla olevien mahdollisten mekanismien karakterisoimiseksi tarkemmin.
Propionihappo (PPA) muokkaa mitokondrioiden morfologiaa. (a) Edustavat transmissioelektronimikroskopiakuvat (TEM), jotka osoittavat, että mitokondrioiden koko pienenee ja mitokondriot pienenevät ja pyöristyvät PPA-käsittelyn lisääntyessä; 0 mM (käsittelemätön), 3 mM ja 5 mM. Punaiset nuolet osoittavat mitokondrioita. (b–e) 24 tuntia PPA:lla käsitellyt SH-SY5Y-solut valmisteltiin TEM-analyysiä varten ja tulokset analysoitiin Fiji/ImageJ-ohjelmistolla. Neljä kahdeksasta parametrista osoitti merkittäviä eroja kontrollisolujen (käsittelemätön, 0 mM PPA) ja käsiteltyjen solujen (3 mM ja 5 mM PPA) välillä. (b) Alue 2, (c) Pinta-ala, (d) Kehä, (e) Feretin halkaisija. Yksisuuntaista varianssianalyysia (kontrolli vs. käsittely) ja Dunnettin monivertailutestiä käytettiin merkittävien erojen määrittämiseen (p < 0,05). Datapisteet edustavat kunkin yksittäisen solun keskimääräistä mitokondrioarvoa ja virhepalkit edustavat keskiarvoa ± SEM. Esitetyt tiedot edustavat n = 3, vähintään 24 solua toistoa kohden; yhteensä 266 kuvaa analysoitiin; * tarkoittaa p < 0,05, ** tarkoittaa p < 0,01.
Jotta voisimme tarkemmin karakterisoida, miten mitokondrioiden dynamiikka reagoi PPA:han, värjäsimme mitokondriot tetrametyyli-rodamiinietyyliesterillä (TMRE) ja käytimme aikaviivemikroskopiaa ja MEL-analyysiä mitokondrioiden paikantamiseksi ja kvantifioimiseksi 24 tunnin kuluttua 3 ja 5 mM PPA-pitoisuuksilla. Fissio- ja fuusiotapahtumien käsittely. (Kuva 2a). MEL-analyysin jälkeen mitokondrioita analysoitiin edelleen mitokondriorakenteiden lukumäärän ja niiden keskimääräisen tilavuuden kvantifioimiseksi. Havaitsimme pienen mutta merkittävän kasvun fissiotapahtumien määrässä 3 mM:n pitoisuudella [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] verrattuna fissioon [5,6 ± 0,3 (p < 0,05)] ja fuusioon [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] sekä fuusioon [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] (0,05)] (<0,05)]. Tapahtumat lisääntyivät merkittävästi 5 mM:n pitoisuudella verrattuna kontrolliin (kuva 3b). Mitokondrioiden määrä kasvoi merkittävästi sekä pitoisuuksilla 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] että 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (kuva 3c), kun taas kunkin mitokondriorakenteen keskimääräinen tilavuus pysyi muuttumattomana (kuva 3c). 3d). Yhteenvetona tämä viittaa siihen, että mitokondrioiden dynamiikan uudelleenmuokkautuminen toimii kompensoivana vasteena, joka ylläpitää mitokondrioverkoston eheyttä. Fissiotapahtumien määrän kasvu 3 mM PPA:lla viittaa siihen, että mitokondrioiden määrän kasvu johtuu osittain mitokondrioiden fissiosta, mutta koska keskimääräinen mitokondrioiden tilavuus pysyy olennaisesti muuttumattomana, biogeneesiä ei voida sulkea pois lisäkompensoivana vasteena. Nämä tiedot ovat kuitenkin yhdenmukaisia ​​TEM:llä havaittujen pienempien, pyöreiden mitokondriorakenteiden kanssa ja osoittavat myös merkittäviä muutoksia PPA:n indusoimassa mitokondrioiden dynamiikassa.
Propionihappo (PPA) indusoi dynaamista mitokondrioiden uudelleenmuotoutumista verkoston eheyden ylläpitämiseksi. SH-SY5Y-soluja viljeltiin, käsiteltiin 3 ja 5 mM PPA:lla 24 tunnin ajan ja värjättiin TMRE:llä ja Hoechst 33342:lla, minkä jälkeen suoritettiin MEL-analyysi. (a) Edustavat aikaviivemikroskopiakuvat, jotka kuvaavat värillisiä ja binarisoituja maksimi-intensiteettiprojektioita ajanhetkellä 2 (t2) kullekin ehdolle. Kussakin binäärikuvassa osoitetut valitut alueet on parannettu ja esitetty 3D-muodossa kolmella eri aikavälillä (t1-t3) dynamiikan havainnollistamiseksi ajan kuluessa; fuusiotapahtumat on korostettu vihreällä; fissiotapahtumat on korostettu vihreällä. Näytetään punaisella. (b) Dynaamisten tapahtumien keskimääräinen lukumäärä ehdolle. (c) Mitokondriaalisten rakenteiden keskimääräinen lukumäärä solua kohden. (d) Kunkin mitokondriaalisen rakenteen keskimääräinen tilavuus (µm3) solua kohden. Esitetyt tiedot edustavat n = 15 solua käsittelyryhmää kohden. Esitetyt virhepalkit edustavat keskiarvoa ± SEM, skaalapalkki = 10 μm, * p < 0,05.
Propionihappo (PPA) aiheuttaa mitokondrioiden dynamiikkaan liittyvien geenien transkriptionaalisen suppression. SH-SY5Y-soluja käsiteltiin 3 ja 5 mM PPA:lla 24 tunnin ajan. Suhteellinen geenien kvantifiointi suoritettiin RT-qPCR:llä ja normalisoitiin B2M:ään. Mitokondrioiden biogeneesin geenit (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 ja (d) NFE2L2. Mitokondrioiden fuusio- ja fissiogeenit (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 ja (i) DRP1. Merkitseviä eroja (p < 0,05) testattiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVAa (kontrolli vs. käsittely) ja Dunnettin monivertailutestiä: * osoittaa p < 0,05, ** osoittaa p < 0,01 ja **** osoittaa p < 0,0001. Pylväät edustavat keskimääräistä ilmentymistä ± SEM. Esitetyt tiedot edustavat n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) ja n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) biologista replikaattia.
