Kiitos käynnistäsi Nature.com-sivustolla. Käyttämäsi selainversio tukee CSS:ää rajoitetusti. Parhaan käyttökokemuksen saavuttamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan yhteensopivuustilan käytöstä Internet Explorerissa). Sillä välin näytämme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä jatkuvan tuen varmistamiseksi.
Suuren täyttöasteen omaavilla insuliininanopartikkeleilla (NP) on löydetty erilaisia ​​sovelluksia erilaisissa annosmuodoissa. Tässä työssä arvioidaan pakastekuivaus- ja sumutuskuivausprosessien vaikutusta insuliinilla täytettyjen kitosaaninanopartikkelien rakenteeseen, mannitolin kanssa tai ilman kryosuoja-aineena. Arvioimme myös näiden nanopartikkelien laatua liuottamalla ne uudelleen. Ennen dehydraatiota kitosaani/natriumtripolyfosfaatti/insuliini-silloitettujen nanopartikkelien hiukkaskoko optimoitiin 318 nm:iin, PDI oli 0,18, kapselointitehokkuus oli 99,4 % ja täyttöaste oli 25,01 %. Liuotuksen jälkeen kaikki nanopartikkelit, lukuun ottamatta pakkaskuivausmenetelmällä ilman mannitolin käyttöä valmistettuja, säilyttivät pallomaisen hiukkasrakenteensa. Verrattuna mannitolia sisältäviin, sumutuskuivattuihin nanopartikkeleihin, mannitolittomat sumutuskuivatut nanopartikkelit osoittivat myös pienimmän keskimääräisen hiukkaskoon (376 nm) ja korkeimman täyttöasteen (25,02 %), ja kuivaamalla saavutettiin samanlainen kapselointiaste (98,7 %) ja PDI (0,20). tai pakastekuivaustekniikoita. Ilman mannitolia suihkukuivatut nanopartikkelit vapautuivat myös insuliinia nopeimmin ja ottivat insuliinin tehokkaasti sisään. Tämä työ osoittaa, että suihkukuivaus voi kuivata insuliininanopartikkeleita ilman kryosuoja-aineita verrattuna perinteisiin pakastekuivausmenetelmiin, mikä luo suuremman lastauskapasiteetin, pienemmät lisäainevaatimukset ja käyttökustannukset, mikä on merkittävä etu.
Vuonna 19221,2,3 insuliini ja sen lääkevalmisteet ovat pelastaneet tyypin 1 diabetesta (T1DM) ja tyypin 2 diabetesta (T1DM) sairastavien potilaiden henkiä. Suurimolekyylipainoisena proteiinina insuliini kuitenkin aggregoituu helposti, proteolyyttiset entsyymit hajottavat sen ja poistuvat elimistöstä ensikierron vaikutuksen kautta. Tyypin 1 diabetesta sairastavat ihmiset tarvitsevat insuliinipistoksia loppuelämänsä ajan. Monet tyypin 2 diabetesta alun perin sairastavat potilaat tarvitsevat myös pitkäaikaisia ​​insuliinipistoksia. Päivittäiset insuliinipistokset ovat vakava päivittäisen kivun ja epämukavuuden lähde näille henkilöille, ja niillä on negatiivisia vaikutuksia mielenterveyteen. Tämän seurauksena muita, vähemmän epämukavia insuliinin antotapoja, kuten suun kautta otettavaa insuliinia, tutkitaan laajasti,5 koska niillä on potentiaalia palauttaa noin 5 miljardin diabeetikon elämänlaatu maailmanlaajuisesti.
Nanohiukkasteknologia on tuonut merkittävän edistysaskeleen suun kautta otettavan insuliinin ottamisessa4,6,7. Sellaisen, joka kapseloi insuliinin tehokkaasti ja suojaa sitä hajoamiselta kohdennettua annostelua varten tiettyihin kehon osiin. Nanohiukkasformulaatioiden käytöllä on kuitenkin useita rajoituksia, jotka johtuvat pääasiassa hiukkassuspensioiden stabiiliusongelmista. Varastoinnin aikana voi esiintyä jonkin verran aggregaatiota, mikä vähentää insuliinilla ladattujen nanohiukkasten biologista hyötyosuutta8. Lisäksi nanohiukkasten ja insuliinin polymeerimatriisin kemiallinen stabiilius on myös otettava huomioon insuliininanopartikkelien (NP) stabiilisuuden varmistamiseksi. Tällä hetkellä pakkaskuivaustekniikka on kultainen standardi stabiilien NP-hiukkasten luomiseksi ja samalla ei-toivottujen muutosten estämiseksi varastoinnin aikana9.
Pakastekuivaus vaatii kuitenkin kryosuoja-aineiden lisäämistä, jotta jääkiteiden mekaaninen rasitus ei vaikuta nanopartikkelien pallomaiseen rakenteeseen. Tämä vähentää merkittävästi insuliininanopartikkelien määrää kylmäkuivauksen jälkeen, koska kryosuoja-aine vie suurimman osan painosuhteesta. Siksi tuotetut insuliininanopartikkelit havaitaan usein sopimattomiksi kuivien jauhevalmisteiden, kuten oraalisten tablettien ja oraalisten kalvojen, valmistukseen, koska insuliinin terapeuttisen ikkunan saavuttamiseksi tarvitaan suuria määriä kuivia nanopartikkeleita.
Sumutuskuivaus on tunnettu ja edullinen teollisen mittakaavan prosessi kuivien jauheiden valmistamiseksi nestemäisistä faaseista lääketeollisuudessa10,11. Hiukkasten muodostumisprosessin hallinta mahdollistaa useiden bioaktiivisten yhdisteiden asianmukaisen kapseloinnin 12, 13. Lisäksi siitä on tullut tehokas tekniikka kapseloitujen proteiinien valmistukseen oraalista antoa varten. Sumutuskuivauksen aikana vesi haihtuu erittäin nopeasti, mikä auttaa pitämään hiukkasytimen lämpötilan alhaisena11,14, mikä mahdollistaa sen käytön lämpöherkkien komponenttien kapseloinnissa. Ennen sumutuskuivausta pinnoitemateriaali tulee homogenisoida perusteellisesti kapseloituja ainesosia sisältävän liuoksen kanssa11,14. Toisin kuin pakkaskuivaus, sumutuskuivauksessa tapahtuva homogenisointi ennen kapselointia parantaa kapselointitehokkuutta dehydraation aikana. Koska sumutuskuivauskapselointiprosessi ei vaadi kryosuoja-aineita, sumutuskuivausta voidaan käyttää korkean latauspitoisuuden omaavien kuivattujen nanopartikkelien valmistukseen.
