Kiitos käynnistäsi nature.com-sivustolla. Käyttämäsi selainversio tukee CSS:ää rajoitetusti. Parhaan käyttökokemuksen saavuttamiseksi suosittelemme käyttämään uusinta selainversiota (tai poistamaan yhteensopivuustilan käytöstä Internet Explorerissa). Lisäksi jatkuvan tuen varmistamiseksi tämä sivusto ei sisällä tyylejä tai JavaScriptiä.
Pölymyrskyt ovat vakava uhka monille maille ympäri maailmaa niiden tuhoisien vaikutusten vuoksi maatalouteen, ihmisten terveyteen, liikenneverkkoihin ja infrastruktuuriin. Tämän seurauksena tuulieroosiota pidetään globaalina ongelmana. Yksi ympäristöystävällisistä lähestymistavoista tuulieroosion hillitsemiseksi on mikrobien indusoiman karbonaattisaostuksen (MICP) käyttö. Urean hajottamiseen perustuvan MICP:n sivutuotteet, kuten ammoniakki, eivät kuitenkaan ole ihanteellisia, kun niitä tuotetaan suuria määriä. Tässä tutkimuksessa esitellään kaksi kalsiumformiaattibakteeriformulaatiota MICP:n hajottamiseksi ilman urean tuotantoa ja vertaillaan kattavasti niiden suorituskykyä kahteen ammoniakkia tuottamattomaan kalsiumasetaattibakteeriformulaatioon. Tarkasteltavat bakteerit ovat Bacillus subtilis ja Bacillus amyloliquefaciens. Ensin määritettiin CaCO3:n muodostumista säätelevien tekijöiden optimoidut arvot. Sitten tehtiin tuulitunnelikokeita optimoiduilla formulaatioilla käsitellyille hiekkadyynien näytteille, ja mitattiin tuulieroosiokestävyyttä, irtoamiskynnysnopeutta ja hiekkapommituksen kestävyyttä. Kalsiumkarbonaattia (CaCO3) -allomorfeja arvioitiin optisen mikroskopian, pyyhkäisyelektronimikroskopian (SEM) ja röntgendiffraktioanalyysin avulla. Kalsiumformiaattipohjaiset formulaatiot toimivat merkittävästi paremmin kuin asetaattipohjaiset formulaatiot kalsiumkarbonaatin muodostumisen suhteen. Lisäksi B. subtilis tuotti enemmän kalsiumkarbonaattia kuin B. amyloliquefaciens. SEM-mikrokuvat osoittivat selvästi aktiivisten ja inaktiivisten bakteerien sitoutumisen ja painautumisen kalsiumkarbonaattiin sedimentaation seurauksena. Kaikki formulaatiot vähensivät merkittävästi tuulieroosiota.
Tuulieroosiota on pitkään pidetty merkittävänä ongelmana kuivilla ja puolikuivilla alueilla, kuten Yhdysvaltojen lounaisosassa, Länsi-Kiinassa, Saharan Afrikassa ja suuressa osassa Lähi-itää1. Vähäiset sademäärät kuivissa ja hyperkuivissa ilmastoissa ovat muuttaneet suuria osia näistä alueista aavikoiksi, hiekkadyyneiksi ja viljelemättömiksi maiksi. Jatkuva tuulieroosio aiheuttaa ympäristöuhkia infrastruktuurille, kuten liikenneverkoille, maatalousmaalle ja teollisuusmaalle, mikä johtaa huonoihin elinoloihin ja korkeisiin kaupunkikehityskustannuksiin näillä alueilla2,3,4. On tärkeää huomata, että tuulieroosio ei vaikuta ainoastaan ​​sijaintiinsa, jossa sitä esiintyy, vaan aiheuttaa myös terveys- ja taloudellisia ongelmia syrjäisillä yhteisöillä, koska se kuljettaa hiukkasia tuulen mukana kauas lähteestä5,6.