TEM- ja MEL-analyysien tulokset yhdessä osoittavat, että PPA muuttaa mitokondrioiden morfologiaa ja dynamiikkaa. Nämä kuvantamistekniikat eivät kuitenkaan anna tietoa näiden prosessien taustalla olevista mekanismeista. Siksi tutkimme yhdeksän keskeisen mitokondrioiden dynamiikan, biogeneesin ja mitoosin säätelijän mRNA:n ilmentymistä vasteena PPA-hoidolle. Kvantifioimme solumyelooman onkogeenin (cMYC), tuman hengitystekijän (NRF1), mitokondrioiden transkriptiotekijä 1:n (TFAM), NFE2:n kaltaisen transkriptiotekijän BZIP:n (NFE2L2), gastriinin kaltaisen proteiinin 2 (STOML2), näköhermon atrofian 1 (OPA1), mitofusiini 1:n (MFN1), mitofusiini 2:n (MFN2) ja dynamiiniin liittyvän proteiinin 1 (DRP1) 24 tunnin käsittelyn jälkeen 3 mM ja 5 mM PPA:lla. Havaitsimme 3 mM:n (p = 0,0053, p = 0,0415 ja p < 0,0001) ja 5 mM:n (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001) PPA-käsittelyn. (Kuva 3a–c). mRNA:n ilmentymisen lasku oli annoksesta riippuvainen: cMYC:n, NRF1:n ja TFAM:n ilmentyminen väheni 5,7-, 2,6- ja 1,9-kertaisesti 3 mM:n pitoisuuksilla ja 11,2-, 3- ja 2,2-kertaisesti 5 mM:n pitoisuuksilla. Sitä vastoin keskeinen redox-biogeneesigeeni NFE2L2 ei muuttunut millään PPA-pitoisuudella, vaikka havaittiin samanlainen annoksesta riippuva ilmentymisen vähenemisen trendi (kuva 3d).
Tutkimme myös fissio- ja fuusioreaktioiden säätelyyn osallistuvien klassisten geenien ilmentymistä. STOML2:n uskotaan osallistuvan fuusioon, mitofagiaan ja biogeneesiin, ja sen ilmentyminen väheni merkittävästi (p < 0,0001) 3 mM:n (2,4-kertainen muutos) ja 5 mM:n (2,8-kertainen muutos) PPA:lla (kuva 1). 3d). Vastaavasti OPA1-fuusiogeenin ilmentyminen väheni 3 mM:n (1,6-kertainen muutos) ja 5 mM:n (1,9-kertainen muutos) PPA:lla (p = 0,006 ja p = 0,0024) (kuva 3f). Emme kuitenkaan löytäneet merkittäviä eroja fuusiogeenien MFN1, MFN2 tai fissiogeeni DRP1 ilmentymisessä 24 tunnin PPA-stressin aikana (kuva 3g–i). Lisäksi havaitsimme, että neljän fuusio- ja fissioproteiinin (OPA1, MFN1, MFN2 ja DRP1) tasot eivät muuttuneet samoissa olosuhteissa (kuva 4a–d). On tärkeää huomata, että nämä tiedot heijastavat yhtä ajankohtaa eivätkä välttämättä heijasta proteiinien ilmentymisen tai aktiivisuustasojen muutoksia PPA-stressin alkuvaiheissa. cMYC:n, NRF1:n, TFAM:n, STOML2:n ja OPA1:n ilmentymisen merkittävä väheneminen viittaa kuitenkin mitokondrioiden aineenvaihdunnan, biogeneesin ja dynamiikan merkittävään transkriptionaaliseen säätelyhäiriöön. Lisäksi nämä tiedot korostavat kuvantamistekniikoiden hyödyllisyyttä mitokondrioiden toiminnan lopputilan muutosten suorassa tutkimisessa.
Fuusio- ja fissiotekijäproteiinien tasot eivät muuttuneet propionihappokäsittelyn (PPA) jälkeen. SH-SY5Y-soluja käsiteltiin 3 ja 5 mM PPA:lla 24 tunnin ajan. Proteiinitasot kvantifioitiin Western blot -analyysillä ja ilmentymistasot normalisoitiin kokonaisproteiiniin. Keskimääräinen proteiinien ilmentyminen ja kohdeproteiinin ja kokonaisproteiinin edustavat Western blotit on esitetty kuvassa. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Pylväät edustavat keskiarvoa ± SEM, ja esitetyt tiedot edustavat n = 3 biologista toistoa. Useita vertailuja (p < 0,05) tehtiin käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysia ja Dunnettin testiä. Alkuperäinen geeli ja blotti on esitetty kuvassa S1.
Mitokondrioiden toimintahäiriöt liittyvät monisysteemisairauksiin aineenvaihdunta-, sydän- ja verisuoni- sekä lihassairauksista neurologisiin sairauksiin1,10. Monet neurodegeneratiiviset ja hermostoa rappeuttavat sairaudet liittyvät mitokondrioiden toimintahäiriöihin, mikä korostaa näiden organellien merkitystä koko aivojen elinkaaren ajan. Näihin sairauksiin kuuluvat Parkinsonin tauti, Alzheimerin tauti ja autismikirjon häiriöt3,4,18. Aivokudoksen saatavuus näiden sairauksien tutkimiseksi on kuitenkin vaikeaa, erityisesti mekanistisella tasolla, minkä vuoksi solumallijärjestelmät ovat välttämätön vaihtoehto. Tässä tutkimuksessa käytämme solumallijärjestelmää, jossa käytetään PPA-käsiteltyjä SH-SY5Y-soluja, neuronaalisissa sairauksissa, erityisesti autismin kirjon häiriöissä, havaittujen mitokondrioiden toimintahäiriöiden kertaamiseksi. Tämän PPA-mallin käyttäminen neuronien mitokondrioiden dynamiikan tutkimiseen voi antaa tietoa autismikirjon häiriön etiologiasta.