Tässä tutkimuksessa raportoidaan insuliinilla ladattujen nanopartikkelien tuottamista kitosaanin ja natriumtripolyfosfaatin ristisilloituksella ionigeelimenetelmällä. Ionigeeliytys on valmistusmenetelmä, joka mahdollistaa nanopartikkelien tuottamisen kahden tai useamman ionilajin välisten sähköstaattisten vuorovaikutusten kautta tietyissä olosuhteissa. Sekä pakkaskuivaus- että sumutuskuivaustekniikoita käytettiin optimoitujen kitosaani/natriumtripolyfosfaatti/insuliini-ristisilloitettujen nanopartikkelien kuivaamiseen. Kuivauksen jälkeen niiden morfologia analysoitiin SEM-elektronmikroskooppisesti (SEM). Niiden rekombinaatiokykyä arvioitiin mittaamalla niiden kokojakauma, pintavaraus, PDI, kapselointitehokkuus ja latauspitoisuus. Eri kuivausmenetelmillä tuotettujen uudelleenliuenneiden nanopartikkelien laatua arvioitiin myös vertaamalla niiden insuliinisuojaa, vapautumiskäyttäytymistä ja solujen ottotehokkuutta.
Sekoitetun liuoksen pH ja kitosaanin ja insuliinin suhde ovat kaksi keskeistä tekijää, jotka vaikuttavat lopullisten nanopartikkelien hiukkaskokoon ja kapselointitehokkuuteen (EE), koska ne vaikuttavat suoraan ionotrooppiseen geeliytymisprosessiin. Sekoitetun liuoksen pH:n osoitettiin korreloivan voimakkaasti hiukkaskoon ja kapselointitehokkuuden kanssa (kuva 1a). Kuten kuvassa 1a on esitetty, pH:n noustessa arvosta 4,0 arvoon 6,0 keskimääräinen hiukkaskoko (nm) pieneni ja EE kasvoi merkittävästi, kun taas pH:n noustessa arvoon 6,5 keskimääräinen hiukkaskoko alkoi kasvaa ja EE pysyi muuttumattomana. Kun kitosaanin ja insuliinin suhde kasvoi, myös keskimääräinen hiukkaskoko kasvoi. Lisäksi EE:ssä ei havaittu muutosta, kun nanopartikkeleita valmistettiin kitosaani/insuliini-massasuhteella, joka oli yli 2,5:1 (w/w) (kuva 1b). Siksi tässä tutkimuksessa käytettiin optimaalisia valmistusolosuhteita (pH 6,0, kitosaani/insuliini-massasuhde 2,5:1) insuliinilla ladattujen nanopartikkelien valmistukseen. nanopartikkeleita jatkotutkimuksia varten. Näissä valmistusolosuhteissa insuliininanopartikkelien keskimääräinen partikkelikoko optimoitiin 318 nm:iin (kuva 1c), PDI oli 0,18, upotustehokkuus oli 99,4 %, zetapotentiaali oli 9,8 mV ja insuliinipitoisuus oli 25,01 % (m/m). Läpäisyelektronimikroskopian (TEM) tulosten perusteella optimoidut nanopartikkelit olivat karkeasti pallomaisia ​​ja erillisiä, ja niiden koko oli suhteellisen tasainen (kuva 1d).
Insuliininanopartikkelien parametrien optimointi: (a) pH:n vaikutus insuliininanopartikkelien keskimääräiseen halkaisijaan ja kapselointitehokkuuteen (EE) (valmistettu kitosaanin ja insuliinin massasuhteella 5:1); (b) kitosaani ja insuliinin massasuhteen vaikutus insuliininanopartikkelien keskimääräiseen halkaisijaan ja kapselointitehokkuuteen (EE) (valmistettu pH-arvossa 6); (c) optimoitujen insuliininanopartikkelien hiukkaskokojakauma; (d) optimoitujen insuliininanopartikkelien TEM-mikrokuva.
On hyvin tunnettua, että kitosaani on heikko polyelektrolyytti, jonka pKa on 6,5. Se on positiivisesti varautunut happamassa väliaineessa, koska sen pääaminoryhmä on protonoitu vetyioneilla15. Siksi sitä käytetään usein kantajana negatiivisesti varautuneiden makromolekyylien kapseloimiseksi. Tässä tutkimuksessa kitosaania käytettiin kapseloimaan insuliinia, jonka isoelektrinen piste oli 5,3. Koska kitosaania käytetään pinnoitemateriaalina, sen osuuden kasvaessa nanopartikkelien ulkokerroksen paksuus kasvaa vastaavasti, mikä johtaa suurempaan keskimääräiseen partikkelikokoon. Lisäksi suuremmat kitosaanipitoisuudet voivat kapseloida enemmän insuliinia. Meidän tapauksessamme EE oli korkein, kun kitosaanin ja insuliinin suhde saavutti 2,5:1, eikä EE:ssä tapahtunut merkittävää muutosta, kun suhde jatkuvasti kasvoi.
Kitosaanin ja insuliinin suhteen lisäksi pH:lla oli ratkaiseva rooli nanopartikkelien valmistuksessa. Gan ym. 17 tutkivat pH:n vaikutusta kitosaaninanopartikkelien hiukkaskokoon. He havaitsivat hiukkaskoon jatkuvan pienenemisen, kunnes pH saavutti arvon 6,0, ja merkittävää hiukkaskoon kasvua havaittiin pH:ssa > 6,0, mikä on yhdenmukaista havaintojemme kanssa. Tämä ilmiö johtuu siitä, että pH:n noustessa insuliinimolekyyli saa negatiivisen pintavarauksen, mikä suosii sähköstaattisia vuorovaikutuksia kitosaani/natriumtripolyfosfaatti (TPP) -kompleksin kanssa, mikä johtaa pieneen hiukkaskokoon ja korkeaan EE:hen. Kuitenkin, kun pH säädettiin arvoon 6,5, kitosaanin aminoryhmät deprotonoituivat, mikä johti kitosaanin laskostumiseen. Näin ollen korkea pH johtaa aminoionien vähäisempään altistumiseen TPP:lle ja insuliinille, mikä johtaa pienempään silloittumiseen, suurempaan lopulliseen keskimääräiseen hiukkaskokoon ja pienempään EE:hen.
