Artikkeli on osa tutkimusaihetta ”Palkokasvien vastustuskyvyn parantaminen taudinaiheuttajia ja tuholaisia ​​vastaan”, katso kaikki 5 artikkelia
Sieni-kasvitauon nekroosia aiheuttava Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary -sienilajikkeen aiheuttaja käyttää moniportaista strategiaa eri isäntäkasvien tartuttamiseen. Tässä tutkimuksessa ehdotetaan diamiini-L-ornitiinin käyttöä vaihtoehtoisena torjuntastrategiana Phaseolus vulgaris L.:n molekyyli-, fysiologisten ja biokemiallisten vasteiden parantamiseksi Pseudomonas sclerotiorumin aiheuttamaa valkohometta vastaan. In vitro -kokeet osoittivat, että L-ornitiini esti merkittävästi S. pyrenoidosan rihmaston kasvua annoksesta riippuvalla tavalla. Lisäksi se kykeni merkittävästi vähentämään valkohomeen vakavuutta kasvihuoneolosuhteissa. L-ornitiini stimuloi käsiteltyjen kasvien kasvua, mikä osoittaa, että testatut L-ornitiinipitoisuudet eivät olleet fytotoksisia käsitellyille kasveille. Lisäksi L-ornitiini lisäsi ei-entsymaattisten antioksidanttien (liukoisten fenolien ja flavonoidien kokonaismäärä) ja entsymaattisten antioksidanttien (katalaasi (CAT), peroksidaasi (POX) ja polyfenolioksidaasi (PPO)) ilmentymistä ja lisäsi kolmen antioksidantteihin liittyvän geenin (PvCAT1, PvSOD ja PvGR) ilmentymistä. Lisäksi in silico -analyysi paljasti oletetun oksaloasetaattiasetyylihydrolaasi (SsOAH) -proteiinin läsnäolon S. sclerotiorum -genomissa, joka oli toiminnallisen analyysin, konservoituneiden domeenien ja topologian suhteen hyvin samankaltainen kuin Aspergillus fijiensis (AfOAH) ja Penicillium sp. (PlOAH) -bakteerien oksaloasetaattiasetyylihydrolaasi (SsOAH) -proteiinit. Mielenkiintoista on, että L-ornitiinin lisääminen perunadekstroosiliemeen (PDB) vähensi merkittävästi SsOAH-geenin ilmentymistä S. sclerotiorum -sienirihmastossa. Vastaavasti L-ornitiinin ulkoinen annostelu vähensi merkittävästi SsOAH-geenin ilmentymistä käsitellyistä kasveista kerätyissä sienirihmastoissa. Lopuksi L-ornitiinin annostelu vähensi merkittävästi oksaalihapon eritystä sekä PDB-elatusaineessa että infektoituneissa lehdissä. Yhteenvetona voidaan todeta, että L-ornitiinilla on keskeinen rooli redox-tilan ylläpitämisessä sekä infektoituneiden kasvien puolustusvasteen tehostamisessa. Tämän tutkimuksen tulokset voivat auttaa kehittämään innovatiivisia ja ympäristöystävällisiä menetelmiä valkohomeen torjumiseksi ja sen vaikutusten lieventämiseksi papujen tuotantoon ja muihin viljelykasveihin.
Valkohome, jonka aiheuttaa nekrotrofinen sieni Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, on tuhoisa, satoa vähentävä tauti, joka on vakava uhka pavun (Phaseolus vulgaris L.) maailmanlaajuiselle tuotannolle (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum on yksi vaikeimmin torjuttavista maaperässä leviävistä sienikasvitauditauteja. Sillä on laaja isäntäkirjo, yli 600 kasvilajia, ja se pystyy nopeasti hajottamaan isäntäkudoksia epäspesifisellä tavalla (Liang ja Rollins, 2018). Epäsuotuisissa olosuhteissa se käy läpi kriittisen vaiheen elinkaaressaan, jolloin se pysyy pitkiä aikoja lepotilassa mustina, kovina, siemenmäisinä rakenteina, joita kutsutaan sklerotioiksi maaperässä, tai valkoisina, pörröisinä kasvaimina tartunnan saaneiden kasvien rihmastossa tai varren ytimessä (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum kykenee muodostamaan sklerotioita, joiden ansiosta se voi selviytyä tartunnan saaneilla pelloilla pitkiä aikoja ja säilyä taudin aikana (Schwartz et al., 2005). Sklerotiat ovat ravinteikkaita, voivat säilyä maaperässä pitkiä aikoja ja toimia ensisijaisena inokulumina seuraaville infektioille (Schwartz et al., 2005). Suotuisissa olosuhteissa sklerotiat itävät ja tuottavat ilmassa leviäviä itiöitä, jotka voivat tartuttaa kaikki kasvin maanpäälliset osat, mukaan lukien, mutta ei rajoittuen, kukat, varret tai palot (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum käyttää moniportaista strategiaa isäntäkasviensa tartuttamiseen. Strategiaan kuuluu sarja koordinoituja tapahtumia sklerotioiden itämisestä oireiden kehittymiseen. Aluksi S. sclerotiorum tuottaa suspendoitunutta itiötä (ns. askosporia) sienen kaltaisista rakenteista, joita kutsutaan apoteesioiksi. Nämä itiöt leviävät ilmaan ja kehittyvät liikkumattomiksi sklerotioiksi tartunnan saaneiden kasvijätteiden pinnalle (Bolton et al., 2006). Sieni erittää sitten oksaalihappoa, virulenssitekijää, joka säätelee kasvisoluseinän pH-arvoa, edistää entsymaattista hajoamista ja kudosinvaasiota (Hegedus ja Rimmer, 2005) sekä tukahduttaa isäntäkasvin oksidatiivisen purkauksen. Tämä happamoitumisprosessi heikentää kasvisoluseinää, mikä tarjoaa suotuisan ympäristön sienisoluseinää hajottavien entsyymien (CWDE) normaalille ja tehokkaalle toiminnalle, jolloin patogeeni voi voittaa fyysisen esteen ja tunkeutua isäntäkudoksiin (Marciano et al., 1983). Tunkeuduttuaan S. sclerotiorum erittää useita CWDE-entsyymejä, kuten polygalakturonaasia ja sellulaasia, jotka helpottavat sen leviämistä infektoituneisiin kudoksiin ja aiheuttavat kudosnekroosia. Leesioiden ja sienirihmastojen eteneminen johtaa valkohomeelle tyypillisiin oireisiin (Hegedus ja Rimmer, 2005). Samaan aikaan isäntäkasvit tunnistavat patogeeneihin liittyviä molekyylimalleja (PAMP) kuviontunnistusreseptorien (PRR) kautta, mikä laukaisee sarjan signalointitapahtumia, jotka lopulta aktivoivat puolustusvasteita.
Vuosikymmenten taudintorjuntatoimista huolimatta pavuilla, kuten muissakin kaupallisissa viljelykasveissa, on edelleen pulaa riittävästä resistentistä sukusoluista patogeenin resistenssin, selviytymisen ja sopeutumiskyvyn vuoksi. Taudin hallinta on siksi erittäin haastavaa ja vaatii integroitua, monitahoista strategiaa, joka sisältää yhdistelmän viljelykäytäntöjä, biologista torjuntaa ja kemiallisia sienitautien torjunta-aineita (O'Sullivan et al., 2021). Valkohomen kemiallinen torjunta on tehokkainta, koska oikein ja oikeaan aikaan käytetyt sienitautien torjunta-aineet voivat tehokkaasti hillitä taudin leviämistä, vähentää infektion vakavuutta ja minimoida satohäviöitä. Sienitautien torjunta-aineiden liikakäyttö ja liiallinen niihin riippuvuus voivat kuitenkin johtaa resistenttien S. sclerotiorum -kantojen syntymiseen ja vaikuttaa negatiivisesti muihin kuin kohde-eliöihin, maaperän terveyteen ja veden laatuun (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Siksi ympäristöystävällisten vaihtoehtojen löytämisestä on tullut ensisijainen prioriteetti.