Tuulieroosion torjunta on edelleen maailmanlaajuinen ongelma. Maaperän stabilointiin käytetään useita menetelmiä tuulieroosion torjumiseksi. Näihin menetelmiin kuuluvat materiaalit, kuten vesilevitys7, öljykatteet8, biopolymeerit5, mikrobien indusoima karbonaattisaostus (MICP)9,10,11,12 ja entsyymien indusoima karbonaattisaostus (EICP)1. Maaperän kostutus on pellolla käytetty pölynsidontamenetelmä. Sen nopea haihtuminen tekee tästä menetelmästä kuitenkin tehottoman kuivilla ja puolikuivilla alueilla1. Öljykatteyhdisteiden käyttö lisää hiekan koheesiota ja hiukkasten välistä kitkaa. Niiden koheesio-ominaisuus sitoo hiekanjyvät yhteen; öljykatteet aiheuttavat kuitenkin myös muita ongelmia; niiden tumma väri lisää lämmön imeytymistä ja johtaa kasvien ja mikro-organismien kuolemaan. Niiden haju ja höyryt voivat aiheuttaa hengitystieongelmia, ja mikä merkittävin, niiden korkea hinta on toinen este. Biopolymeerit ovat yksi äskettäin ehdotetuista ympäristöystävällisistä menetelmistä tuulieroosion lieventämiseksi; niitä uutetaan luonnollisista lähteistä, kuten kasveista, eläimistä ja bakteereista. Ksantaanikumi, guarkumi, kitosaani ja gellaanikumi ovat yleisimmin käytettyjä biopolymeerejä tekniikan sovelluksissa5. Vesiliukoiset biopolymeerit voivat kuitenkin menettää lujuuttaan ja liueta maaperästä, kun ne altistuvat vedelle13,14. EICP:n on osoitettu olevan tehokas pölynsidontamenetelmä useissa eri sovelluksissa, kuten päällystämättömillä teillä, jätealtailla ja rakennustyömailla. Vaikka sen tulokset ovat rohkaisevia, on otettava huomioon joitakin mahdollisia haittoja, kuten kustannukset ja ydintymiskohtien puute (mikä nopeuttaa CaCO3-kiteiden muodostumista ja saostumista15,16).
Murray ja Irwin (1890) sekä Steinmann (1901) kuvasivat MICP:n ensimmäisen kerran 1800-luvun lopulla tutkimuksessaan urean hajottamisesta merimikro-organismeissa17. MICP on luonnossa esiintyvä biologinen prosessi, johon liittyy useita mikrobien toimintoja ja kemiallisia prosesseja, joissa kalsiumkarbonaatti saostuu mikrobien metaboliittien karbonaatti-ionien reaktion kautta ympäristön kalsiumionien kanssa18,19. Ureaa hajottavaan typpikiertoon liittyvä MICP (ureaa hajottava MICP) on yleisin mikrobien aiheuttama karbonaattisaostuma, jossa bakteerien tuottama ureaasi katalysoi urean hydrolyysiä20,21,22,23,24,25,26,27 seuraavasti:
Orgaanisen suolan hapettumisen hiilikiertoon liittyvässä MICP:ssä (MICP ilman urean hajoamista) heterotrofiset bakteerit käyttävät energianlähteinä orgaanisia suoloja, kuten asetaattia, laktaattia, sitraattia, sukkinaattia, oksalaattia, malaattia ja glyoksylaattia, karbonaattimineraalien tuottamiseksi28. Kalsiumlaktaatin ollessa hiilenlähteenä ja kalsiumionien läsnä ollessa kalsiumkarbonaatin muodostumisen kemiallinen reaktio on esitetty yhtälössä (5).