Pakastekuivattujen ja sumutuskuivattujen nanopartikkelien morfologisten ominaisuuksien analysointi voi ohjata parempien dehydraatio- ja jauheenmuodostustekniikoiden valintaa. Edullisen menetelmän tulisi tarjota lääkkeen stabiilius, tasainen hiukkasmuoto, suuri lääkeainepitoisuus ja hyvä liukoisuus alkuperäiseen liuokseen. Tässä tutkimuksessa, jotta näitä kahta tekniikkaa voitaisiin vertailla paremmin, dehydraation aikana käytettiin insuliinin nanopartikkeleita, joissa oli tai ei ollut 1 % mannitolia. Mannitolia käytetään täyteaineena tai kryosuoja-aineena erilaisissa kuivajauheformulaatioissa pakkaskuivaukseen ja sumutuskuivaukseen. Kuten kuvassa 2a on esitetty, lyofilisoiduissa insuliininanohiukkasissa ilman mannitolia havaittiin pyyhkäisyelektronimikroskopialla (SEM) erittäin huokoinen jauherakenne, jossa oli suuret, epäsäännölliset ja karheat pinnat. Kuivauksen jälkeen jauheessa havaittiin vain muutamia erillisiä hiukkasia (kuva 2e). Nämä tulokset osoittivat, että useimmat nanopartikkelit hajosivat pakkaskuivauksen aikana ilman kryosuoja-ainetta. Pakastekuivatuissa ja sumutuskuivatuissa insuliininanohiukkasissa, jotka sisälsivät 1 % mannitolia, havaittiin pallomaisia ​​nanopartikkeleita, joilla oli sileäpinta (kuva 2b, d, f, h). Ilman mannitolia sumutuskuivatut insuliininanohiukkaset pysyivät pallomaisina, mutta niiden pinta oli ryppyinen. (Kuva 2c). Pallomaisia ​​ja ryppyisiä pintoja käsitellään tarkemmin alla olevissa vapautumiskäyttäytymistä ja solujen sisäänottoa käsittelevissä testeissä. Kuivattujen nanopartikkelien näkyvän ulkonäön perusteella sekä mannitolia sisältämättömät sumutuskuivatut nanopartikkelit että mannitolilla pakastekuivatut ja sumutuskuivatut nanopartikkelit tuottivat hienojakoisia nanopartikkelijauheita (kuva 2f, g, h). Mitä suurempi hiukkaspintojen välinen pinta-ala on, sitä suurempi on liukoisuus ja siten myös vapautumisnopeus.
Erilaisten dehydratoitujen insuliini-NP:iden morfologia: (a) kylmäkuivattujen insuliini-NP:iden SEM-kuva ilman mannitolia; (b) kylmäkuivattujen insuliini-NP:iden SEM-kuva mannitolin kanssa; (c) sumutuskuivattujen insuliini-NP:iden ilman mannitolia SEM-kuva; (d) SEM-kuva mannitolin kanssa sumutuskuivatuista insuliini-NP:istä; (e) kuva kylmäkuivatusta insuliini-NP-jauheesta ilman mannitolia; (f) kuva kylmäkuivatuista insuliini-NP:istä mannitolin kanssa; (g) Kuva sumutuskuivatusta insuliini-NP-jauheesta ilman mannitolia; (h) kuva sumutuskuivatusta insuliini-NP-jauheesta mannitolin kanssa.
Pakastekuivauksen aikana mannitoli toimii kryosuoja-aineena, pitäen nanopartikkelit amorfisessa muodossa ja estäen jääkiteiden aiheuttamat vauriot19. Sitä vastoin sumutuskuivauksessa ei ole pakastusvaihetta. Siksi mannitolia ei tarvita tässä menetelmässä. Itse asiassa sumutuskuivatut nanopartikkelit ilman mannitolia tuottivat hienompia nanopartikkeleita, kuten aiemmin on kuvattu. Mannitoli voi kuitenkin edelleen toimia täyteaineena sumutuskuivausprosessissa, jolloin nanopartikkeleille saadaan pallomaisempi rakenne20 (kuva 2d), mikä auttaa saavuttamaan tällaisten kapseloitujen nanopartikkelien tasaisen vapautumiskäyttäytymisen. Lisäksi on selvää, että sekä pakastekuivatuissa että sumutuskuivatuissa mannitolia sisältävissä insuliini-NP:issä voidaan havaita joitakin suuria hiukkasia (kuva 2b, d), mikä voi johtua mannitolin kertymisestä hiukkasytimeen yhdessä kapseloidun insuliinin kanssa. Kitosaanikerrokseen. On syytä huomata, että tässä tutkimuksessa mannitolin ja kitosaanin suhde pidetään suhteessa 5:1, jotta pallomainen rakenne säilyisi ehjänä dehydraation jälkeen. Näin suuri määrä täyteainetta voi myös suurentaa kuivattujen nanopartikkelien hiukkaskokoa.
Fourier-muunnosinfrapuna-vaimennetulla kokonaisheijastusspektroskopialla (FTIR-ATR) karakterisoitiin vapaan insuliinin, kitosaanin, kitosaanin, TPP:n ja insuliinin fysikaalinen seos. Kaikki dehydratoidut nanopartikkelit karakterisoitiin FTIR-ATR-spektroskopialla. Kapseloiduissa, mannitolin kanssa pakastekuivatuissa nanopartikkeleissa ja mannitolin kanssa ja ilman sumutuskuivatuissa nanopartikkeleissa havaittiin 1641, 1543 ja 1412 cm⁻¹:n kaistaintensiteetit (kuva 3). Kuten aiemmin on raportoitu, nämä lujuuden lisääntymiset liittyivät kitosaanin, TPP:n ja insuliinin väliseen ristisilloittumiseen. Kitosaanin ja insuliinin välisen vuorovaikutuksen tutkimus osoitti, että insuliinilla ladattujen kitosaaninanopartikkelien FTIR-spektreissä kitosaanivyöhyke limittyi insuliinin vyöhykkeen kanssa, mikä lisäsi karbonyyli- (1641 cm⁻¹) ja amiinivyöhykettä (1543 cm⁻¹). TPP:n tripolyfosfaattiryhmät ovat sitoutuneet kitosaanin ammoniumryhmiin muodostaen vyöhykkeen kohdassa 1412 cm⁻¹.