Polyamiinit (PA:t), kuten putreskiini, spermidiini, spermiini ja kadaveriini, voivat toimia lupaavina vaihtoehtoina maaperässä eläviä kasvipatogeenejä vastaan, mikä vähentää kokonaan tai osittain vaarallisten kemiallisten sienitautien torjunta-aineiden käyttöä (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Korkeammissa kasveissa PA:t osallistuvat moniin fysiologisiin prosesseihin, mukaan lukien, mutta ei rajoittuen, solujen jakautuminen, erilaistuminen ja vaste abioottisiin ja bioottisiin stressitekijöihin (Killiny ja Nehela, 2020). Ne voivat toimia antioksidantteina, auttaa sieppaamaan reaktiivisia happilajeja (ROS), ylläpitää redox-homeostaasia (Nehela ja Killiny, 2023), indusoida puolustukseen liittyviä geenejä (Romero et al., 2018), säädellä erilaisia ​​aineenvaihduntareittejä (Nehela ja Killiny, 2023), moduloida endogeenisiä kasvihormoneja (Nehela ja Killiny, 2019), muodostaa systeemistä hankittua resistenssiä (SAR) ja säädellä kasvin ja taudinaiheuttajien välisiä vuorovaikutuksia (Nehela ja Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). On syytä huomata, että PA:iden erityiset mekanismit ja roolit kasvinpuolustuksessa vaihtelevat kasvilajin, taudinaiheuttajien ja ympäristöolosuhteiden mukaan. Kasveissa runsain PA on biosyntetisoitu välttämättömästä polyamiinista L-ornitiinista (Killiny ja Nehela, 2020).
L-ornitiinilla on useita rooleja kasvien kasvussa ja kehityksessä. Esimerkiksi aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että riisissä (Oryza sativa) ornitiini voi liittyä typen kierrätykseen (Liu et al., 2018), riisin satoon, laatuun ja aromiin (Lu et al., 2020) sekä vesistressiin (Yang et al., 2000). Lisäksi L-ornitiinin ulkoinen käyttö paransi merkittävästi kuivuudensietokykyä sokerijuurikkaalla (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) ja lievitti suolastressiä sipulilla (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu ja Çavuşoǧlu, 2021) ja cashewpähkinöillä (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). L-ornitiinin mahdollinen rooli abioottisen stressin puolustuksessa voi johtua sen osallistumisesta proliinin kertymiseen käsitellyissä kasveissa. Esimerkiksi proliinin aineenvaihduntaan liittyvien geenien, kuten ornitiini-delta-aminotransferaasin (delta-OAT) ja proliinidehydrogenaasin (ProDH1 ja ProDH2) geenien, on aiemmin raportoitu osallistuvan Nicotiana benthamianan ja Arabidopsis thalianan puolustautumiseen muita kuin isäntäkasveja, Pseudomonas syringae -kantoja, vastaan ​​(Senthil-Kumar ja Mysore, 2012). Toisaalta sieniperäinen ornitiinidekarboksylaasi (ODC) on välttämätön patogeenien kasvulle (Singh et al., 2020). Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici -sienen ODC:n kohdentaminen isännän indusoimalla geenien hiljentämisellä (HIGS) paransi merkittävästi tomaattikasvien vastustuskykyä Fusarium-lakastumista vastaan ​​(Singh et al., 2020). Eksogeenisen ornitiinin mahdollista roolia bioottisia stressitekijöitä, kuten kasvipatogeenejä, vastaan ​​ei kuitenkaan ole tutkittu hyvin. Vielä tärkeämpää on, että ornitiinin vaikutukset taudinkestävyyteen ja niihin liittyvät biokemialliset ja fysiologiset ilmiöt ovat edelleen suurelta osin tutkimattomia.
Palkokasvien S. sclerotiorum -infektion monimutkaisuuden ymmärtäminen on tärkeää tehokkaiden torjuntastrategioiden kehittämiseksi. Tässä tutkimuksessa pyrimme tunnistamaan diamiini L-ornitiinin mahdollisen roolin keskeisenä tekijänä palkokasvien puolustusmekanismien ja vastustuskyvyn tehostamisessa Sclerotinia sclerotiorum -infektiota vastaan. Oletamme, että tartunnan saaneiden kasvien puolustusvasteiden tehostamisen lisäksi L-ornitiinilla on myös keskeinen rooli hapetus-pelkistystilan ylläpitämisessä. Ehdotamme, että L-ornitiinin mahdolliset vaikutukset liittyvät entsymaattisten ja ei-entsymaattisten antioksidanttipuolustusmekanismien säätelyyn sekä sienitautien/virulenssitekijöiden ja niihin liittyvien proteiinien häiriintymiseen. Tämä L-ornitiinin kaksoistoiminnallisuus tekee siitä lupaavan ehdokkaan kestävälle strategialle valkohomeen vaikutusten lieventämiseksi ja tavallisten palkokasvien vastustuskyvyn parantamiseksi tätä voimakasta sienitauteja vastaan. Tämän tutkimuksen tulokset voivat auttaa kehittämään innovatiivisia ja ympäristöystävällisiä menetelmiä valkohomeen torjumiseksi ja sen vaikutusten lieventämiseksi palkokasvien tuotantoon.
Tässä tutkimuksessa käytettiin kokeellisena materiaalina herkkää kaupallista papulajiketta, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3). Terveet siemenet saatiin ystävällisesti Egyptin peltokasvien tutkimuslaitoksen (FCRI) palkokasvien tutkimusosastolta maatalouden tutkimuskeskuksessa (ARC). Viisi siementä kylvettiin muovisiin ruukkuihin (sisähalkaisija 35 cm, syvyys 50 cm), jotka oli täytetty S. sclerotiorum -tartunnalla infektoidulla mullalla kasvihuoneolosuhteissa (25 ± 2 °C, suhteellinen kosteus 75 ± 1 %, 8 h valoa / 16 h pimeää). 7–10 päivää kylvön jälkeen (DPS) taimia harvennettiin siten, että jokaiseen ruukkuun jäi vain kaksi tasaisesti kasvavaa tainta ja kolme täysin kehittynyttä lehteä. Kaikkia ruukkukasveja kasteltiin kahden viikon välein ja lannoitettiin kuukausittain kyseisen lajikkeen suositellulla annostuksella.
500 mg/l L-ornitiinidiamiinin (tunnetaan myös nimellä (+)-(S)-2,5-diaminopentaanihappo; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Saksa) pitoisuuden valmistamiseksi 50 mg liuotettiin ensin 100 ml:aan steriiliä tislattua vettä. Sitten kantaliuos laimennettiin ja käytettiin seuraavissa kokeissa. Lyhyesti sanottuna kuusi L-ornitiinipitoisuuksien sarjaa (12,5, 25, 50, 75, 100 ja 125 mg/l) testattiin in vitro. Lisäksi steriiliä tislattua vettä käytettiin negatiivisena kontrollina (Mock) ja kaupallista sienitautien torjunta-ainetta "Rizolex-T" 50 % kostutettavaa jauhetta (toklofossimetyyli 20 % + tiraami 30 %; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbian kuvernoraatti, Egypti). Kaupallista sienitautien torjunta-ainetta ”Rizolex-T” testattiin in vitro viidellä pitoisuudella (2, 4, 6, 8 ja 10 mg/l).
Tavallisten papujen varsista ja palkoista otetut näytteet, joissa oli tyypillisiä valkohomeen oireita (tartuntaprosentti: 10–30 %), kerättiin kaupallisilta tiloilta. Vaikka suurin osa tartunnan saaneista kasvimateriaaleista tunnistettiin lajin/lajikkeen mukaan (altis kaupallinen lajike Giza 3), muut, erityisesti paikallisilta markkinoilta saadut, olivat tuntemattomia lajeja. Kerätyt tartunnan saaneet materiaalit desinfioitiin ensin pinnallisesti 0,5 % natriumhypokloriittiliuoksella 3 minuutin ajan, sitten ne huuhdeltiin useita kertoja steriilillä tislatulla vedellä ja kuivattiin steriilillä suodatinpaperilla ylimääräisen veden poistamiseksi. Tartunnan saaneet elimet leikattiin sitten pieniksi paloiksi keskikudoksesta (terveen ja tartunnan saaneen kudoksen välistä), viljeltiin perunadekstroosiagarilla (PDA) ja inkuboitiin 25 ± 2 °C:ssa 12 tunnin valo- ja 12 tunnin pimeäsyklissä 5 päivän ajan sklerotioiden muodostumisen stimuloimiseksi. Rihmastokärkimenetelmää käytettiin myös sieni-isolaattien puhdistamiseen sekaviljelmistä tai saastuneista viljelmistä. Puhdistettu sieni-isolaatti tunnistettiin ensin sen viljelymorfologisten ominaisuuksien perusteella ja sitten vahvistettiin, että se oli S. sclerotiorum mikroskooppisten ominaisuuksien perusteella. Lopuksi kaikkien puhdistettujen isolaattien patogeenisuus testattiin alttiilla Giza 3 -papulajikkeella Kochin postulaattien täyttämiseksi.