MICP-prosessissa bakteerisolut tarjoavat ydintymiskohtia, jotka ovat erityisen tärkeitä kalsiumkarbonaatin saostumiselle; bakteerisolun pinta on negatiivisesti varautunut ja voi toimia adsorbenttina kaksiarvoisille kationeille, kuten kalsiumioneille. Adsorboimalla kalsiumioneja bakteerisoluihin, kun karbonaatti-ionipitoisuus on riittävä, kalsiumkationit ja karbonaattianionit reagoivat ja kalsiumkarbonaattia saostuu bakteerin pinnalle29,30. Prosessi voidaan tiivistää seuraavasti31,32:
Biogeneroituneet kalsiumkarbonaattikiteet voidaan jakaa kolmeen tyyppiin: kalsiitti, vateriitti ja aragoniitti. Näistä kalsiitti ja vateriitti ovat yleisimmät bakteerien indusoimat kalsiumkarbonaattiallomorfit33,34. Kalsiitti on termodynaamisesti stabiilein kalsiumkarbonaattiallomorfi35. Vaikka vateriitin on raportoitu olevan metastabiili, se muuttuu lopulta kalsiitiksi36,37. Vateriitti on näistä kiteistä tihein. Se on kuusikulmainen kide, jolla on parempi huokosten täyttökyky kuin muilla kalsiumkarbonaattikiteillä suuremman kokonsa ansiosta38. Sekä urean hajottama että urean hajottamaton MICP voi johtaa vateriitin saostumiseen13,39,40,41.
Vaikka MICP:llä on osoitettu lupaavaa potentiaalia ongelmallisten ja tuulieroosiolle alttiiden maiden stabiloinnissa42,43,44,45,46,47,48, yksi urean hydrolyysin sivutuotteista on ammoniakki, joka voi aiheuttaa lieviä tai vakavia terveysongelmia altistustasosta riippuen49. Tämä sivuvaikutus tekee tämän teknologian käytöstä kiistanalaista, varsinkin kun on käsiteltävä suuria alueita, kuten pölynsidonnassa. Lisäksi ammoniakin haju on sietämätöntä, kun prosessi suoritetaan suurilla levitysmäärillä ja suurilla määrillä, mikä voi vaikuttaa sen käytännön sovellettavuuteen. Vaikka viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että ammoniumioneja voidaan vähentää muuntamalla ne muiksi tuotteiksi, kuten struviittiksi, nämä menetelmät eivät poista ammoniumioneja kokonaan50. Siksi on edelleen tarpeen tutkia vaihtoehtoisia ratkaisuja, jotka eivät tuota ammoniumioneja. Muiden kuin urean hajoamisreittien käyttö MICP:lle voi tarjota potentiaalisen ratkaisun, jota on tutkittu huonosti tuulieroosion hillitsemisen yhteydessä. Fattahi ym. tutkivat ureatonta MICP:n hajoamista käyttämällä kalsiumasetaattia ja Bacillus megateriumia41, kun taas Mohebbi ym. käytettiin kalsiumasetaattia ja Bacillus amyloliquefaciens9:ää. Heidän tutkimustaan ​​ei kuitenkaan verrattu muihin kalsiumin lähteisiin ja heterotrofisiin bakteereihin, jotka voisivat lopulta parantaa tuulieroosiokestävyyttä. Kirjallisuutta, jossa verrattaisiin ureattomia hajoamisreittejä urean hajoamisreitteihin tuulieroosion hillitsemisessä, ei myöskään ole.
Lisäksi useimmat tuulen aiheuttamaa eroosio- ja pölyntorjuntatutkimusta on tehty tasaisilla maanäytteillä.1,51,52,53 Tasaiset pinnat ovat kuitenkin luonnossa harvinaisempia kuin kukkulat ja painaumat. Tästä syystä hiekkadyynit ovat yleisin maisemapiirre aavikkoalueilla.