Vapaan insuliinin, kitosaanin, kitosaani/TPP/insuliinin fysikaalisten seosten ja eri menetelmillä dehydratoitujen nanopartikkelien FTIR-ATR-spektrit.
Lisäksi nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​SEM-tulosten kanssa, jotka osoittivat, että kapseloidut nanopartikkelit pysyivät ehjinä sekä mannitolilla suihkutettaessa että pakastekuivattaessa, mutta ilman mannitolia vain sumutuskuivaus tuotti kapseloituja hiukkasia. Sitä vastoin ilman mannitolia pakastekuivattujen nanopartikkelien FTIR-ATR-spektritulokset olivat hyvin samankaltaisia ​​kuin kitosaanin, TPP:n ja insuliinin fysikaalisen seoksen. Tämä tulos osoittaa, että kitosaanin, TPP:n ja insuliinin välisiä ristisidoksia ei enää esiinny ilman mannitolia pakastekuivatuissa nanopartikkeleissa. NP:iden rakenne tuhoutui pakkaskuivauksen aikana ilman kryosuoja-ainetta, mikä näkyy SEM-tuloksissa (kuva 2a). Dehydratoitujen insuliini-NP:iden morfologian ja FTIR-tulosten perusteella rekonstituutiokokeissa käytettiin vain kylmäkuivattuja, sumutuskuivattuja ja mannitolittomia nanopartikkeleita ja mannitolittomia nanopartikkeleita mannitolittomien nanopartikkelien hajoamisen vuoksi dehydraation aikana. keskustele.
Kuivausta käytetään pitkäaikaiseen varastointiin ja uudelleenkäsittelyyn muiksi formulaatioiksi. Kuivien nanopartikkelien kyky liueta varastoinnin jälkeen on ratkaisevan tärkeää niiden käytölle erilaisissa formulaatioissa, kuten tableteissa ja kalvoissa. Havaitsimme, että mannitolin puuttuessa sumutuskuivattujen insuliininanopartikkelien keskimääräinen hiukkaskoko kasvoi vain hieman liuottamisen jälkeen. Toisaalta mannitolin kanssa sumutuskuivattujen ja pakastekuivattujen insuliininanopartikkelien hiukkaskoko kasvoi merkittävästi (taulukko 1). PDI ja EE eivät muuttuneet merkittävästi (p > 0,05) kaikkien nanopartikkelien rekombinaation jälkeen tässä tutkimuksessa (taulukko 1). Tämä tulos osoittaa, että suurin osa hiukkasista pysyi ehjinä uudelleenliuottamisen jälkeen. Mannitolin lisääminen kuitenkin vähensi huomattavasti lyofilisoitujen ja sumutuskuivattujen mannitolinanopartikkelien insuliinipitoisuutta (taulukko 1). Sitä vastoin ilman mannitolia sumutuskuivattujen nanopartikkelien insuliinipitoisuus pysyi samana kuin ennen (taulukko 1).
On hyvin tunnettua, että nanopartikkelien määrä on ratkaisevan tärkeää lääkkeiden annostelussa. Pienten nanopartikkelien kohdalla terapeuttisen kynnyksen saavuttamiseksi tarvitaan erittäin suuria määriä materiaalia. Tällaisten suurten nanopartikkelipitoisuuksien korkea viskositeetti johtaa kuitenkin hankalia ja vaikeuksiin suun kautta annettavassa annostelussa ja injektoitavissa lääkemuodoissa 22. Lisäksi insuliini-nanopartikkeleita voidaan käyttää myös tablettien ja viskoosien biofilmien valmistukseen 23, 24, mikä edellyttää suurten nanopartikkelimäärien käyttöä pienillä täyttöasteilla, mikä johtaa suuriin tabletteihin ja paksuihin biofilmeihin, jotka eivät sovellu suun kautta otettavaksi. Siksi kuivatut nanopartikkelit, joilla on korkea insuliinipitoisuus, ovat erittäin toivottavia. Tuloksemme viittaavat siihen, että mannitolittomien sumutuskuivattujen nanopartikkelien korkea insuliinipitoisuus voi tarjota monia houkuttelevia etuja näille vaihtoehtoisille annostelumenetelmille.
Kaikkia kuivattuja nanopartikkeleita säilytettiin jääkaapissa kolme kuukautta. SEM-tulokset osoittivat, että kaikkien kuivattujen nanopartikkelien morfologia ei muuttunut merkittävästi kolmen kuukauden säilytyksen aikana (kuva 4). Vedessä uudelleenliuotuksen jälkeen kaikkien nanopartikkelien EE-arvo laski hieman ja ne vapauttivat noin pienen määrän (~5 %) insuliinia kolmen kuukauden säilytysjakson aikana (taulukko 2). Kaikkien nanopartikkelien keskimääräinen hiukkaskoko kuitenkin kasvoi. Ilman mannitolia sumutuskuivattujen nanopartikkelien hiukkaskoko kasvoi 525 nm:iin, kun taas mannitolin kanssa sumutuskuivattujen ja pakastekuivattujen nanopartikkelien hiukkaskoko kasvoi vastaavasti 872 nm:iin ja 921 nm:iin (taulukko 2).
Kolme kuukautta säilytettyjen erilaisten dehydratoitujen insuliinin nanopartikkelien morfologia: (a) mannitolin kanssa säilytettyjen kylmäkuivattujen insuliinin nanopartikkelien SEM-kuva; (b) mannitolia sisältämättömien sumutuskuivattujen insuliinin nanopartikkelien SEM-kuva; (c) ilman mannitolia säilytetyt sumutuskuivattujen insuliinin nanopartikkelien SEM-kuvat.
Lisäksi mannitolin kanssa sumutuskuivatuissa ja pakastekuivatuissa uudelleen muodostetuissa insuliininanopartikkeleissa havaittiin saostumia (kuva S2). Tämä voi johtua siitä, että suuret hiukkaset eivät ole suspendoituneet kunnolla veteen. Kaikki yllä olevat tulokset osoittavat, että sumutuskuivaustekniikka voi suojata insuliininanopartikkeleita kuivumiselta ja että suuria määriä insuliininanopartikkeleita voidaan saada ilman täyteaineita tai kryosuoja-aineita.