Lisäksi invasiivisin S. sclerotiorum -isolaatti (isolaatti nro 3) varmistettiin edelleen sisäisen transkription välikappaleen (ITS) sekvensoinnin avulla, kuten White et al., 1990 ja Baturo-Ciesniewska et al., 2017 ovat kuvanneet. Lyhyesti sanottuna isolaatteja viljeltiin perunadekstroosiliemessä (PDB) ja inkuboitiin 25 ± 2 °C:ssa 5–7 päivää. Sienirihmasto kerättiin sitten, suodatettiin sideharsokankaan läpi, pestiin kahdesti steriilillä vedellä ja kuivattiin steriilillä suodatinpaperilla. Genominen DNA eristettiin käyttämällä Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit -pakkausta (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). ITS-rDNA-alue monistettiin sitten käyttämällä spesifistä alukeparia ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; odotettu koko: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Puhdistetut PCR-tuotteet lähetettiin sekvensointiin (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). ITS-rDNA-sekvenssit sekvensoitiin kaksisuuntaisesti käyttäen Sanger-sekvensointimenetelmää. Koottuja kyselysekvenssejä verrattiin sitten GenBankin ja National Center for Biotechnology Informationin (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) uusimpiin tietoihin käyttämällä BLASTn-ohjelmistoa. Kyselysekvenssiä verrattiin 20 muuhun S. sclerotiorum -kantaan/isolaattiin, jotka oli haettu NCBI GenBankin uusimmista tiedoista (lisätaulukko S1) käyttämällä ClustalW-ohjelmistoa Molecular Evolutionary Genetics Analysis Packagessa (MEGA-11; versio 11) (Kumar et al., 2024). Evoluutioanalyysi suoritettiin käyttämällä suurimman uskottavuuden menetelmää ja yleistä aikapalautuvaa nukleotidisubstituutiomallia (Nei ja Kumar, 2000). Kuvassa on puu, jolla on korkein log-likelihood-arvo. Heuristisen haun alkuperäinen puu valitaan valitsemalla puu, jolla on korkeampi log-likelihood-arvo naapuriliitospuun (NJ) (Kumar et al., 2024) ja maksimiparsimoniapuun (MP) välillä. NJ-puu konstruoitiin käyttämällä pareittaista etäisyysmatriisia, joka laskettiin käyttämällä yleistä aikapalautuvaa mallia (Nei ja Kumar, 2000).
L-ornitiinin ja bakterisidin ”Rizolex-T” antibakteerinen aktiivisuus määritettiin in vitro agardiffuusiomenetelmällä. Menetelmä: Ota sopiva määrä L-ornitiinin kantaliuosta (500 mg/l) ja sekoita se huolellisesti 10 ml:aan PDA-ravinneliuosta liuosten valmistamiseksi, joiden lopulliset pitoisuudet ovat vastaavasti 12,5, 25, 50, 75, 100 ja 125 mg/l. Kontrollina käytettiin viittä pitoisuutta sienitautien torjunta-ainetta ”Rizolex-T” (2, 4, 6, 8 ja 10 mg/l) ja steriiliä tislattua vettä. Kun kasvatusalusta oli jähmettynyt, petrimaljan keskelle siirrettiin juuri valmistettu, halkaisijaltaan 4 mm:n kokoinen Sclerotinia sclerotiorum -sienirihmasto ja viljeltiin 25 ± 2 °C:ssa, kunnes rihmasto peitti koko kontrollimaljan, minkä jälkeen sienen kasvu rekisteröitiin. Laske S. sclerotiorumin säteittäisen kasvun prosentuaalinen esto yhtälöllä 1:
Koe toistettiin kahdesti käyttäen kuutta biologista toistoa kutakin kontrolli-/koeryhmää kohden ja viittä ruukkua (kaksi kasvia ruukkua kohden) kutakin biologista toistoa kohden. Jokainen biologinen toisto analysoitiin kahdesti (kaksi teknistä toistoa) kokeellisten tulosten tarkkuuden, luotettavuuden ja toistettavuuden varmistamiseksi. Lisäksi probit-regressioanalyysia käytettiin puolimaksimaalisen estävän pitoisuuden (IC50) ja IC99:n laskemiseen (Prentice, 1976).
L-ornitiinin potentiaalin arvioimiseksi kasvihuoneolosuhteissa suoritettiin kaksi peräkkäistä ruukkukoetta. Lyhyesti sanottuna ruukut täytettiin steriloidulla savi-hiekka-maaperällä (3:1) ja inokuloitiin tuoreella S. sclerotiorum -viljelmällä. Ensin viljeltiin invasiivisinta S. sclerotiorum -isolaattia (isolaatti nro 3) leikkaamalla yksi sklerotium puoliksi, asettamalla se kuvapuoli alaspäin PDA:lle ja inkuboimalla 25 °C:ssa jatkuvassa pimeydessä (24 h) 4 päivän ajan rihmaston kasvun stimuloimiseksi. Sitten otettiin neljä 5 mm:n halkaisijaltaan olevaa agar-agartulppaa etureunasta ja inokuloitiin 100 g:lla steriiliä vehnä- ja riisileseiden seosta (1:1, v/v). Kaikkia pulloja inkuboitiin 25 ± 2 °C:ssa 12 tunnin valo- ja 12 tunnin pimeäsyklissä 5 päivän ajan sklerotioiden muodostumisen stimuloimiseksi. Kaikkien pullojen sisältö sekoitettiin huolellisesti homogeenisuuden varmistamiseksi ennen mullan lisäämistä. Sitten jokaiseen ruukkuun lisättiin 100 g kolonisoivaa leseseosta taudinaiheuttajien tasaisen pitoisuuden varmistamiseksi. Inokuloituja ruukkuja kasteltiin sienikasvun aktivoimiseksi ja ne asetettiin kasvihuoneolosuhteisiin seitsemäksi päiväksi.
Jokaiseen ruukkuun kylvettiin viisi Giza 3 -lajikkeen siementä. L-ornitiinilla ja Rizolex-T-sienitautien torjunta-aineella käsitellyissä ruukuissa steriloidut siemenet liotettiin ensin kaksi tuntia näiden kahden yhdisteen vesiliuoksessa, jonka lopullinen IC99-pitoisuus oli noin 250 mg/l ja 50 mg/l, ja sitten ilmakuivattiin tunnin ajan ennen kylvöä. Toisaalta siemenet liotettiin steriilissä tislatussa vedessä negatiivisena kontrollina. Kymmenen päivän kuluttua, ennen ensimmäistä kastelua, taimet harvennettiin, jolloin jokaiseen ruukkuun jäi vain kaksi siistiä tainta. Lisäksi S. sclerotiorum -infektion varmistamiseksi samassa kehitysvaiheessa (10 päivää) olevia papukasvien varsia leikattiin kahdesta eri kohdasta steriloidulla skalpellilla ja noin 0,5 g kolonisoivaa leseseosta laitettiin jokaiseen haavaan, minkä jälkeen kosteutta lisättiin korkealla infektion ja taudin kehittymisen stimuloimiseksi kaikissa inokuloiduissa kasveissa. Kontrollikasveja haavoitettiin samalla tavalla ja haavaan laitettiin yhtä suuri määrä (0,5 g) steriiliä, kolonisoimatonta leseseosta ja pidettiin korkeassa kosteudessa taudinkehitysympäristön simuloimiseksi ja hoitoryhmien välisen yhdenmukaisuuden varmistamiseksi.