Edellä mainittujen puutteiden korjaamiseksi tässä tutkimuksessa pyrittiin esittelemään uusi joukko ammoniakkia tuottamattomia bakteeriperäisiä aineita. Tätä varten tarkastelimme ureaa hajottamattomia MICP-reittejä. Tutkimuksessa tutkittiin kahden kalsiumlähteen (kalsiumformiaatti ja kalsiumasetaatti) tehokkuutta. Kirjoittajien tietämyksen mukaan karbonaattisaostusta käyttämällä kahta kalsiumlähteen ja bakteerien yhdistelmää (eli kalsiumformiaatti-Bacillus subtilis ja kalsiumformiaatti-Bacillus amyloliquefaciens) ei ole tutkittu aiemmissa tutkimuksissa. Näiden bakteerien valinta perustui niiden tuottamiin entsyymeihin, jotka katalysoivat kalsiumformiaatin ja kalsiumasetaatin hapettumista mikrobien karbonaattisaostukseksi. Suunnittelimme perusteellisen kokeellisen tutkimuksen löytääksemme optimaaliset tekijät, kuten pH:n, bakteerityyppien ja kalsiumlähteiden ja niiden pitoisuuksien, bakteerien ja kalsiumlähdeliuoksen suhteen sekä kovetusajan. Lopuksi tutkittiin tämän bakteeriperäisten aineiden tehokkuutta tuulieroosion estämisessä kalsiumkarbonaatin saostumisen avulla suorittamalla sarja tuulitunnelikokeita hiekkadyyneillä hiekan tuulieroosion suuruuden, irtoamisnopeuden kynnyksen ja tuulipommitusten kestävyyden määrittämiseksi. Lisäksi tehtiin penetrometrimittauksia ja mikrorakennetutkimuksia (esim. röntgendiffraktioanalyysi (XRD) ja pyyhkäisyelektronimikroskopia (SEM)).
Kalsiumkarbonaatin tuotanto vaatii kalsiumioneja ja karbonaatti-ioneja. Kalsiumioneja voidaan saada useista kalsiumlähteistä, kuten kalsiumkloridista, kalsiumhydroksidista ja rasvattomasta maitojauheesta54,55. Karbonaatti-ioneja voidaan tuottaa erilaisilla mikrobimenetelmillä, kuten ureahydrolyysillä ja orgaanisen aineen aerobisella tai anaerobisella hapetuksella56. Tässä tutkimuksessa karbonaatti-ioneja saatiin formiaatin ja asetaatin hapetusreaktiosta. Lisäksi käytimme formiaatin ja asetaatin kalsiumsuoloja puhtaan kalsiumkarbonaatin tuottamiseen, jolloin sivutuotteina saatiin vain CO2:ta ja H2O:ta. Tässä prosessissa vain yksi aine toimii kalsiumin lähteenä ja karbonaatin lähteenä, eikä ammoniakkia synny. Nämä ominaisuudet tekevät kalsiumin lähteestä ja karbonaatin tuotantomenetelmästä erittäin lupaavan.
Kalsiumformiaatin ja kalsiumasetaatin vastaavat reaktiot kalsiumkarbonaatin muodostamiseksi on esitetty kaavoissa (7)-(14). Kaavat (7)-(11) osoittavat, että kalsiumformiaatti liukenee veteen muodostaen muurahaishappoa tai formiaattia. Liuos on siten vapaiden kalsium- ja hydroksidi-ionien lähde (kaavat 8 ja 9). Muurahaishapon hapettumisen seurauksena muurahaishapon hiiliatomit muuttuvat hiilidioksidiksi (kaava 10). Lopulta muodostuu kalsiumkarbonaattia (kaavat 11 ja 12).
Samoin kalsiumkarbonaattia muodostuu kalsiumasetaatista (yhtälöt 13–15), paitsi että muurahaishapon sijaan muodostuu etikkahappoa tai asetaattia.
Ilman entsyymien läsnäoloa asetaattia ja formiaattia ei voida hapettaa huoneenlämmössä. FDH (formiaattidehydrogenaasi) ja CoA (koentsyymi A) katalysoivat formiaatin ja asetaatin hapettumista hiilidioksidiksi (yhtälöt 16, 17) 57, 58, 59. Useat bakteerit pystyvät tuottamaan näitä entsyymejä, ja tässä tutkimuksessa käytettiin heterotrofisia bakteereja, nimittäin Bacillus subtilis (PTCC #1204 (Persian Type Culture Collection), joka tunnetaan myös nimellä NCIMB #13061 (International Collection of Bacteria, Yeast, Phage, Plasmids, Plant Seeds and Plant Cell Tissue Cultures)) ja Bacillus amyloliquefaciens (PTCC #1732, NCIMB #12077). Näitä bakteereja viljeltiin elatusaineessa, joka sisälsi lihapeptonia (5 g/l) ja lihauutetta (3 g/l), jota kutsutaan ravintoliemeksi (NBR) (105443 Merck).