Insuliinin pidättymistä testattiin pH = 2,5 -väliaineessa pepsiinin, trypsiinin ja α-kymotrypsiinin kanssa osoittaakseen nanopartikkelien suojaavan kyvyn entsymaattista pilkkomista vastaan ​​dehydraation jälkeen. Dehydratoitujen nanopartikkelien insuliinin pidättymistä verrattiin vastavalmistettujen nanopartikkelien insuliinin pidättymiseen, ja vapaata insuliinia käytettiin negatiivisena kontrollina. Tässä tutkimuksessa vapaa insuliini eliminoitui nopeasti 4 tunnin kuluessa kaikissa kolmessa entsymaattisessa käsittelyssä (kuva 5a–c). Sitä vastoin mannitolin kanssa pakastekuivattujen nanopartikkelien ja mannitolin kanssa tai ilman sumutuskuivattujen nanopartikkelien insuliinin eliminaatiotestaus osoitti näiden nanopartikkelien merkittävästi paremman suojan entsymaattista pilkkomista vastaan, mikä oli samanlainen kuin vastavalmistettujen insuliini-NP:iden (kuva 1). 5a–c). Pepsiinin, trypsiinin ja α-kymotrypsiinin nanopartikkelien avulla yli 50 %, 60 % ja 75 % insuliinista voitiin suojata 4 tunnin kuluessa (kuva 5a–c). Tämä insuliinilta suojaava kyky voi lisätä insuliinin imeytymisen todennäköisyyttä verenkiertoon25. Nämä tulokset viittaavat siihen, että sumutuskuivaus tai ilman mannitolia ja pakkaskuivaus mannitolin kanssa voi säilyttää NP:iden insuliinilta suojaavan kyvyn dehydraation jälkeen.
Dehydratoitujen insuliini-NP:iden suojaus- ja vapautumiskäyttäytyminen: (a) insuliinin suojaus pepsiiniliuoksessa; (b) insuliinin suojaus trypsiiniliuoksessa; (c) insuliinin suojaus α-kymotrypsiiniliuoksella; (d) Dehydratoitujen NP:iden vapautumiskäyttäytyminen pH = 2,5 liuoksessa; (e) Dehydratoitujen NP:iden vapautumiskäyttäytyminen pH = 6,6 liuoksessa; (f) Dehydratoitujen NP:iden vapautumiskäyttäytyminen pH = 7,0 liuoksessa.
Tuoreeltaan valmistettuja ja uudelleenliuotettuja kuivia insuliini-NP:itä inkuboitiin erilaisissa puskureissa (pH = 2,5, 6,6, 7,0) 37 °C:ssa simuloiden mahalaukun, pohjukaissuolen ja ohutsuolen yläosan pH-ympäristöä insuliinin vaikutuksen tutkimiseksi insuliiniresistenssiin. Vapautumiskäyttäytyminen eri ympäristöissä. Ruoansulatuskanavan fragmentti. pH-arvossa 2,5 insuliinilla ladatut nanopartikkelit ja uudelleenliuenneet kuivat insuliinin nanopartikkelit vapautuivat aluksi voimakkaasti ensimmäisen tunnin aikana, minkä jälkeen vapautuminen oli hidasta seuraavien 5 tunnin aikana (kuva 5d). Tämä nopea vapautuminen alussa johtuu todennäköisesti proteiinimolekyylien nopeasta desorptiosta pinnalta, jotka eivät ole täysin immobilisoituneet hiukkasen sisäiseen rakenteeseen. pH-arvossa 6,5 ​​insuliinilla ladatut nanopartikkelit ja uudelleenliuotetut kuivat insuliinin nanopartikkelit vapautuivat tasaisesti ja hitaasti 6 tunnin aikana, koska testiliuoksen pH oli samanlainen kuin nanopartikkeleilla valmistetun liuoksen (kuva 5e). pH-arvossa 7 nanopartikkelit olivat epästabiileja ja hajosivat lähes kokonaan kahden ensimmäisen tunnin aikana (kuva 5f). Tämä johtuu siitä, että kitosaanin deprotonaatio tapahtuu korkeammassa pH-arvossa, mikä johtaa vähemmän kompaktiin polymeeriverkkoon ja ladatun insuliinin vapautumiseen.
Lisäksi ilman mannitolia sumutuskuivatut insuliinin nanopartikkelit vapautuivat nopeammin kuin muut dehydratoidut nanopartikkelit (kuva 5d–f). Kuten aiemmin on kuvattu, ilman mannitolia kuivatut, uudelleen valmistettujen insuliinin nanopartikkelien hiukkaskoko oli pienin. Pienet hiukkaset tarjoavat suuremman pinta-alan, joten suurin osa lääkkeestä on hiukkasen pinnalla tai lähellä sitä, mikä johtaa lääkkeen nopeaan vapautumiseen26.
NP-partikkelien sytotoksisuutta tutkittiin MTT-määrityksellä. Kuten kuvassa S4 on esitetty, kaikkien dehydratoitujen NP-partikkelien ei havaittu vaikuttavan merkittävästi solujen elinkykyyn 50–500 μg/ml:n pitoisuuksilla, mikä viittaa siihen, että kaikkia dehydratoituja NP-partikkeleita voidaan käyttää turvallisesti terapeuttisen ikkunan saavuttamiseksi.