Käsittelymenetelmä: Paputaimet kasteltiin 500 ml:lla L-ornitiinin vesiliuosta (250 mg/l) tai Rizolex-T-sienitautien torjunta-ainetta (50 mg/l) kastelemalla maaperää, minkä jälkeen käsittely toistettiin kolme kertaa 10 päivän välein. Lumelääkkeellä käsitellyt kontrolliryhmät kasteltiin 500 ml:lla steriiliä tislattua vettä. Kaikki käsittelyt tehtiin kasvihuoneolosuhteissa (25 ± 2 °C, 75 ± 1 % suhteellinen kosteus ja 8 h valoa / 16 h pimeää). Kaikki ruukut kasteltiin kahden viikon välein ja käsiteltiin kuukausittain tasapainotetulla NPK-lannoitteella (20-20-20, 3,6 % rikkiä ja TE-hivenaineita; Zain Seeds, Egypti) 3–4 g/l pitoisuudella lehtisumutuksella lajikkeen suositusten ja valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ellei toisin mainita, täysin laajentuneet kypsät lehdet (toinen ja kolmas lehti ylhäältä) kerättiin kustakin biologisesta toistosta 72 tuntia käsittelyn jälkeen (hpt), homogenisoitiin, yhdistettiin ja säilytettiin -80 °C:ssa jatkoanalyysejä varten, mukaan lukien, mutta ei rajoittuen, oksidatiivisen stressin indikaattoreiden in situ histokemiallinen lokalisaatio, lipidiperoksidaatio, entsymaattiset ja ei-entsymaattiset antioksidantit sekä geenien ilmentyminen.
Valkohomeinfektion intensiteettiä arvioitiin viikoittain 21 päivää rokotuksen jälkeen (dpi) asteikolla 1–9 (lisätaulukko S2), joka perustui Petzoldtin ja Dicksonin asteikkoon (1996), jota Teran et al. (2006) ovat muokanneet. Lyhyesti sanottuna papukasvien varsia ja oksia tutkittiin rokotuskohdasta alkaen, jotta voitiin seurata leesioiden etenemistä nivelvälien ja nivelvälien varrella. Leesion etäisyys rokotuskohdasta varren tai oksan kaukaisimpaan pisteeseen mitattiin, ja leesion sijainti perustui pisteytykseen 1–9, jossa (1) osoitti, ettei rokotuskohdan lähellä ollut näkyvää infektiota, ja (2–9) osoitti leesion koon asteittaista kasvua ja etenemistä nivelvälien varrella (lisätaulukko S2). Valkohomeinfektion intensiteetti muunnettiin sitten prosentteina kaavalla 2:
Lisäksi taudin etenemiskäyrän alle jäävä pinta-ala (AUDPC) laskettiin kaavalla (Shaner ja Finney, 1977), jota on äskettäin sovellettu tavallisen pavun valkomädän (Chauhan et al., 2020) yhtälöllä 3:
Jossa Yi = taudin vakavuus ajanhetkellä ti, Yi+1 = taudin vakavuus seuraavalla ajanhetkellä ti+1, ti = ensimmäisen mittauksen aika (päivinä), ti+1 = seuraavan mittauksen aika (päivinä), n = aikapisteiden tai havaintopisteiden kokonaismäärä. Pavun kasvuparametrit, mukaan lukien kasvin korkeus (cm), oksien lukumäärä kasvia kohden ja lehtien lukumäärä kasvia kohden, tallennettiin viikoittain 21 päivän ajan kaikissa biologisissa toistoissa.
Jokaisessa biologisessa toistokokeessa lehtinäytteet (toinen ja kolmas täysin kehittynyt lehti latvasta) kerättiin 45. päivänä käsittelyn jälkeen (15 päivää viimeisen käsittelyn jälkeen). Jokainen biologinen toistokoe koostui viidestä ruukusta (kaksi kasvia ruukkua kohden). Noin 500 mg murskattua kudosta käytettiin fotosynteettisten pigmenttien (klorofylli a, klorofylli b ja karotenoidit) uuttamiseen 80-prosenttisella asetonilla 4 °C:ssa pimeässä. 24 tunnin kuluttua näytteet sentrifugoitiin ja supernatantti kerättiin klorofylli a:n, klorofylli b:n ja karotenoidien pitoisuuksien määrittämiseksi kolorimetrisesti UV-160A-spektrofotometrillä (Shimadzu Corporation, Japani) Lichtenthalerin menetelmän mukaisesti (1987) mittaamalla absorbanssi kolmella eri aallonpituudella (A470, A646 ja A663 nm). Lopuksi fotosynteettisten pigmenttien pitoisuus laskettiin käyttämällä Lichtenthalerin (1987) kuvaamia kaavoja 4–6.
72 tuntia käsittelyn jälkeen (hpt) kerättiin lehdet (toinen ja kolmas täysin kehittynyt lehti latvasta) kustakin biologisesta toistosta vetyperoksidin (H2O2) ja superoksidianionin (O2•−) histokemiallista lokalisointia varten in situ. Jokainen biologinen toisto koostui viidestä ruukusta (kaksi kasvia ruukkua kohden). Jokainen biologinen toisto analysoitiin kahtena kaksoisnäytettä (kaksi teknistä toistoa) menetelmän tarkkuuden, luotettavuuden ja toistettavuuden varmistamiseksi. H2O2 ja O2•− määritettiin käyttämällä 0,1 % 3,3′-diaminobentsidiiniä (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Saksa) tai nitrosinitetratsoliumia (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Saksa) Romero-Puertas et al. (2004) ja Adam et al. (1989) kuvaamia menetelmiä pienin muutoksin. H2O2:n histokemiallista lokalisointia in situ varten lehtiset tyhjiöfiltroitiin 0,1 % DAB:lla 10 mM Tris-puskurissa (pH 7,8) ja inkuboitiin sitten huoneenlämmössä valossa 60 minuuttia. Lehdykät valkaistiin 0,15 % (v/v) TCA:lla 4:1 (v/v) etanoli:kloroformissa (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Egypti) ja sitten altistettiin valolle, kunnes ne tummuivat. Samoin läpät tyhjiöfiltroitiin 10 mM kaliumfosfaattipuskurilla (pH 7,8), joka sisälsi 0,1 w/v % HBT:tä, O2•−:n histokemiallista lokalisointia in situ varten. Lehdykät inkuboitiin valossa huoneenlämmössä 20 minuuttia, sitten ne valkaistiin kuten edellä ja lopuksi valaistiin, kunnes tummansinisiä/violetteja täpliä ilmestyi. Tuloksena olevan ruskean (H2O2-indikaattorina) tai sinivioletin (O2•−-indikaattorina) värin intensiteetti arvioitiin käyttämällä ImageJ-kuvankäsittelypaketin Fijin versiota (http://fiji.sc; käytetty 7. maaliskuuta 2024).
Malondialdehydi (MDA; lipidiperoksidaation markkerina) määritettiin Dun ja Bramlagen (1992) menetelmän mukaisesti pienin muutoksin. Jokaisesta biologisesta toistosta (toinen ja kolmas täysin kehittynyt lehti latvasta) kerättiin lehdet 72 tuntia käsittelyn jälkeen (hpt). Jokainen biologinen toisto sisälsi viisi ruukkua (kaksi kasvia ruukkua kohden). Jokainen biologinen toisto analysoitiin kahtena kaksoisnäytteenä (kaksi teknistä toistoa) menetelmän tarkkuuden, luotettavuuden ja toistettavuuden varmistamiseksi. Lyhyesti sanottuna 0,5 g jauhettua lehtikudosta käytettiin MDA:n uuttoon 20-prosenttisella trikloorietikkahapolla (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA), joka sisälsi 0,01 % butyloitua hydroksitolueenia (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Supernatantin MDA-pitoisuus määritettiin sitten kolorimetrisesti mittaamalla absorbanssi 532 ja 600 nm:ssä käyttämällä UV-160A-spektrofotometriä (Shimadzu Corporation, Japani) ja ilmaistiin sitten nmol g−1 FW:nä.