Näin ollen valmistettiin neljä formulaatiota kalsiumkarbonaatin saostumisen indusoimiseksi käyttämällä kahta kalsiumlähdettä ja kahta bakteeria: kalsiumformiaattia ja Bacillus subtilis (FS), kalsiumformiaattia ja Bacillus amyloliquefaciens (FA), kalsiumasetaattia ja Bacillus subtilis (AS) sekä kalsiumasetaattia ja Bacillus amyloliquefaciens (AA).
Kokeellisen suunnittelun ensimmäisessä osassa tehtiin testejä optimaalisen yhdistelmän määrittämiseksi, jolla saavutettaisiin maksimaalinen kalsiumkarbonaatin tuotanto. Koska maanäytteet sisälsivät kalsiumkarbonaattia, suunniteltiin sarja alustavia arviointitestejä eri yhdistelmien tuottaman CaCO3:n tarkkaan mittaamiseksi, ja arvioitiin viljelyalustan ja kalsiumin lähdeliuosten seoksia. Jokaiselle edellä määritellylle kalsiumin lähde- ja bakteeriliuosyhdistelmälle (FS, FA, AS ja AA) johdettiin optimointikertoimet (kalsiumin lähdepitoisuus, kovetusaika, bakteeriliuoksen pitoisuus mitattuna liuoksen optisella tiheydellä (OD), kalsiumin lähde-bakteeriliuossuhde ja pH), joita käytettiin seuraavissa osioissa kuvatuissa hiekkadyynien käsittelyyn tarkoitetuissa tuulitunnelikokeissa.
Jokaiselle yhdistelmälle tehtiin 150 koetta CaCO3-saostuksen vaikutuksen tutkimiseksi ja eri tekijöiden arvioimiseksi, nimittäin kalsiumlähteen pitoisuuden, kovetusajan, bakteerien OD-arvon, kalsiumlähteen ja bakteeriliuoksen suhteen sekä pH:n arvioimiseksi orgaanisen aineen aerobisen hapetuksen aikana (taulukko 1). Optimoidun prosessin pH-alue valittiin Bacillus subtilis- ja Bacillus amyloliquefaciens -bakteerien kasvukäyrien perusteella nopeamman kasvun saavuttamiseksi. Tämä selitetään tarkemmin Tulokset-osiossa.
Näytteet optimointivaihetta varten valmisteltiin seuraavien vaiheiden mukaisesti. MICP-liuos valmistettiin ensin säätämällä viljelyalustan alku-pH:ta ja autoklavoitiin sitten 121 °C:ssa 15 minuutin ajan. Kanta inokuloitiin sitten laminaariseen ilmavirtaukseen ja pidettiin ravistelevassa inkubaattorissa 30 °C:ssa ja nopeudella 180 rpm. Kun bakteerien OD saavutti halutun tason, se sekoitettiin kalsiumlähdeliuokseen halutussa suhteessa (kuva 1a). MICP-liuoksen annettiin reagoida ja jähmettyä ravistelevassa inkubaattorissa nopeudella 220 rpm ja 30 °C:ssa ajan, kunnes tavoitearvo saavutettiin. Saostunut CaCO3 erotettiin sentrifugoinnin jälkeen 6000 g:ssä 5 minuutin ajan ja kuivattiin sitten 40 °C:ssa näytteiden valmistamiseksi kalsimetritestiä varten (kuva 1b). CaCO3:n saostuminen mitattiin sitten Bernardin kalsimetrillä, jossa CaCO3-jauhe reagoi 1,0 N HCl:n (ASTM-D4373-02) kanssa muodostaen CO2:ta, ja tämän kaasun tilavuus mittaa CaCO3-pitoisuutta (kuva 1c). CO2:n tilavuuden muuntamiseksi CaCO3-pitoisuudeksi luotiin kalibrointikäyrä pesemällä puhdasta CaCO3-jauhetta 1 N HCl:lla ja piirtämällä se kehittyneen CO2:n funktiona. Saostuneen CaCO3-jauheen morfologiaa ja puhtautta tutkittiin SEM-kuvantamisen ja XRD-analyysin avulla. Bakteerien ympärille kalsiumkarbonaatin muodostumista, muodostuneen kalsiumkarbonaatin faasia ja bakteerien aktiivisuutta tutkittiin 1000-kertaisella suurennuksella varustetulla optisella mikroskoopilla.