Maksa on tärkein elin, jonka kautta insuliini suorittaa fysiologisia toimintojaan. HepG2-solut ovat ihmisen maksasolulinja, jota käytetään yleisesti maksasolujen ottomallina in vitro. Tässä HepG2-soluja käytettiin arvioimaan pakastekuivaus- ja sumutuskuivausmenetelmillä dehydratoitujen nanopartikkelien soluottoa. Solujen ottoa arvioitiin konfokaalisella laserskannauksella virtaussytometrialla ja näkölaitteella useiden tuntien inkuboinnin jälkeen vapaalla FITC-insuliinilla 25 μg/ml pitoisuudessa, tuoreilla FITC-insuliinilla ladatuilla nanopartikkeleilla ja dehydratoiduilla FITC-insuliinilla ladatuilla nanopartikkeleilla samoilla insuliinipitoisuuksilla. Kvantitatiiviset mikroskopiahavainnot (CLSM) tehtiin. Mannitolia sisältämättömät kylmäkuivatut nanopartikkelit tuhoutuivat dehydraation aikana, eikä niitä arvioitu tässä testissä. Tuoreiden insuliinilla ladattujen nanopartikkelien, mannitolia sisältävien kylmäkuivattujen nanopartikkelien ja mannitolia sisältävien ja ilman niitä olevien sumutuskuivattujen nanopartikkelien (kuva 6a) solunsisäiset fluoresenssi-intensiteetit olivat vastaavasti 4,3, 2,6, 2,4 ja 4,1 kertaa korkeammat kuin vapaiden nanopartikkelien. FITC-insuliiniryhmässä (kuva 6b). Nämä Tulokset viittaavat siihen, että kapseloitu insuliini imeytyy soluihin voimakkaammin kuin vapaa insuliini, pääasiassa tutkimuksessa tuotettujen insuliinilla ladattujen nanopartikkelien pienemmän koon vuoksi.
HepG2-solujen otto 4 tunnin inkuboinnin jälkeen tuoreeltaan valmistettujen ja dehydratoitujen NP-partikkelien kanssa: (a) FITC-insuliinin oton jakautuminen HepG2-soluissa. (b) Fluoresenssi-intensiteettien geometrinen keskiarvo analysoituna virtaussytometrialla (n = 3), *P < 0,05 verrattuna vapaaseen insuliiniin.
Samoin CLSM-kuvat osoittivat, että tuoreeltaan valmistettujen FITC-insuliinilla ladattujen nanopartikkelien ja FITC-insuliinilla ladattujen sumutuskuivattujen nanopartikkelien (ilman mannitolia) FITC-fluoresenssi-intensiteetit olivat paljon voimakkaampia kuin muiden näytteiden (kuva 6a). Lisäksi mannitolin lisäys lisäsi liuoksen korkeampaa viskositeettia, mikä lisäsi vastustuskykyä solujen ottoa vastaan, mikä johti insuliinin lisääntymisen vähenemiseen. Nämä tulokset viittaavat siihen, että mannitolittomat sumutuskuivatut nanopartikkelit osoittivat korkeinta solujen ottotehokkuutta, koska niiden hiukkaskoko oli pienempi kuin pakastekuivattujen nanopartikkelien uudelleenliuottamisen jälkeen.
Kitosaani (keskimääräinen molekyylipaino 100 kDa, 75–85 % deasetyloitu) hankittiin Sigma-Aldrichilta (Oakville, Ontario, Kanada). Natriumtripolyfosfaatti (TPP) hankittiin VWR:ltä (Radnor, Pennsylvania, USA). Tässä tutkimuksessa käytetty rekombinantti ihmisinsuliini oli peräisin Fisher Scientificiltä (Waltham, MA, USA). Fluoreseiini-isotiosyanaatilla (FITC) merkitty ihmisinsuliini ja 4',6-diamidino-2-fenyyli-indolidihydrokloridi (DAPI) hankittiin Sigma-Aldrichilta (Oakville, Ontario, Kanada). HepG2-solulinja hankittiin ATCC:ltä (Manassas, Virginia, USA). Kaikki muut reagenssit olivat analyyttistä tai kromatografista laatua.
Valmista 1 mg/ml CS-liuos liuottamalla se kahdesti tislattuun veteen (DD-vesi), joka sisältää 0,1 % etikkahappoa. Valmista 1 mg/ml TPP- ja insuliiniliuokset liuottamalla ne vastaavasti DD-veteen ja 0,1 % etikkahappoon. Esemulsio valmistettiin polytron PCU-2-110 -nopealla homogenisaattorilla (Brinkmann Ind. Westbury, NY, USA). Valmistusprosessi on seuraava: ensin 2 ml TPP-liuosta lisätään 4 ml:aan insuliiniliuosta ja seosta sekoitetaan 30 minuuttia ja sekoitetaan kokonaan. Sitten sekoitettu liuos lisättiin tipoittain CS-liuokseen ruiskulla nopealla sekoituksella (10 000 rpm). Seoksia pidettiin nopealla sekoituksella (15 000 rpm) jäähauteessa 30 minuuttia, ja niiden pH säädettiin tiettyyn pH-arvoon silloitettujen insuliini-NP:iden saamiseksi. Insuliinin NP:iden homogenisoimiseksi edelleen ja hiukkaskoon pienentämiseksi niitä sonikoitiin vielä 30 minuuttia... jäähaute käyttäen koetintyyppistä ultraäänilaitetta (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Saksa).
Insuliini-NPS-partikkeleiden Z-keskimääräinen halkaisija, polydispersiteetti-indeksi (PDI) ja zeta-potentiaali testattiin dynaamisen valonsironnan (DLS) avulla käyttäen Litesizer 500 -laitetta (Anton Paar, Graz, Itävalta) laimentamalla ne DD-veteen 25 °C:ssa. Morfologia ja kokojakauma karakterisoitiin Hitachi H7600 -transmissioelektronimikroskoopilla (TEM) (Hitachi, Tokio, Japani), ja kuvat analysoitiin myöhemmin Hitachi-kuvantamisohjelmistolla (Hitachi, Tokio, Japani). Insuliini-NP-partikkeleiden kapselointitehokkuuden (EE) ja latauskapasiteetin (LC) arvioimiseksi NP-partikkelit pipetoitiin ultrasuodatusputkiin, joiden molekyylipainoraja oli 100 kDa, ja sentrifugoitiin 500 x g:ssä 30 minuutin ajan. Suodoksessa oleva kapseloimaton insuliini kvantifioitiin Agilent 1100 -sarjan HPLC-järjestelmällä (Agilent, Santa Clara, Kalifornia, USA), joka koostui kvaternäärisestä pumpusta, automaattisesta näytteenottajasta, kolonninlämmittimestä ja DAD-detektorista. Insuliini analysoitiin C18-kolonnilla. (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, USA) ja detektoitiin 214 nm:ssä. Liikkuva faasi oli asetonitriili ja vesi, joka sisälsi 0,1 % TFA:ta, gradienttisuhteet 10/90 - 100/0, ja ajettiin 10 minuuttia. Liikkuva faasi pumpattiin virtausnopeudella 1,0 ml/min. Kolonnin lämpötila asetettiin 20 °C:seen. Laske EE:n ja LC:n prosenttiosuudet käyttämällä yhtälöitä (1) ja (2).