Tutkimme TEM-kuvantamisen (TEM) mahdollisuutta mitokondrioiden morfologian muutosten tarkasteluun. On tärkeää huomata, että TEM:iä on käytettävä oikein sen tehokkuuden maksimoimiseksi. Kryonäytteiden valmistus mahdollistaa hermosolurakenteiden paremman säilymisen samanaikaisesti kiinnittämällä solukomponentteja ja vähentämällä artefaktien muodostumista34. Tämän mukaisesti havaitsimme, että hermosolujen kaltaisilla SH-SY5Y-soluilla oli ehjät solunsisäiset organellit ja pitkänomaiset mitokondriot (kuva 1a). Tämä korostaa kryogeenisten valmistustekniikoiden hyödyllisyyttä mitokondrioiden morfologian tutkimisessa hermosolumalleissa. Vaikka kvantitatiiviset mittaukset ovat ratkaisevan tärkeitä TEM-datan objektiiviselle analysoinnille, ei ole vieläkään yksimielisyyttä siitä, mitä erityisiä parametreja tulisi mitata mitokondrioiden morfologisten muutosten vahvistamiseksi. Kehitimme automatisoidun mitokondrioiden kuva-analyysiprosessin, joka mittaa kahdeksaa morfologista parametria: pinta-alaa, pinta-alaa2, kuvasuhdetta, kehää, pyöreyttä, astetta, Feretin halkaisijaa ja pyöreyttä.
Näistä PPA pienensi merkittävästi pinta-alaa 2, pinta-alaa, kehää ja Feretin halkaisijaa (kuva 1b–e). Tämä osoitti, että mitokondriot pienenivät ja pyöristyivät, mikä on yhdenmukaista aiempien tutkimusten kanssa, jotka osoittivat mitokondrioiden pinta-alan pienenemisen 72 tunnin PPA30:n aiheuttaman mitokondriaalisen stressin jälkeen. Nämä morfologiset piirteet voivat viitata mitokondrioiden fissioon, joka on välttämätön prosessi vaurioituneiden komponenttien eristämiseksi mitokondrioverkostosta ja niiden hajoamisen edistämiseksi mitofagian kautta35,36,37. Toisaalta mitokondrioiden keskimääräisen koon pieneneminen voi liittyä lisääntyneeseen biogeneesiin, mikä johtaa pienten vastasyntyneiden mitokondrioiden muodostumiseen. Lisääntynyt fissio tai biogeneesi edustaa kompensoivaa vastetta mitoosin ylläpitämiseksi mitokondrioiden stressiä vastaan. Mitokondrioiden kasvun hidastumista, fuusion heikkenemistä tai muita tiloja ei kuitenkaan voida sulkea pois.
Vaikka TEM:n luomat korkearesoluutioiset kuvat mahdollistavat yksittäisten mitokondrioiden morfologisten ominaisuuksien määrittämisen, tämä menetelmä tuottaa kaksiulotteisia tilannekuvia yhdestä ajanhetkestä. Metabolisen stressin dynaamisten vasteiden tutkimiseksi värjäsimme mitokondriot TMRE:llä ja käytimme aikaviivemikroskopiaa MEL-analyysin kanssa, joka mahdollistaa mitokondrioverkoston muutosten tehokkaan 3D-visualisoinnin ajan kuluessa33,38. Havaitsimme hienovaraisia ​​mutta merkittäviä muutoksia mitokondrioiden dynamiikassa PPA-stressin alaisena (kuva 2). 3 mM:n pitoisuudella fissio- ja fuusiotapahtumien määrä kasvoi merkittävästi, kun taas fuusiotapahtumat pysyivät samoina kuin kontrollissa. Sekä fissio- että fuusiotapahtumien määrän kasvua havaittiin 5 mM PPA:lla, mutta nämä muutokset olivat suunnilleen verrannollisia, mikä viittaa siihen, että fissio- ja fuusiokinetiikka saavuttaa tasapainon suuremmilla pitoisuuksilla (kuva 2b). Keskimääräinen mitokondrioiden tilavuus pysyi muuttumattomana sekä 3 että 5 mM PPA:lla, mikä osoittaa, että mitokondrioverkoston eheys säilyi (kuva 2d). Tämä heijastaa dynaamisten mitokondrioverkostojen kykyä reagoida lievään metaboliseen stressiin ylläpitääkseen tehokkaasti homeostaasia aiheuttamatta verkoston pirstoutumista. 3 mM PPA-pitoisuudella fissiokasvun lisääntyminen riittää edistämään siirtymistä uuteen tasapainotilaan, mutta suurempien PPA-pitoisuuksien aiheuttama stressi vaatii syvällisempää kineettistä uudelleenmuotoutumista.
Mitokondrioiden määrä kasvoi molemmilla PPA-stressipitoisuuksilla, mutta keskimääräinen mitokondrioiden tilavuus ei muuttunut merkittävästi (kuva 2c). Tämä voi johtua lisääntyneestä biogeneesistä tai lisääntyneestä jakautumisesta; kuitenkin, jos mitokondrioiden keskimääräisessä tilavuudessa ei tapahdu merkittävää laskua, on todennäköisempää, että biosynteesi lisääntyy. Kuvan 2 tiedot tukevat kuitenkin kahden kompensoivan mekanismin olemassaoloa: fissiotapahtumien määrän kasvua, joka on yhdenmukaista mitokondrioiden fissioiden lisääntymisen kanssa, ja tapahtumien määrän kasvua, joka on yhdenmukaista mitokondrioiden biogeneesin kanssa. Viime kädessä lievän stressin dynaaminen kompensaatio voi koostua samanaikaisista prosesseista, joihin liittyy fissio, fuusio, biosynteesi ja mitofagia. Vaikka aiemmat kirjoittajat ovat osoittaneet, että PPA lisää mitoosia30,39 ja mitofagiaa29, me tarjoamme näyttöä mitokondrioiden fissio- ja fuusiodynamiikan uudelleenmuotoutumisesta vasteena PPA:lle. Nämä tiedot vahvistavat TEM:llä havaitut morfologiset muutokset ja tarjoavat lisää tietoa PPA:n aiheuttamaan mitokondrioiden toimintahäiriöön liittyvistä mekanismeista.