Ei-entsymaattisten ja entsymaattisten antioksidanttien arviointia varten kerättiin lehdet (toinen ja kolmas täysin kehittynyt lehti latvasta) kustakin biologisesta toistosta 72 tuntia käsittelyn jälkeen (hpt). Jokainen biologinen toisto koostui viidestä ruukusta (kaksi kasvia ruukkua kohden). Jokainen biologinen näyte analysoitiin kahtena rinnakkaisnäytteenä (kaksi teknistä näytettä). Kaksi lehteä jauhettiin nestemäisellä typellä ja käytettiin suoraan entsymaattisten ja ei-entsymaattisten antioksidanttien, kokonaisaminohappojen, proliinipitoisuuden, geenien ilmentymisen ja oksalaatin kvantifioinnin määrittämiseen.
Liukoisten fenolien kokonaismäärä määritettiin Folin-Ciocalteu-reagenssilla (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) Kahkosen ym. (1999) kuvaamaa menetelmää hieman muunneltu. Lyhyesti sanottuna noin 0,1 g homogenisoitua lehtikudosta uutettiin 20 ml:lla 80-prosenttista metanolia pimeässä 24 tunnin ajan ja supernatantti kerättiin sentrifugoinnin jälkeen. 0,1 ml näyteuutetta sekoitettiin 0,5 ml:aan Folin-Ciocalteu-reagenssia (10 %), ravisteltiin 30 sekuntia ja jätettiin pimeään 5 minuutiksi. Sitten jokaiseen putkeen lisättiin 0,5 ml 20-prosenttista natriumkarbonaattiliuosta (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Kairo, Egypti), sekoitettiin huolellisesti ja inkuboitiin huoneenlämmössä pimeässä 1 tunnin ajan. Inkuboinnin jälkeen reaktioseoksen absorbanssi mitattiin 765 nm:ssä UV-160A-spektrofotometrillä (Shimadzu Corporation, Japani). Näyteuutteiden liukoisten kokonaisfenolien pitoisuus määritettiin gallihappokalibrointikäyrän (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) avulla ja ilmaistiin gallihappoekvivalenttimilligrammoina tuorepainogrammaa kohden (mg GAE g-1 tuorepaino).
Liukoisten flavonoidien kokonaispitoisuus määritettiin Djeridanen ym. (2006) menetelmän mukaisesti pienin muutoksin. Lyhyesti sanottuna 0,3 ml edellä mainittua metanoliuutetta sekoitettiin 0,3 ml:aan 5-prosenttista alumiinikloridiliuosta (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA), sekoitettiin voimakkaasti ja inkuboitiin sitten huoneenlämmössä 5 minuuttia, minkä jälkeen lisättiin 0,3 ml 10-prosenttista kaliumasetaattiliuosta (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Egypti), sekoitettiin huolellisesti ja inkuboitiin huoneenlämmössä 30 minuuttia pimeässä. Inkuboinnin jälkeen reaktioseoksen absorbanssi mitattiin 430 nm:ssä käyttäen UV-160A-spektrofotometriä (Shimadzu Corporation, Japani). Liukoisten flavonoidien kokonaispitoisuus näyteuutteissa määritettiin käyttämällä rutiinin kalibrointikäyrää (TCI America, Portland, OR, USA) ja ilmaistiin sitten milligrammoina rutiiniekvivalenttia tuorepainogrammaa kohden (mg RE g-1 tuorepaino).
Pavunlehtien vapaiden aminohappojen kokonaispitoisuus määritettiin käyttämällä modifioitua ninhydriinireagenssia (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) Yokoyaman ja Hiramatsun (2003) ehdottaman ja Sunin ym. (2006) modifioiman menetelmän mukaisesti. Lyhyesti sanottuna 0,1 g jauhettua kudosta uutettiin pH 5,4 -puskurilla, ja 200 μl supernatanttia saatettiin reagoimaan 200 μl:n ninhydriinin (2 %) ja 200 μl:n pyridiinin (10 %; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA) kanssa, inkuboitiin kiehuvassa vesihauteessa 30 minuuttia, sitten jäähdytettiin ja mitattiin 580 nm:ssä UV-160A-spektrofotometrillä (Shimadzu Corporation, Japani). Toisaalta proliini määritettiin Batesin menetelmällä (Bates et al., 1973). Proliini uutettiin 3 % sulfosalisyylihapolla (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) ja sentrifugoinnin jälkeen 0,5 ml supernatanttia sekoitettiin 1 ml:aan jääetikkaa (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) ja ninhydriinireagenssia, inkuboitiin 90 °C:ssa 45 minuuttia, jäähdytettiin ja mitattiin 520 nm:ssä käyttäen samaa spektrofotometriä kuin edellä. Lehtiuutteiden vapaiden aminohappojen ja proliinin kokonaismäärä määritettiin käyttämällä glysiinin ja proliinin kalibrointikäyriä (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ja ilmaistiin mg/g tuorepainoa.
Antioksidanttientsyymien entsymaattisen aktiivisuuden määrittämiseksi noin 500 mg homogenisoitua kudosta uutettiin 3 ml:lla 50 mM Tris-puskuria (pH 7,8), joka sisälsi 1 mM EDTA-Na2:ta (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ja 7,5 % polyvinyylipyrrolidonia (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), sentrifugoitiin 10 000 × g:ssä 20 minuuttia jääkaapissa (4 °C), ja supernatantti (raakaentsyymiuute) kerättiin (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Katalaasi (CAT) saatettiin sitten reagoimaan 2 ml:n 0,1 M natriumfosfaattipuskuria (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ja 100 μl:n 269 mM H2O2-liuosta kanssa sen entsymaattisen aktiivisuuden määrittämiseksi Aebin (1984) menetelmän mukaisesti pienin muutoksin (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Guajakolista riippuvan peroksidaasin (POX) entsymaattinen aktiivisuus määritettiin Harrachin et al. (2009) menetelmällä. (2008) pienin muutoksin (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) ja polyfenolioksidaasin (PPO) entsymaattinen aktiivisuus määritettiin reaktion jälkeen 2,2 ml:n 100 mM natriumfosfaattipuskuria (pH 6,0), 100 μl:n guajakolia (TCI Chemicals, Portland, OR, USA) ja 100 μl:n 12 mM H2O2:ta kanssa. Menetelmää muokattiin hieman menetelmästä (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Määritys suoritettiin reaktion jälkeen 3 ml:n kanssa tuoreeltaan 0,1 M fosfaattipuskuriin (pH 6,0) valmistettua katekoliliuosta (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0,01 M). CAT-aktiivisuutta mitattiin seuraamalla H2O2:n hajoamista 240 nm:ssä (A240), POX-aktiivisuutta mitattiin seuraamalla absorbanssin kasvua 436 nm:ssä (A436) ja PPO-aktiivisuutta mitattiin tallentamalla absorbanssin vaihtelut 495 nm:ssä (A495) 30 sekunnin välein 3 minuutin ajan käyttäen UV-160A-spektrofotometriä (Shimadzu, Japani).
Reaaliaikaista RT-PCR:ää käytettiin kolmen antioksidantteihin liittyvän geenin transkriptitasojen havaitsemiseen papujen lehdissä (toinen ja kolmas täysin kehittynyt lehti ylhäältä) 72 tuntia viimeisen käsittelyn jälkeen. Näitä geenejä olivat peroksisomaalinen katalaasi (PvCAT1; GenBank-tunnistenumero KF033307.1), superoksididismutaasi (PvSOD; GenBank-tunnistenumero XM_068639556.1) ja glutationireduktaasi (PvGR; GenBank-tunnistenumero KY195009.1). Lyhyesti sanottuna RNA eristettiin käyttämällä Simply P Total RNA Extraction Kit -pakkausta (tuotenro BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Kiina) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sitten cDNA syntetisoitiin käyttämällä TOP script™ cDNA Synthesis Kit -pakkausta valmistajan ohjeiden mukaisesti. Edellä mainittujen kolmen geenin alukesekvenssit on lueteltu lisätaulukossa S3. PvActin-3:a (GenBank-tunnistenumero: XM_068616709.1) käytettiin taloudenpitogeeninä ja suhteellinen geenien ilmentyminen laskettiin käyttämällä 2-ΔΔCT-menetelmää (Livak ja Schmittgen, 2001). Aktiinin stabiilius bioottisen stressin (yhteensopimaton vuorovaikutus tavallisten palkokasvien ja antraknoosisienen Colletotrichum lindemuthianum välillä) ja abioottisen stressin (kuivuus, suolapitoisuus, matala lämpötila) aikana osoitettiin (Borges et al., 2012).