Insuliininanopartikkelien optimoimiseksi testattiin erilaisia ​​CS/insuliini-suhteita välillä 2,0–4,0. Valmistuksen aikana lisättiin eri määriä CS-liuosta, kun taas insuliini/TPP-seos pidettiin vakiona. Insuliininanopartikkeleita valmistettiin pH-alueella 4,0–6,5 kontrolloimalla seoksen pH:ta huolellisesti kaikkien liuosten (insuliini, TPP ja CS) lisäämisen jälkeen. Insuliininanopartikkelien EE-arvoa ja hiukkaskokoa arvioitiin eri pH-arvoilla ja CS/insuliini-massasuhteilla insuliininanopartikkelien muodostumisen optimoimiseksi.
Optimoidut insuliinin nanopartikkelit asetettiin alumiinisäiliöön ja peitettiin teipillä kiristetyllä paperilla. Tämän jälkeen ruuvatut säiliöt asetettiin Labconco FreeZone -pakastekuivaajaan (Labconco, Kansas City, MO, USA), jossa oli tarjotinkuivain. Lämpötila ja tyhjiöpaine asetettiin -10 °C:een ja 0,350 torriin ensimmäisten 2 tunnin ajaksi ja 0 °C:een ja 0,120 torriin jäljellä olevien 22 tunnin ajaksi 24 tunnista kuivien insuliinin nanopartikkelien saamiseksi.
Kapseloidun insuliinin tuottamiseen käytettiin Buchi Mini Spray Dryer B-290 -kuivainta (BÜCHI, Flawil, Sveitsi). Valitut kuivausparametrit olivat: lämpötila 100 °C, syöttövirtaus 3 l/min ja kaasun virtaus 4 l/min.
Insuliinin nanopartikkeleita ennen dehydraatiota ja sen jälkeen karakterisoitiin FTIR-ATR-spektroskopialla. Dehydratoituja nanopartikkeleita sekä vapaata insuliinia ja kitosaania analysoitiin Spectrum 100 FTIR -spektrofotometrillä (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA), joka oli varustettu yleiskäyttöisellä ATR-näytteenottolaitteella (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA). Signaalien keskiarvot saatiin 16 skannauksesta 4 cm2:n resoluutiolla 4000–600 cm2:n taajuusalueella.
Kuivien insuliinin nanopartikkelien morfologiaa arvioitiin Helios NanoLab 650 Focused Ion Beam-Scanning Electron Microscope (FIB-SEM) -mikroskoopilla (FEI, Hillsboro, Oregon, USA) otettujen pakastekuivattujen ja sumutuskuivattujen insuliinin nanopartikkelien SEM-kuvien avulla. Pääasiallinen käytetty parametri oli 5 keV jännite ja 30 mA virta.
Kaikki dehydratoidut insuliinin nanopartikkelit liuotettiin uudelleen dehydratoituun veteen. Hiukkaskoko, PDI, EE ja LC testattiin uudelleen käyttämällä aiemmin mainittua menetelmää niiden laadun arvioimiseksi dehydraation jälkeen. Anhydroinsuliinin nanopartikkelien stabiilius mitattiin myös testaamalla nanopartikkelien ominaisuuksia pitkäaikaisen säilytyksen jälkeen. Tässä tutkimuksessa kaikkia dehydraation jälkeen olevia nanopartikkeleita säilytettiin jääkaapissa kolme kuukautta. Kolmen kuukauden säilytyksen jälkeen nanopartikkeleista testattiin morfologinen hiukkaskoko, PDI, EE ja LC.
Liuota 5 ml uudelleenliuotettuja nanopartikkeleita 45 ml:aan simuloitua mahanestettä (pH 1,2, sisältää 1 % pepsiiniä), suolistonestettä (pH 6,8, sisältää 1 % trypsiniä) tai kymotrypsiiniliuosta (100 g/ml, fosfaattipuskurissa, pH 7,8) arvioidaksesi insuliinin tehoa nanopartikkelien suojaamisessa dehydraation jälkeen. Niitä inkuboitiin 37 °C:ssa 100 rpm:n sekoitusnopeudella. 500 μl liuosta kerättiin eri ajankohtina ja insuliinipitoisuus määritettiin HPLC:llä.
Tuoreeltaan valmistettujen ja dehydratoitujen insuliini-NP:iden vapautumiskäyttäytymistä in vitro testattiin dialyysipussimenetelmällä (molekyylipainon raja-arvo 100 kDa, Spectra Por Inc.). Tuoreeltaan valmistettuja ja uudelleenliuotettuja kuivia NP:itä dialysoitiin nesteissä, joiden pH oli 2,5, 6,6 ja 7,0 (0,1 M fosfaattipuskuroitu suolaliuos, PBS), mahalaukun, pohjukaissuolen ja ohutsuolen yläosan pH-ympäristön simuloimiseksi. Kaikkia näytteitä inkuboitiin 37 °C:ssa jatkuvassa ravistelussa nopeudella 200 rpm. Ime neste 5 ml:n dialyysipussin ulkopuolelle seuraavina aikoina: 0,5, 1, 2, 3, 4 ja 6 tuntia ja täydennä tilavuus välittömästi tuoreella dialysaatilla. Nesteen insuliinikontaminaatiota analysoitiin HPLC:llä, ja insuliinin vapautumisnopeus nanopartikkeleista laskettiin vapautuneen vapaan insuliinin ja nanopartikkeleihin kapseloidun insuliinin kokonaismäärän suhteesta (yhtälö 3).
Ihmisen maksasolukarsinoomasolulinja HepG2-soluja kasvatettiin 60 mm:n halkaisijaltaan olevissa maljoissa käyttäen Dulbeccon modifioitua Eagle-elatusainetta (DMEM), joka sisälsi 10 % naudan sikiön seerumia, 100 IU/ml penisilliiniä ja 100 μg/ml streptomysiiniä29. Viljelmiä pidettiin 37 °C:ssa, 95 %:n suhteellisessa kosteudessa ja 5 %:n hiilidioksidipitoisuudessa. Imetymiskantauksia varten HepG2-solut kylvettiin 1 × 105 solua/ml 8-kuoppaiselle Nunc Lab-Tek -kammiolevyjärjestelmälle (Thermo Fisher, NY, USA). Sytotoksisuusmäärityksiä varten ne kylvettiin 96-kuoppaisille levyille (Corning, NY, USA) tiheydellä 5 × 104 solua/ml.