Koska kumpikaan ei antanut suoraa näyttöä havaittujen morfologisten muutosten taustalla olevista geenisäätelymekanismeista, tutkimme mitokondrioiden aineenvaihduntaan, biogeneesiin ja dynamiikkaan osallistuvien geenien RNA-ilmentymistä. cMYC-proto-onkogeeni on transkriptiotekijä, joka osallistuu mitokondrioiden, glykolyysin, aminohappojen ja rasvahappojen aineenvaihdunnan säätelyyn40. Lisäksi cMYC:n tiedetään säätelevän lähes 600 mitokondriaalisen geenin ilmentymistä, jotka osallistuvat mitokondrioiden transkriptioon, translaatioon ja kompleksien kokoonpanoon, mukaan lukien NRF1 ja TFAM41. NRF1 ja TFAM ovat kaksi keskeistä mitoosin säätelijää, jotka toimivat PGC-1α:n alavirtaan aktivoiden mtDNA:n replikaation. Tätä reittiä aktivoi cAMP- ja AMPK-signalointi, ja se on herkkä energiankulutukselle ja metaboliselle stressille. Tutkimme myös NFE2L2:ta, mitokondrioiden biogeneesin redox-säätelijää, selvittääksemme, voisiko PPA:n vaikutukset välittyä oksidatiivisen stressin kautta.
Vaikka NFE2L2:n ilmentyminen pysyi muuttumattomana, havaitsimme cMYC:n, NRF1:n ja TFAM:n ilmentymisessä johdonmukaisen annoksesta riippuvan laskun 24 tunnin käsittelyn jälkeen 3 mM ja 5 mM PPA:lla (kuva 3a–c). cMYC:n ilmentymisen alasääntelyä on aiemmin raportoitu vastauksena mitokondriaaliseen stressiin42, ja päinvastoin, cMYC:n ilmentymisen alasääntely voi aiheuttaa mitokondrioiden toimintahäiriöitä muokkaamalla mitokondrioiden aineenvaihduntaa, verkostoyhteyksiä ja kalvojen polarisaatiota43. Mielenkiintoista on, että cMYC osallistuu myös mitokondrioiden fissio- ja fuusioreaktion säätelyyn42,43 ja sen tiedetään lisäävän DRP1:n fosforylaatiota ja mitokondrioiden lokalisaatiota solujen jakautumisen aikana44 sekä välittävän mitokondrioiden morfologista uudelleenmuotoutumista hermosolujen kantasoluissa45. cMYC-puutteisilla fibroblasteilla on todellakin pienempi mitokondrioiden koko, mikä on yhdenmukaista PPA43-stressin aiheuttamien muutosten kanssa. Nämä tiedot havainnollistavat mielenkiintoista, mutta vielä epäselvää suhdetta cMYC:n ja mitokondrioiden dynamiikan välillä, ja tarjoavat mielenkiintoisen kohteen tuleville PPA-stressin aiheuttaman uudelleenmuotoutumisen tutkimuksille.
NRF1:n ja TFAM:n väheneminen on yhdenmukaista cMYC:n roolin kanssa tärkeänä transkriptionaalisena aktivaattorina. Nämä tiedot ovat myös yhdenmukaisia ​​aiempien ihmisen paksusuolensyöpäsoluissa tehtyjen tutkimusten kanssa, jotka osoittavat, että PPA vähensi NRF1-mRNA:n ilmentymistä 22 tunnissa, mikä liittyi ATP:n vähenemiseen ja ROS46:n lisääntymiseen. Nämä kirjoittajat raportoivat myös, että TFAM:n ilmentyminen lisääntyi 8,5 tunnissa, mutta palasi lähtötasolle 22 tunnissa. Sitä vastoin Kim ym. (2019) osoittivat, että TFAM-mRNA:n ilmentyminen väheni merkittävästi 4 tunnin PPA-stressin jälkeen SH-SY5Y-soluissa; 72 tunnin kuluttua TFAM-proteiinin ilmentyminen kuitenkin lisääntyi merkittävästi ja mtDNA:n kopioiden määrä kasvoi merkittävästi. Siten 24 tunnin kuluttua havaitsemamme mitokondrioiden biogeneesigeenien määrän väheneminen ei sulje pois mahdollisuutta, että mitokondrioiden määrän kasvu liittyy biogeneesin aktivoitumiseen aikaisemmissa aikapisteissä. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että PPA lisää merkittävästi PGC-1α:n mRNA:n ja proteiinin määrää SH-SY5Y-soluissa 4 tunnin 30 minuutin kohdalla, kun taas propionihappo tehostaa mitokondrioiden biosynteesiä vasikan maksasoluissa PGC-1α:n kautta 12 tunnin 39 minuutin kohdalla. Mielenkiintoista on, että PGC-1α ei ole ainoastaan ​​NRF1:n ja TFAM:n suora transkriptionaalinen säätelijä, vaan sen on myös osoitettu säätelevän MFN2:n ja DRP1:n aktiivisuutta säätelemällä fissiota ja fuusiota47. Yhteenvetona tämä korostaa PPA:n aiheuttamien mitokondrioiden kompensoivien vasteiden säätelymekanismien läheistä yhteyttä. Lisäksi datamme heijastaa biogeneesin ja aineenvaihdunnan transkriptionaalisen säätelyn merkittävää toimintahäiriötä PPA-stressin alaisena.