Aluksi suoritimme koko genomin kattavan in silico -analyysin oksaloasetaattiasetyylihydrolaasi (OAH) -proteiineista S. sclerotiorumissa käyttämällä proteiini-proteiini BLAST-työkalua (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Lyhyesti sanottuna käytimme Aspergillus fijiensis CBS 313.89:n (AfOAH; taksidi: 1191702; GenBank-lisäysnumero XP_040799428.1; 342 aminohappoa) ja Penicillium lagenan (PlOAH; taksidi: 94218; GenBank-lisäysnumero XP_056833920.1; 316 aminohappoa) OAH:ta kyselysekvensseinä kartoittaaksemme homologisen proteiinin S. sclerotiorumissa (taksidi: 5180). BLASTp-testi tehtiin National Center for Biotechnology Informationin (NCBI) verkkosivuston GenBank-tietokannan uusimpia saatavilla olevia S. sclerotiorum -genomitietoja vasten osoitteessa http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Lisäksi S. sclerotiorum -bakteerin ennustettu OAH-geeni (SsOAH) sekä A. fijiensis CBS 313.89 -kannan AfOAH:n ja P. lagenan PlOAH:n evoluutioanalyysi ja fylogeneettinen puu pääteltiin käyttämällä MEGA11:n maksimitodennäköisyysmenetelmää (Tamura et al., 2021) ja JTT-matriisipohjaista mallia (Jones et al., 1992). Fylogeneettinen puu yhdistettiin kaikkien S. sclerotiorum -bakteerin ennustettujen OAH-geenien (SsOAH) proteiinisekvenssien moninkertaiseen rinnastusanalyysiin ja kyselysekvenssiin käyttämällä Constraint-Based Alignment Tool -työkalua (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos ja Agarwala, 2007). Lisäksi S. sclerotiorum -bakteerin SsOAH:n parhaiten vastaavat aminohapposekvenssit kohdistettiin kyselysekvenssien (AfOAH ja PlOAH) kanssa (Larkin et al., 2007) käyttäen ClustalW-ohjelmistoa (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), ja kohdistuksen konservoituneet alueet visualisoitiin ESPript-työkalulla (versio 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Lisäksi S. sclerotiorum SsOAH:n ennustetut toiminnalliset edustavat domeenit ja konservoituneet kohdat luokiteltiin interaktiivisesti eri heimoihin käyttämällä InterPro-työkalua (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Lopuksi ennustetun S. sclerotiorum SsOAH:n kolmiulotteinen (3D) rakennemallinnus suoritettiin käyttämällä Protein Homology/Analogy Recognition Engineä (Phyre2-palvelinversio 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) ja validoitiin käyttämällä SWISS-MODEL-palvelinta (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Ennustetut kolmiulotteiset rakenteet (PDB-muodossa) visualisoitiin interaktiivisesti käyttämällä UCSF-Chimera-pakettia (versio 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
Kvantitatiivista reaaliaikaista fluoresenssi-PCR:ää käytettiin oksaloasetaattiasetyylihydrolaasin (SsOAH; GenBank-tunnistenumero: XM_001590428.1) transkriptiotason määrittämiseen Sclerotinia sclerotiorum -sienen rihmastossa. Lyhyesti sanottuna S. sclerotiorum inokuloitiin PDB:tä sisältävään pulloon ja asetettiin ravistelevaan inkubaattoriin (malli: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) 25 ± 2 °C:ssa 24 tunniksi nopeudella 150 rpm ja jatkuvassa pimeydessä (24 h) rihmaston kasvun stimuloimiseksi. Sen jälkeen soluja käsiteltiin L-ornitiinilla ja sienitautien torjunta-aineella Rizolex-T lopullisilla IC50-pitoisuuksilla (noin 40 ja 3,2 mg/l) ja viljeltiin sitten vielä 24 tuntia samoissa olosuhteissa. Inkuboinnin jälkeen viljelmät sentrifugoitiin nopeudella 2500 rpm 5 minuutin ajan ja supernatantti (sienirihmasto) kerättiin geeniekspressioanalyysiä varten. Samoin sienirihmastoa kerättiin 0, 24, 48, 72, 96 ja 120 tuntia infektion jälkeen infektoituneista kasveista, jotka olivat muodostaneet valkohomea ja vanumäistä rihmastoa infektoituneiden kudosten pinnalle. Sienirihmastosta eristettiin RNA ja sitten syntetisoitiin cDNA edellä kuvatulla tavalla. SsOAH:n alukesekvenssit on lueteltu lisätaulukossa S3. SsActinia (GenBank-lisäysnumero: XM_001589919.1) käytettiin taloudenhoitogeeninä, ja suhteellinen geenien ilmentyminen laskettiin käyttämällä 2-ΔΔCT-menetelmää (Livak ja Schmittgen, 2001).
Oksaalihappo määritettiin perunadekstroosiliemestä (PDB) ja Sclerotinia sclerotiorum -sienitauteja sisältävistä kasvinäytteistä Xun ja Zhangin (2000) menetelmän mukaisesti pienin muutoksin. Lyhyesti sanottuna S. sclerotiorum -isolaatit inokuloitiin PDB:tä sisältäviin pulloihin ja viljeltiin sitten ravistelevassa inkubaattorissa (malli I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) nopeudella 150 rpm 25 ± 2 °C:ssa 3–5 päivän ajan jatkuvassa pimeydessä (24 h) rihmaston kasvun stimuloimiseksi. Inkuboinnin jälkeen sieniviljelmä suodatettiin ensin Whatman #1 -suodatinpaperin läpi ja sentrifugoitiin sitten nopeudella 2500 rpm 5 minuutin ajan jäännösrihmaston poistamiseksi. Supernatantti kerättiin ja säilytettiin 4 °C:ssa oksalaatin myöhempää kvantitatiivista määritystä varten. Kasvinäytteiden valmistamiseksi noin 0,1 g kasvikudospalasia uutettiin kolme kertaa tislatulla vedellä (2 ml kerrallaan). Näytteet sentrifugoitiin sitten nopeudella 2500 rpm 5 minuutin ajan, supernatantti suodatettiin kuivasuodattimella Whatman nro 1 -suodatinpaperin läpi ja kerättiin jatkoanalyysiä varten.
Oksaalihapon kvantitatiivista analyysiä varten reaktioseos valmistettiin lasitulpallisessa putkessa seuraavassa järjestyksessä: 0,2 ml näytettä (tai PDB-viljelysuodosta tai oksaalihappostandardiliuosta), 0,11 ml bromifenolisiniä (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), 0,198 ml 1 M rikkihappoa (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Egypti) ja 0,176 ml 100 mM kaliumdikromaattia (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA), ja sitten liuos laimennettiin 4,8 ml:aan tislatulla vedellä, sekoitettiin voimakkaasti ja laitettiin välittömästi 60 °C:een vesihauteeseen. 10 minuutin kuluttua reaktio pysäytettiin lisäämällä 0,5 ml natriumhydroksidiliuosta (NaOH; 0,75 M). Reaktioseoksen absorbanssi (A600) mitattiin 600 nm:ssä käyttäen UV-160-spektrofotometriä (Shimadzu Corporation, Japani). Viljelmäsuodosten ja kasvinäytteiden kvantifioinnin kontrollina käytettiin PDB:tä ja tislattua vettä. Viljelmäsuodosten oksaalihappopitoisuudet, ilmaistuna oksaalihappomikrogrammoina millilitraa kohden PDB-elatusainetta (μg.mL−1), ja lehtiuutteiden oksaalihappopitoisuudet, ilmaistuna oksaalihappomikrogrammoina tuorepainogrammaa kohden (μg.g−1 FW), määritettiin oksaalihapon kalibrointikäyrällä (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA).