MTT-määritystä käytettiin tuoreeltaan valmistettujen ja dehydratoitujen insuliini-NP:iden sytotoksisuuden arvioimiseen30. HepG2-solut kylvettiin 96-kuoppalevyille tiheydellä 5 × 104 solua/ml ja viljeltiin 7 päivää ennen testausta. Insuliini-NP:t laimennettiin eri pitoisuuksiin (50 - 500 μg/ml) viljelyalustassa ja annettiin sitten soluille. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen solut pestiin kolme kertaa PBS:llä ja inkuboitiin 0,5 mg/ml MTT:tä sisältävän alustan kanssa vielä 4 tuntia. Sytotoksisuutta arvioitiin mittaamalla keltaisen tetratsolium-MTT:n entsymaattinen pelkistyminen violetiksi formazaaniksi 570 nm:ssä käyttäen Tecan infinite M200 pro -spektrofotometrilevylukijaa (Tecan, Männedorf, Sveitsi).
NP-partikkelien soluunottotehokkuutta testattiin konfokaalilasermikroskopialla ja virtaussytometrianalyysillä. Nunc Lab-Tek -kammiolasijärjestelmän jokaista kuoppaa käsiteltiin vapaalla FITC-insuliinilla, FITC-insuliinilla ladatuilla NP-partikkeleilla ja rekonstituoiduilla 25 μg/ml dehydratoiduilla FITC-insuliini-NP-partikkeleilla samalla pitoisuudella ja inkuboitiin 4 tuntia. Solut pestiin 3 kertaa PBS:llä ja fiksoitiin 4 % paraformaldehydillä. Tumat värjättiin 4',6-diamidino-2-fenyyli-indolilla (DAPI). Insuliinin lokalisaatiota tarkkailtiin käyttämällä Olympus FV1000 -laserkeilaava/kaksifotoninen konfokaalimikroskooppi (Olympus, Shinjuku City, Tokio, Japani). Virtaussytometrianalyysiä varten samat pitoisuudet 10 μg/ml vapaata FITC-insuliinia, FITC-insuliinilla ladattuja NP-partikkeleita ja resolubilisoituja dehydratoituja FITC-insuliini-NP-partikkeleita lisättiin 96-kuoppalevyille, joihin oli kylvetty HepG2-soluja, ja inkuboitiin 4 tuntia. 4 tunnin kuluttua... Inkuboinnin jälkeen solut poistettiin ja pestiin kolme kertaa FBS:llä. 5 × 104 solua näytettä kohden analysoitiin BD LSR II -virtaussytometrillä (BD, Franklin Lakes, New Jersey, Yhdysvallat).
Kaikki arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta. Ryhmien väliset vertailut arvioitiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVAa tai t-testiä IBM SPSS Statistics 26 for Mac -ohjelmistolla (IBM, Endicott, New York, USA), ja p < 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitseväksi.
Tämä tutkimus osoittaa sumutuskuivauksen joustavuuden ja kyvyn kuivata silloitettuja kitosaani/TPP/insuliininanopartikkeleita paremmalla uudelleenliuotuksella verrattuna tavanomaisiin pakastekuivausmenetelmiin, joissa käytetään täyteaineita tai kryosuoja-aineita, ja suuremmalla kuormituskapasiteetilla. Optimoidut insuliininanopartikkelit tuottivat keskimäärin 318 nm:n hiukkaskoon ja 99,4 %:n kapselointitehokkuuden. Kuivauksen jälkeiset SEM- ja FTIR-tulokset osoittivat, että pallomainen rakenne säilyi vain sumutuskuivatuissa nanopartikkeleissa mannitolin kanssa ja ilman sekä mannitolin kanssa kylmäkuivatuissa partikkeleissa, mutta mannitolia sisältämättömät kylmäkuivatut nanopartikkelit hajosivat kuivauksen aikana. Uudelleenliuotuskykytestissä ilman mannitolia sumutuskuivatuilla insuliininanopartikkeleilla oli pienin keskimääräinen hiukkaskoko ja suurin kuormitus uudelleenliuotuksen jälkeen. Kaikkien näiden dehydratoitujen nanopartikkelien vapautumiskäyttäytyminen osoitti, että ne vapautuivat nopeasti pH-arvojen 2,5 ja 7 liuoksissa ja olivat erittäin stabiileja pH-arvojen 6,5 liuoksissa. Verrattuna muihin uudelleenliuotettuihin dehydratoituihin nanopartikkeleihin, ilman mannitolia sumutuskuivatut nanopartikkelit vapautuivat nopeimmin. Tämä tulos on yhdenmukainen soluissa havaitun tuloksen kanssa. soluunottokokeessa, koska mannitolin puuttuessa sumutuskuivatut nanopartikkelit säilyttivät lähes täysin tuoreeltaan valmistettujen nanopartikkelien soluunottotehokkuuden. Nämä tulokset viittaavat siihen, että mannitolittomalla sumutuskuivauksella valmistetut kuivat insuliininanopartikkelit soveltuvat parhaiten jatkojalostukseen muiksi vedettömiksi annosmuodoiksi, kuten oraalisiksi tableteiksi tai bioadhesiivisiksi kalvoiksi.
Immateriaalioikeuksista johtuen tämän tutkimuksen aikana tuotet ja/tai analysoidut aineistot eivät ole julkisesti saatavilla, mutta ne ovat saatavilla tekijöiltä kohtuullisesta pyynnöstä.
Kagan, A. Tyypin 2 diabetes: sosiaaliset ja tieteelliset alkuperät, lääketieteelliset komplikaatiot ja vaikutukset potilaisiin ja muihin. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. & Jiang, P. Insuliinin kapseloinnin kehitys: onko suun kautta anto nyt mahdollista? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. & Dass, CR Viimeaikaiset edistysaskeleet suun kautta otettavissa insuliinia sisältävissä liposomiannostelujärjestelmissä diabeteksen hoidossa. Interpretation. J. Pharmacy.549, 201–217 (2018).