STOML2-, OPA1-, MFN1-, MFN2- ja DRP1-geenit ovat mitokondrioiden fissio-, fuusio- ja dynamiikan keskeisiä säätelijöitä37,48,49. Mitokondrioiden dynamiikkaan osallistuu monia muita geenejä, mutta STOML2:n, OPA1:n ja MFN2:n on aiemmin havaittu metyloituvan eri tavalla ASD-kohorteissa16, ja useissa riippumattomissa tutkimuksissa on raportoitu näiden transkriptiotekijöiden muutoksista mitokondrioiden stressin vasteena50,51.52. Sekä OPA1:n että STOML2:n ilmentyminen väheni merkittävästi 3 mM:n ja 5 mM:n PPA-käsittelyllä (kuva 3e, f). OPA1 on yksi klassisista mitokondrioiden fuusion säätelijöistä suoran vuorovaikutuksen kautta MFN1:n ja 2:n kanssa ja sillä on rooli kristojen uudelleenmuodostuksessa ja mitokondrioiden morfologiassa53. STOML2:n tarkka rooli mitokondrioiden dynamiikassa on edelleen epäselvä, mutta todisteet viittaavat siihen, että sillä on rooli mitokondrioiden fuusiossa, biogeneesissä ja mitofagiassa.
STOML2 osallistuu mitokondrioiden hengityskytkennän ja hengitysketjukompleksien muodostumisen ylläpitämiseen54,55, ja sen on osoitettu muuttavan merkittävästi syöpäsolujen aineenvaihduntaominaisuuksia56. Tutkimukset ovat osoittaneet, että STOML2 edistää mitokondrioiden kalvopotentiaalia ja biosynteesiä vuorovaikutuksessa BAN:n ja kardiolipiinin kanssa55, 57, 58. Lisäksi riippumattomat tutkimukset ovat osoittaneet, että STOML2:n ja PINK1:n välinen vuorovaikutus säätelee mitofagiaa59,60. Erityisesti STOML2:n on raportoitu olevan suorassa vuorovaikutuksessa MFN2:n kanssa ja stabiloivan sitä, ja sillä on myös tärkeä rooli pitkien OPA1-isoformien stabiloinnissa estämällä OPA1:n hajoamisesta vastaavaa proteaasia53,61,62. PPA-reaktioissa havaittu STOML2:n ilmentymisen väheneminen voi tehdä näistä fuusioproteiineista alttiimpia hajoamiselle ubikitiini- ja proteasomiriippuvaisten reittien kautta48. Vaikka STOML2:n ja OPA1:n tarkka rooli PPA:n dynaamisessa vasteessa on epäselvä, näiden fuusiogeenien ilmentymisen väheneminen (kuva 3) voi häiritä fissio- ja fuusiotasapainoa ja johtaa mitokondrioiden koon pienenemiseen (kuva 3). 1).
Toisaalta OPA1-proteiinin ilmentyminen pysyi muuttumattomana 24 tunnin kuluttua, kun taas MFN1:n, MFN2:n tai DRP1:n mRNA- ja proteiinitasot eivät muuttuneet merkittävästi PPA-käsittelyn jälkeen (kuva 3g-i, kuva 4). Tämä voi viitata siihen, ettei näiden mitokondrioiden fuusioon ja fissioon osallistuvien tekijöiden säätelyssä ole muutoksia. On kuitenkin syytä huomata, että kutakin näistä neljästä geenistä säätelevät myös transkriptionaaliset modifikaatiot (PTM), jotka kontrolloivat proteiiniaktiivisuutta. OPA1:llä on kahdeksan vaihtoehtoista silmukointivarianttia, jotka proteolyyttisesti pilkkoutuvat mitokondrioissa tuottaen kaksi erillistä isoformia 63. Pitkien ja lyhyiden isoformien välinen tasapaino määrittää lopulta OPA1:n roolin mitokondrioiden fuusiossa ja mitokondrioverkoston ylläpidossa 64. DRP1-aktiivisuutta säätelee kalsium-/kalmoduliiniriippuvainen proteiinikinaasi II:n (CaMKII) fosforylaatio, kun taas DRP1:n hajoamista säätelevät ubikitinaatio ja SUMOylaatio 65. Lopuksi, sekä DRP1 että MFN1/2 ovat GTPaaseja, joten aktiivisuuteen voi vaikuttaa GTP:n tuotantonopeus mitokondrioissa 66. Vaikka näiden proteiinien ilmentyminen pysyy vakiona, tämä ei välttämättä heijasta muuttumatonta proteiiniaktiivisuutta tai lokalisaatiota 67,68. Itse asiassa olemassa olevat PTM-proteiinirepertuaarit toimivat usein ensimmäisenä puolustuslinjana, joka vastaa akuuttien stressivasteiden välittämisestä. Mallissamme kohtalaisen metabolisen stressin läsnä ollessa on todennäköistä, että PTM edistää fuusio- ja fissioproteiinien lisääntynyttä aktiivisuutta palauttaakseen mitokondrioiden eheyden riittävästi ilman, että näiden geenien lisäaktivointia vaaditaan mRNA- tai proteiinitasolla.
Yhteenvetona voidaan todeta, että yllä olevat tiedot korostavat mitokondrioiden morfologian monimutkaista ja ajasta riippuvaa säätelyä ja näiden mekanismien selvittämisen haasteita. Geenien ilmentymisen tutkimiseksi on ensin tunnistettava spesifiset kohdegeenit reitillä. Tietomme kuitenkin osoittavat, että saman reitin geenit eivät reagoi samalla tavalla samaan stressiin. Itse asiassa aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että saman reitin eri geeneillä voi olla erilaiset ajalliset vasteprofiilit30,46. Lisäksi on olemassa monimutkaisia ​​transkription jälkeisiä mekanismeja, jotka häiritsevät transkription ja geenien toiminnan välistä suhdetta. Proteomiikkatutkimukset voivat antaa tietoa PTM-mekanismien ja proteiinien toiminnan vaikutuksesta, mutta ne asettavat myös haasteita, kuten matalan läpimenon menetelmät, korkeat signaali-kohinasuhteet ja heikko resoluutio.