Koko tutkimuksen ajan kaikki kokeet suunniteltiin täysin satunnaistetulla asetelmalla (CRD), jossa oli kuusi biologista toistoa käsittelyä kohden ja viisi ruukkua biologista toistoa kohden (kaksi kasvia ruukkua kohden), ellei toisin mainita. Biologiset toistot analysoitiin kahtena kaksoisnäytettä (kaksi teknistä toistoa). Teknisiä toistoja käytettiin saman kokeen toistettavuuden tarkistamiseen, mutta niitä ei käytetty tilastollisessa analyysissä virheellisten toistojen välttämiseksi. Tiedot analysoitiin tilastollisesti varianssianalyysillä (ANOVA) ja sen jälkeen Tukey-Kramerin rehellisesti merkitsevä ero (HSD) -testillä (p ≤ 0,05). In vitro -kokeissa IC50- ja IC99-arvot laskettiin probit-mallilla ja 95 %:n luottamusvälit laskettiin.
Egyptin El Ghabiyan kuvernoraatissa kerättiin yhteensä neljä isolaattia eri soijapapupelloilta. PDA-alustalla kaikki isolaatit tuottivat kermanvalkoista rihmastoa, joka muuttui nopeasti puuvillaisen valkoiseksi (kuva 1A) ja sitten beigeksi tai ruskeaksi sklerotiumvaiheessa. Sklerotiat ovat yleensä tiheitä, mustia, pallomaisia ​​tai epäsäännöllisiä, 5,2–7,7 mm pitkiä ja 3,4–5,3 mm halkaisijaltaan (kuva 1B). Vaikka neljä isolaatti kehitti marginaalisen sklerotioiden kuvion viljelyalustan reunalle 10–12 päivän inkuboinnin jälkeen 25 ± 2 °C:ssa (kuva 1A), sklerotioiden määrä levyä kohden vaihteli merkittävästi niiden välillä (P < 0,001), ja isolaatilla 3 oli eniten sklerotioita (32,33 ± 1,53 sklerotiota levyä kohden; kuva 1C). Vastaavasti isolaatti nro 3 tuotti enemmän oksaalihappoa PDB:ssä kuin muut isolaatit (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; kuva 1D). Isolaatilla nro 3 oli tyypillisiä fytopatogeenisen sienen Sclerotinia sclerotiorum morfologisia ja mikroskooppisia ominaisuuksia. Esimerkiksi PDA:ssa isolaatin nro 3 pesäkkeet kasvoivat nopeasti, olivat kermanvalkoisia (kuva 1A), käänteisen beigejä tai vaalean lohenkeltaisenruskeita, ja niiden peittäminen kokonaan 9 cm:n halkaisijaltaan olevan levyn pinnalla kesti 6–7 päivää 25 ± 2 °C:ssa. Edellä mainittujen morfologisten ja mikroskooppisten ominaisuuksien perusteella isolaatti nro 3 tunnistettiin Sclerotinia sclerotiorumiksi.
Kuva 1. Tavallisista palkokasveista peräisin olevien S. sclerotiorum -isolaattien ominaisuudet ja patogeenisuus. (A) Neljän S. sclerotiorum -isolaatin rihmastokasvu PDA-alustalla, (B) neljän S. sclerotiorum -isolaatin sklerotiot, (C) sklerotioiden lukumäärä (levyä kohden), (D) oksaalihapon eritys PDB-alustalla (μg.mL−1) ja (E) neljän S. sclerotiorum -isolaatin taudin vakavuus (%) herkällä kaupallisella palkokasvilajikkeella Giza 3 kasvihuoneolosuhteissa. Arvot edustavat viiden biologisen toiston keskiarvoa ± keskihajontaa (n = 5). Eri kirjaimet osoittavat tilastollisesti merkitseviä eroja käsittelyjen välillä (p < 0,05). (F–H) Tyypillisiä valkohomeoireita ilmestyi maanpäällisiin varsiin ja lituihin 10 päivää isolaatilla nro 3 tehdyn inokulaation jälkeen (dpi). (I) S. sclerotiorum -isolaatin #3 sisäisen transkriptoidun välialueen (ITS) evolutiivinen analyysi suoritettiin käyttämällä suurimman uskottavuuden menetelmää ja verrattiin 20 referenssiisolaattiin/kantaan, jotka saatiin National Center for Biotechnology Informationin (NCBI) tietokannasta (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Klusteriviivojen yläpuolella olevat numerot osoittavat alueen peiton (%) ja klusteriviivojen alapuolella olevat numerot osoittavat haaran pituuden.
Lisäksi patogeenisyyden varmistamiseksi neljää saatua S. sclerotiorum -isolaattia käytettiin herkän kaupallisen Giza 3 -papulajikkeen inokulointiin kasvihuoneolosuhteissa, mikä on yhdenmukaista Kochin postulaattien kanssa (kuva 1E). Vaikka kaikki saadut sieni-isolaatit olivat patogeenisiä ja saattoivat tartuttaa vihreän pavun (lajike Giza 3), aiheuttaen tyypillisiä valkohomeoireita kaikissa maanpäällisissä osissa (kuva 1F), erityisesti varsissa (kuva 1G) ja palkoissa (kuva 1H) 10 päivää inokulaation jälkeen (dpi), isolaatti 3 oli aggressiivisin isolaatti kahdessa riippumattomassa kokeessa. Isolaatilla 3 oli korkein taudin vakavuus (%) papukasveilla (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 ja 76,7 ± 3,1 päivää infektion jälkeen; kuva 1F).
Invasiivisimman S. sclerotiorum -isolaatin nro 3 tunnistus varmistettiin edelleen sisäisen transkription välikappaleen (ITS) sekvensoinnin avulla (kuva 1I). Isolaatin nro 3 ja 20 referenssiisolaatin/kannan välinen fylogeneettinen analyysi osoitti niiden välisen suuren samankaltaisuuden (>99 %). On syytä huomata, että S. sclerotiorum -isolaatilla nro 3 (533 bp) on suuri samankaltaisuus amerikkalaisen, kuivista herneen siemenistä eristetyn S. sclerotiorum -isolaatin LPM36 (GenBank-talletusnumero MK896659.1; 540 bp) ja kiinalaisen, orvokin (Matthiola incana) varsimädän aiheuttavan S. sclerotiorum -isolaatin YKY211 (GenBank-talletusnumero OR206374.1; 548 bp) kanssa, jotka kaikki on ryhmitelty erikseen dendrogrammin yläosaan (kuva 1I). Uusi sekvenssi on talletettu NCBI-tietokantaan ja sille on annettu nimi ”Sclerotinia sclerotiorum – isolaatti YN-25” (GenBank-lisäysnumero PV202792). Voidaan nähdä, että isolaatti 3 on invasiivisin isolaatti; siksi tämä isolaatti valittiin tutkittavaksi kaikissa seuraavissa kokeissa.
Diamiini-L-ornitiinin (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Saksa) antibakteerista aktiivisuutta S. sclerotiorum -isolaattia 3 vastaan ​​tutkittiin in vitro eri pitoisuuksina (12,5, 25, 50, 75, 100 ja 125 mg/l). On huomionarvoista, että L-ornitiinilla oli antibakteerinen vaikutus ja se esti vähitellen S. sclerotiorum -sienirihmastojen säteittäistä kasvua annoksesta riippuvalla tavalla (kuva 2A, B). Korkeimmalla testatulla pitoisuudella (125 mg/l) L-ornitiini osoitti korkeinta rihmaston kasvun estymisnopeutta (99,62 ± 0,27 %; kuva 2B), mikä vastasi kaupallisen sienitautien torjunta-aineen Rizolex-T (estymisnopeus 99,45 ± 0,39 %; kuva 2C) tehoa korkeimmalla testatulla pitoisuudella (10 mg/l), mikä osoittaa samanlaista tehoa.
Kuva 2. L-ornitiinin antibakteerinen aktiivisuus Sclerotinia sclerotiorum -sientä vastaan ​​in vitro. (A) Eri L-ornitiinipitoisuuksien antibakteerisen aktiivisuuden vertailu S. sclerotiorum -sientä vastaan ​​kaupalliseen Rizolex-T-sienitautien torjunta-aineeseen (10 mg/l). (B, C) S. sclerotiorum -sienirihmaston kasvun estoaste (%) käsittelyn jälkeen eri L-ornitiinipitoisuuksilla (12,5, 25, 50, 75, 100 ja 125 mg/l) tai Rizolex-T:llä (2, 4, 6, 8 ja 10 mg/l). Arvot edustavat viiden biologisen toiston keskiarvoa ± keskihajontaa (n = 5). Eri kirjaimet tarkoittavat käsittelyjen välisiä tilastollisia eroja (p < 0,05). (D, E) L-ornitiinin ja kaupallisen Rizolex-T-sienitautien torjunta-aineen probit-malliregressioanalyysi. Probit-mallin regressiosuora on esitetty yhtenäisenä sinisenä viivana ja luottamusväli (95 %) punaisena katkoviivana.