Tässä yhteydessä mitokondrioiden morfologian tutkiminen TEM:n ja MEL:n avulla tarjoaa suuria mahdollisuuksia vastata perustavanlaatuisiin kysymyksiin mitokondrioiden dynamiikan ja toiminnan välisestä suhteesta ja siitä, miten tämä vaikuttaa sairauksiin. Tärkeintä on, että TEM tarjoaa suoran menetelmän mitokondrioiden morfologian mittaamiseen mitokondrioiden toimintahäiriöiden ja dynamiikan konvergenttina päätepisteenä51. MEL tarjoaa myös suoran menetelmän fissio- ja fuusiotapahtumien visualisointiin kolmiulotteisessa soluympäristössä, mikä mahdollistaa dynaamisen mitokondrioiden uudelleenmuodostumisen kvantifioinnin jopa ilman geenien ilmentymisen muutoksia33. Tässä korostamme mitokondrioiden kuvantamistekniikoiden hyödyllisyyttä sekundaarisissa mitokondriosairauksissa. Näille sairauksille on tyypillisesti ominaista krooninen lievä metabolinen stressi, jolle on ominaista mitokondrioverkostojen hienovarainen uudelleenmuodostuminen akuuttien mitokondriovaurioiden sijaan. Kroonisessa stressissä mitoosin ylläpitämiseen tarvittavalla mitokondrioiden kompensaatiolla on kuitenkin syvällisiä toiminnallisia seurauksia. Neurotieteen kontekstissa näiden kompensaatiomekanismien parempi ymmärtäminen voi tarjota tärkeää tietoa mitokondrioiden toimintahäiriöön liittyvästä pleiotrooppisesta neuropatologiasta.
Viime kädessä datamme korostavat kuvantamistekniikoiden hyödyllisyyttä ymmärrettäessä geenien ilmentymisen, proteiinimodifikaatioiden ja proteiiniaktiivisuuden välisten monimutkaisten vuorovaikutusten toiminnallisia seurauksia, jotka säätelevät hermosolujen mitokondrioiden dynamiikkaa. Käytimme PPA:ta mallintaaksemme mitokondrioiden toimintahäiriöitä hermosolumallissa saadaksemme tietoa ASD:n mitokondriaalisesta komponentista. PPA:lla käsitellyissä SH-SY5Y-soluissa havaittiin muutoksia mitokondrioiden morfologiassa: mitokondrioista tuli pieniä ja pyöreitä, ja kristat olivat huonosti määriteltyjä TEM:llä havaittaessa. MEL-analyysi osoittaa, että nämä muutokset tapahtuvat samanaikaisesti fissio- ja fuusiotapahtumien lisääntymisen kanssa mitokondrioverkoston ylläpitämiseksi vastauksena lievään metaboliseen stressiin. Lisäksi PPA häiritsee merkittävästi mitokondrioiden aineenvaihdunnan ja homeostaasin transkriptionaalista säätelyä. Tunnistimme cMYC:n, NRF1:n, TFAM:n, STOML2:n ja OPA1:n keskeisiksi mitokondrioiden säätelijöiksi, joita PPA-stressi häiritsee, ja niillä voi olla rooli PPA:n aiheuttamien muutosten välittämisessä mitokondrioiden morfologiassa ja toiminnassa. Tulevia tutkimuksia tarvitaan, jotta PPA:n aiheuttamia ajallisia muutoksia geenien ilmentymisessä ja proteiiniaktiivisuudessa, lokalisaatiossa ja translaation jälkeisissä modifikaatioissa voidaan karakterisoida paremmin. Datamme korostavat mitokondrioiden stressivastetta välittävien säätelymekanismien monimutkaisuutta ja keskinäistä riippuvuutta ja osoittavat TEM:n ja muiden kuvantamistekniikoiden hyödyllisyyden kohdennetumpiin mekanistisiin tutkimuksiin.
SH-SY5Y-solulinja (ECACC, 94030304-1VL) hankittiin Sigma-Aldrichilta. SH-SY5Y-soluja kasvatettiin Dulbeccon muunnetussa Eagle'n elatusaineessa/F-12-ravinneseoksessa (DMEM/F-12) ja L-glutamiinissa (SC09411, ScienCell) 25 cm2:n pulloissa, joihin oli lisätty 20 % naudan sikiön seerumia (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) ja 1 % penisilliini-streptomysiiniä (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) 37 °C:ssa, 5 % CO2:ta ilmakehässä. Solut siirrostettiin 80 %:n konfluenssiin käyttämällä 0,05 % trypsiini-EDTA:ta (15400054, ThermoFisher Scientific), sentrifugoitiin 300 g:n voimalla ja levitettiin viljelykasveihin tiheydellä noin 7 × 105 solua/ml. Kaikki kokeet tehtiin erilaistumattomilla SH-SY5Y-soluilla siirrostusten 19–22 välillä. PPA:ta annetaan NaP:nä. Liuota NaP-jauhe (CAS-nro 137-40-6, kemiallinen kaava C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) lämpimään MilliQ-veteen 1 M:n pitoisuuteen ja säilytä 4 °C:ssa. Käsittelypäivänä laimenna tämä liuos 1 M PPA:lla 3 mM:iin ja 5 mM PPA:lla seerumittomaan elatusaineeseen (DMEM/F-12, jossa L-glutamiinia). Kaikissa kokeissa käsittelypitoisuudet olivat ei PPA:ta (0 mM, kontrolli), 3 mM ja 5 mM PPA. Kokeet tehtiin vähintään kolmessa biologisessa toistossa.
SH-SY5Y-solut kylvettiin 25 cm5:n pulloihin nopeudella 5,5 × 105 solua/ml ja niitä kasvatettiin 24 tuntia. PPA-käsittely lisättiin pulloon ennen 24 tunnin inkubointia. Solupelletit kerättiin normaaleilla nisäkäskudosviljelymenetelmillä (kuvattu edellä). Solupelletti suspendoitiin uudelleen 100 µl:aan 2,5 % glutaraldehydiä, 1 × PBS:ää ja säilytettiin 4 °C:ssa käsittelyyn asti. SH-SY5Y-solut sentrifugoitiin lyhyesti solujen pelletoimiseksi ja 2,5 % glutaraldehydiä, 1 × PBS:ää sisältävän liuoksen poistamiseksi. Sedimentti suspendoitiin uudelleen 4 % agaroosigeeliin, joka oli valmistettu tislattuun veteen (agaroosin ja sedimentin tilavuuden suhde on 1:1). Agaroosipalat asetettiin ritilöille tasaisille levyille ja päällystettiin 1-heksadekeenillä ennen korkeapainepakastusta. Näytteet pakastettiin 100 % kuivassa asetonissa -90 °C:ssa 24 tuntia. Lämpötila nostettiin sitten -80 °C:seen ja lisättiin liuos, jossa oli 1 % osmiumtetroksidia ja 0,1 % glutaraldehydiä. Näytteitä säilytettiin -80 °C:ssa 24 tuntia. Tämän jälkeen lämpötila nostettiin vähitellen huoneenlämpöön useiden päivien aikana: –80 °C:sta –50 °C:seen 24 tunniksi, –30 °C:seen 24 tunniksi, –10 °C:seen 24 tunniksi ja lopuksi huoneenlämpöön.
Kryogeenisen valmistuksen jälkeen näytteet kyllästettiin hartsilla ja niistä tehtiin erittäin ohuet leikkeet (∼100 nm) Leica Reichert UltracutS -ultramikrotomilla (Leica Microsystems). Leikkeet värjättiin 2 % uranyyliasetaatilla ja lyijysitraatilla. Näytteitä tarkasteltiin käyttämällä FEI Tecnai 20 -transmissioelektronimikroskooppia (ThermoFisher (entinen FEI), Eindhoven, Alankomaat) 200 kV:n jännitteellä (Lab6-lähetin) ja Gatan CCD-kameraa (Gatan, Iso-Britannia), joka oli varustettu Tridiem-energiasuodattimella.
Jokaisessa teknisessä toistossa hankittiin vähintään 24 yksittäistä solukuvaa, yhteensä 266 kuvaa. Kaikki kuvat analysoitiin käyttämällä kiinnostusalue (ROI) -makroa ja mitokondriomakroa. Mitokondriomakro perustuu julkaistuihin menetelmiin17,31,32 ja mahdollistaa TEM-kuvien puoliautomaattisen eräkäsittelyn Fiji/ImageJ69-ohjelmassa. Lyhyesti sanottuna: kuva käännetään ja invertoidaan käyttämällä pyörivän pallon taustan vähennystä (60 pikselin säde) ja FFT-kaistanpäästösuodatinta (käyttäen 60 ja 8 pikselin ylä- ja alarajoja) sekä pystysuuntaista viivan vaimennusta 5 %:n suuntatoleranssilla. Käsitelty kuva kynnystetään automaattisesti käyttämällä maksimientropia-algoritmia ja luodaan binäärimaski. Raakakoissa TEM-kuvissa manuaalisesti valittuihin ROI-alueisiin liittyvät kuva-alueet erotettiin, jolloin mitokondriot karakterisoitiin ja solukalvo ja muut korkeakontrastiset alueet suljettiin pois. Jokaista uutettua ROI-aluetta kohden analysoitiin yli 600 pikselin kokoiset binäärihiukkaset, ja hiukkasten pinta-ala, kehä, pää- ja sivuakselit, Feretin halkaisija, pyöreys ja ympyrämäisyys mitattiin käyttämällä Fiji/ImageJ:n sisäänrakennettuja mittausfunktioita. Merrillin, Flippon ja Strackin (2017) mukaisesti pinta-ala 2, hiukkasten sivusuhde (pää- ja sivuakselien suhde) ja muotokerroin (FF) laskettiin näistä tiedoista, jossa FF = kehä 2/4pi x pinta-ala. Parametrisen kaavan määritelmä löytyy Merrillin, Flippon ja Strackin (2017) julkaisusta. Mainitut makrot ovat saatavilla GitHubissa (katso tietojen saatavuuslausunto). Keskimäärin noin 5 600 hiukkasta analysoitiin PPA-käsittelyä kohden, yhteensä noin 17 000 hiukkasta (tietoja ei esitetty).
SH-SH5Y-solut asetettiin 8-kammioisiin viljelymaljoihin (ThermoFisher, #155411) kiinnittymisen mahdollistamiseksi yön yli ja inkuboitiin sitten TMRE 1:1000 -värjäyksellä (ThermoFisher, #T669) ja Hoechst 33342 1:200 -värjäyksellä (Sigma-Aldrich, H6024). Kuvat otettiin käyttämällä 405 nm:n ja 561 nm:n lasereita 10 minuutin ympäristössä, ja raakakuvat otettiin z-pinoina, jotka sisälsivät 10 mikrokuvaa 0,2 μm:n az-askelin avulla kuvaruutujen välillä 12 peräkkäisessä aikapisteessä. Kuvat kerättiin Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 -superresoluutioalustalla (Carl Zeiss, Oberkochen, Saksa) käyttäen LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 -objektiivia. Kuvia analysoitiin ImageJ:ssä aiemmin kuvatun prosessimenetelmän ja ImageJ-laajennuksen avulla fuusio- ja fissiotapahtumien, mitokondriaalisten rakenteiden keskimääräisen lukumäärän ja keskimääräisen mitokondrioiden tilavuuden mittaamiseksi solua kohden33. MEL-makrot ovat saatavilla GitHubissa (katso datan saatavuuslausunto).
SH-SY5Y-soluja kasvatettiin kuusikuoppalevyillä tiheydellä 0,3 × 106 solua/ml 24 tunnin ajan ennen käsittelyä. RNA eristettiin Quick-RNA™ Miniprep -protokollalla (ZR R1055, Zymo Research) pienin muutoksin: jokaiseen kuoppaan lisättiin 300 μl RNA-lyysipuskuria ennen poistamista ja jokainen näyte lysoitiin viimeisenä vaiheena 30 μl:lla DNase/RNase-eluutiota. Kaikkien näytteiden määrä ja laatu tarkistettiin NanoDrop ND-1000 UV-Vis -spektrofotometrillä. Solulysaattien kokonaisproteiini määritettiin käyttämällä 200 μl RIPA-lyysipuskuria, ja proteiinipitoisuus kvantifioitiin Bradfordin proteiinimäärityksellä70.