Lisäksi suoritettiin probit-regressioanalyysi ja vastaavat kuvaajat on esitetty taulukossa 1 ja kuvissa 2D, E. Lyhyesti sanottuna L-ornitiinin hyväksyttävä kulmakerroin (y = 2,92x − 4,67) ja siihen liittyvät merkitsevät tilastotiedot (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 ja p < 0,0001; kuva 2D) osoittivat tehostunutta sienilääkevaikutusta S. sclerotiorum -sientä vastaan ​​verrattuna kaupalliseen sienitautien torjunta-aineeseen Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 ja p < 0,0001) (taulukko 1).
Taulukko 1. L-ornitiinin ja kaupallisen sienitautien torjunta-aineen ”Rizolex-T” puolimaksimaalisen estävän pitoisuuden (IC50) ja IC99:n (mg/l) arvot S. sclerotiorum -sientä vastaan.
Kaiken kaikkiaan L-ornitiini (250 mg/l) vähensi merkittävästi valkohomeen kehittymistä ja vakavuutta käsitellyissä papukasveissa verrattuna käsittelemättömiin S. sclerotiorum -tartunnan saaneisiin kasveihin (kontrolli; kuva 3A). Lyhyesti sanottuna, vaikka käsittelemättömien tartunnan saaneiden kontrollikasvien taudin vakavuus lisääntyi vähitellen (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 ja 92,33 ± 3,06%), L-ornitiini vähensi merkittävästi taudin vakavuutta (%) koko kokeen ajan (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 ja 26,36 ± 3,07) 7, 14 ja 21 päivää käsittelyn jälkeen (kuva 3A). Vastaavasti, kun S. sclerotiorum -tartunnan saaneita papukasveja käsiteltiin 250 mg/l L-ornitiinilla, taudin etenemiskäyrän alle jäävä pinta-ala (AUDPC) pieneni käsittelemättömän kontrollin arvosta 1274,33 ± 33,13 arvoon 281,03 ± 7,95, mikä oli hieman pienempi kuin positiivisen kontrollin 50 mg/l Rizolex-T-sienitautien torjunta-aineen arvo (183,61 ± 7,71; kuva 3B). Sama suuntaus havaittiin toisessa kokeessa.
Kuva 3. L-ornitiinin ulkoisen käytön vaikutus Sclerotinia sclerotiorumin aiheuttaman valkomädän kehittymiseen tavallisessa pavussa kasvihuoneolosuhteissa. (A) Tavallisen pavun valkohomeen taudin etenemiskäyrä 250 mg/l L-ornitiinilla käsittelyn jälkeen. (B) Tavallisen pavun valkohomeen taudin etenemiskäyrän alle jäävä pinta-ala (AUDPC) L-ornitiinikäsittelyn jälkeen. Arvot edustavat viiden biologisen toiston keskiarvoa ± keskihajontaa (n = 5). Eri kirjaimet tarkoittavat tilastollisesti merkitseviä eroja käsittelyjen välillä (p < 0,05).
Eksogeeninen 250 mg/l L-ornitiinin annostelu lisäsi vähitellen kasvin korkeutta (kuva 4A), oksien lukumäärää kasvia kohden (kuva 4B) ja lehtien lukumäärää kasvia kohden (kuva 4C) 42 päivän kuluttua. Vaikka kaupallisella sienitautien torjunta-aineella Rizolex-T (50 mg/l) oli suurin vaikutus kaikkiin tutkittuihin ravitsemuksellisiin parametreihin, eksogeenisella 250 mg/l L-ornitiinin annostelulla oli toiseksi suurin vaikutus verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin (kuvat 4A–C). Toisaalta L-ornitiinikäsittelyllä ei ollut merkittävää vaikutusta fotosynteettisten pigmenttien klorofylli a:n (kuva 4D) ja klorofylli b:n (kuva 4E) pitoisuuksiin, mutta se lisäsi hieman karotenoidien kokonaispitoisuutta (0,56 ± 0,03 mg/g per paino) verrattuna negatiiviseen kontrolliin (0,44 ± 0,02 mg/g per paino) ja positiiviseen kontrolliin (0,46 ± 0,02 mg/g per paino; kuva 4F). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että L-ornitiini ei ole fytotoksinen käsitellyille palkokasveille ja voi jopa stimuloida niiden kasvua.
Kuva 4. Eksogeenisen L-ornitiinin vaikutus Sclerotinia sclerotiorum -tartunnan saaneiden papulehtien kasvuominaisuuksiin ja fotosynteettisiin pigmentteihin kasvihuoneolosuhteissa. (A) Kasvin korkeus (cm), (B) Oksien lukumäärä kasvia kohden, (C) Lehtien lukumäärä kasvia kohden, (D) Klorofylli a:n pitoisuus (mg g-1 fr wt), (E) Klorofylli b:n pitoisuus (mg g-1 fr wt), (F) Karotenoidien kokonaispitoisuus (mg g-1 fr wt). Arvot ovat viiden biologisen toiston keskiarvo ± keskihajonta (n = 5). Eri kirjaimet osoittavat tilastollisesti merkitseviä eroja käsittelyjen välillä (p < 0,05).
Reaktiivisten happilajien (ROS; ilmaistuna vetyperoksidina [H2O2]) ja vapaiden radikaalien (ilmaistuna superoksidianioneina [O2•−]) in situ histokemiallinen lokalisaatio paljasti, että L-ornitiinin (250 mg/l) eksogeeninen annostelu vähensi merkittävästi H2O2:n (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; kuva 5A) ja O2•−:n (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; kuva 5B) kertymistä verrattuna sekä käsittelemättömien infektoituneiden kasvien (173,31 ± 12,06 ja 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW) että kaupallisella sienitautien torjunta-aineella Rizolex-T 50 mg/l käsiteltyjen kasvien (170,12 ± 9,50 ja 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt) kertymiseen 72 tunnissa. Korkeita H2O2- ja O2•−-pitoisuuksia kertyi hpt:n aikana (kuva 5A, B). Vastaavasti TCA-pohjainen malondialdehydi (MDA) -määritys osoitti, että S. sclerotiorum -tartunnan saaneiden papukasvien lehdissä kertyi suurempia MDA-pitoisuuksia (113,48 ± 10,02 nmol.g fr wt) (kuva 5C). L-ornitiinin eksogeeninen käyttö kuitenkin vähensi merkittävästi lipidiperoksidaatiota, mikä käy ilmi käsiteltyjen kasvien MDA-pitoisuuden laskusta (33,08 ± 4,00 nmol.g fr wt).
Kuva 5. Eksogeenisen L-ornitiinin käytön vaikutus oksidatiivisen stressin ja ei-entsymaattisten antioksidanttipuolustusmekanismien tärkeimpiin markkereihin S. sclerotiorum -tartunnan saaneissa pavunlehdissä 72 tuntia infektion jälkeen kasvihuoneolosuhteissa. (A) Vetyperoksidi (H2O2; nmol g−1 FW) 72 hpt:n kohdalla, (B) superoksidianioni (O2•−; nmol g−1 FW) 72 hpt:n kohdalla, (C) malondialdehydi (MDA; nmol g−1 FW) 72 hpt:n kohdalla, (D) liukoisten fenolien kokonaismäärä (mg GAE g−1 FW) 72 hpt:n kohdalla, (E) liukoisten flavonoidien kokonaismäärä (mg RE g−1 FW) 72 hpt:n kohdalla, (F) vapaiden aminohappojen kokonaismäärä (mg g−1 FW) 72 hpt:n kohdalla ja (G) proliinipitoisuus (mg g−1 FW) 72 hpt:n kohdalla. Arvot edustavat viiden biologisen toiston keskiarvoa ± keskihajontaa (keskiarvo ± SD) (n = 5). Eri kirjaimet osoittavat tilastollisesti merkitseviä eroja käsittelyjen välillä (p < 0,05).