cDNA-synteesi suoritettiin käyttämällä Tetro™ cDNA Synthesis Kit -pakkausta (BIO-65043, Meridian Bioscience) valmistajan ohjeiden mukaisesti ja tietyin muutoksin. cDNA syntetisoitiin 20 μl:n reaktioissa käyttäen 0,7–1 μg kokonais-RNA:ta. Alukkeet valittiin aiemmin julkaistuista artikkeleista 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (taulukko S1) ja niihin liittyvät koettimet suunniteltiin käyttämällä Integrated DNA Technologiesin PrimerQuest-työkalua. Kaikki kiinnostuksen kohteena olevat geenit normalisoitiin tuman B2M-geeniin. STOML2:n, NRF1:n, NFE2L2:n, TFAM:n, cMYC:n ja OPA1:n geenien ilmentyminen mitattiin RT-qPCR:llä. Pääseos sisälsi LUNA Taq -polymeraasia (M3003L, New England Biolabs), 10 μM eteen- ja taaksepäin suuntautuvia alukkeita, cDNA:ta ja PCR-laatuista vettä, jolloin lopullinen tilavuus oli 10 μl kutakin reaktiota kohden. Jakautumis- ja fissiogeenien (DRP1, MFN1/2) ilmentymistä mitattiin TaqMan-multipleksimäärityksillä. Luna Universal Probe qPCR Master Mixiä (M3004S, New England Biolabs) käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti pienin muutoksin. Multipleksinen RT-qPCR-pääseos sisältää 1X LUNA Taq -polymeraasia, 10 μM eteen- ja taaksepäin suuntautuvia alukkeita, 10 μM koetinta, cDNA:ta ja PCR-laatuista vettä, jolloin kunkin reaktion lopullinen tilavuus on 20 μl. RT-qPCR suoritettiin käyttämällä Rotor-Gene Q 6-plexiä (QIAGEN RG - sarjanumero: R0618110). Sykliolosuhteet on esitetty taulukossa S1. Kaikki cDNA-näytteet monistettiin kolmena rinnakkaisnäytteenä ja standardikäyrä luotiin käyttämällä kymmenkertaisten laimennosten sarjaa. Kolmen rinnakkaisnäytteen poikkeavat arvot, joiden syklikynnyksen standardipoikkeama (Ct) oli >0,5, poistettiin analyysistä tietojen toistettavuuden varmistamiseksi30,72. Suhteellinen geenien ilmentyminen laskettiin käyttämällä 2-ΔΔCt79-menetelmää.
Proteiininäytteet (60 μg) sekoitettiin Laemmli-latauspuskuriin suhteessa 2:1 ja ajettiin 12 %:n värittömällä proteiinigeelillä (Bio-Rad #1610184). Proteiinit siirrettiin PVDF (polyvinylideenifluoridi) -kalvolle (#170-84156, Bio-Rad) käyttäen Trans-Blot Turbo -järjestelmää (#170-4155, Bio-Rad). Kalvo blokattiin ja inkuboitiin sopivien primaaristen vasta-aineiden (OPA1, MFN1, MFN2 ja DRP1) kanssa (laimennettuna suhteessa 1:1000) 48 tunnin ajan, minkä jälkeen inkuboitiin sekundaaristen vasta-aineiden (1:10 000) kanssa 1 tunnin ajan. Kalvot kuvannettiin sitten Clarity Western ECL Substrate -laitteella (#170-5061, Bio-Rad) ja tallennettiin Bio-Rad ChemiDoc MP -järjestelmällä. Western blot -analyysiin käytettiin ImageLab-versiota 6.1. Alkuperäinen geeli ja blotti on esitetty kuvassa S1. Vasta-ainetiedot on esitetty taulukossa S2.
Aineistot esitetään vähintään kolmen riippumattoman otoksen keskiarvona ja keskiarvon keskivirheenä (SEM). Aineistoille tehtiin normaalisuus Shapiro-Wilks-testillä (ellei toisin mainita) ennen kuin oletettiin Gaussinen jakauma ja yhtä suuret keskihajonnat ja jatkettiin analyysejä. Aineisto analysoitiin lisäksi Fisherin MEL LSD:llä (p < 0,05), yksisuuntaisella ANOVA:lla (käsittely vs. kontrollin keskiarvo) ja Dunnettin monivertailutestillä merkitsevyyden määrittämiseksi (p < 0,05). Merkitsevät p-arvot on esitetty kaaviossa muodossa *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Kaikki tilastolliset analyysit ja kaaviot suoritettiin ja luotiin GraphPad Prism 9.4.0 -ohjelmistolla.
TEM-kuva-analyysin Fiji/ImageJ-makrot ovat julkisesti saatavilla GitHubissa: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Mitokondrioiden tapahtumalokaattori (MEL) -makro on julkisesti saatavilla GitHubissa: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM ja Vijaya A. Mitokondriot: aineenvaihdunnan, homeostaasin, stressin, ikääntymisen ja epigenetiikan pääasialliset säätelijät. Indonesian. Biomedical Science. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Monipuolinen mitokondrioiden toimintahäiriö skitsofreniassa, kompleksi I mahdollisena patologisena kohteena. Skitsofrenia. resource. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. ja Beal, MF Mitokondrioiden toimintahäiriöt Parkinsonin taudissa. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG ja Mehta V. Stressaantuneet mitokondriot: invaasion kohteet Alzheimerin taudissa. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF ja Ferreira GK Mitokondriot ja aivot: bioenergetiikka ja muuta. Neurotoksiinit. resource. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. ym. Pleiotrooppiset mitokondriot: mitokondrioiden vaikutus hermosolujen kehitykseen ja sairauksiin. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. ja Morais, VA. Mitokondrioiden biogeneesi hermosoluissa: miten ja missä. Kansainvälisyys. J. Mohr. The Science. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. ja Zhao, J. Nisäkkäiden mitokondrioiden dynamiikan säätely: mahdollisuudet ja haasteet. front. endokriininen. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. ja Slack, RS Mitokondrioiden dynamiikka neurogeneesin säätelyssä: kehittyvistä aivoista aikuisen aivoihin. development. dynamic. 247, 47–53 (2018).