Dejeghin allas on tunnettu voimakkaasti eroosion runtelema alue Lounais-Farsin maakunnassa Iranissa, ja tutkijat keräsivät alueelta tuulen erodoimia maanäytteitä. Näytteet otettiin tutkimusta varten maan pinnalta. Maaperänäytteiden indikaattoritestit osoittivat, että maaperä oli huonosti lajiteltua hiekkaista ja silttipitoista maaperää, joka luokiteltiin SP-SM:ksi yhtenäisen maaperän luokittelujärjestelmän (USC) mukaan (kuva 2a). XRD-analyysi osoitti, että Dejeghin maaperä koostui pääasiassa kalsiitista ja kvartsista (kuva 2b). Lisäksi EDX-analyysi osoitti, että muita alkuaineita, kuten Al:a, K:a ja Fe:tä, oli läsnä pienempiä osuuksia.
Laboratoriodyynien valmistamiseksi tuulieroosiokokeita varten maaperä murskattiin 170 mm:n korkeudelta 10 mm:n halkaisijaltaan olevan suppilon läpi kiinteälle pinnalle, jolloin saatiin tyypillinen 60 mm korkea ja 210 mm halkaisijaltaan oleva dyyni. Luonnossa tiheimmät hiekkadyynit muodostuvat eolisten prosessien seurauksena. Vastaavasti edellä mainitulla menetelmällä valmistetulla näytteellä oli pienin suhteellinen tiheys, γ = 14,14 kN/m³, muodostaen vaakasuoralle pinnalle kerrostuneen hiekkakartion, jonka lepokulma oli noin 29,7°.
Edellisessä osiossa saatu optimaalinen MICP-liuos ruiskutettiin dyynien rinteelle annosmäärillä 1, 2 ja 3 lm-2, minkä jälkeen näytteet säilytettiin inkubaattorissa 30 °C:ssa (kuva 3) 9 päivän ajan (eli optimaalinen kovettumisaika) ja vietiin sitten tuulitunnelitestausta varten.
Jokaista käsittelyä varten valmistettiin neljä näytettä, yksi kalsiumkarbonaattipitoisuuden ja pintalujuuden mittaamiseen penetrometrillä, ja loput kolme näytettä käytettiin eroosiotesteihin kolmella eri nopeudella. Tuulitunnelikokeissa eroosiomäärä määritettiin eri tuulen nopeuksilla, ja sitten kunkin käsitellyn näytteen irtoamisnopeus kynnysarvo määritettiin käyttämällä eroosiomäärän ja tuulen nopeuden kuvaajaa. Tuulieroosiokokeiden lisäksi käsitellyille näytteille tehtiin hiekkapommitus (eli hyppykokeet). Tätä tarkoitusta varten valmistettiin kaksi lisänäytettä levitysmäärillä 2 ja 3 L m−2. Hiekkapommitustesti kesti 15 minuuttia 120 gm−1:n virtauksella, joka on aiemmissa tutkimuksissa valittujen arvojen alueella60,61,62. Hioma-suuttimen ja dyynin pohjan välinen vaakasuora etäisyys oli 800 mm, ja se sijaitsi 100 mm tunnelin pohjan yläpuolella. Tämä asento asetettiin siten, että lähes kaikki hyppivät hiekkapartikkelit putosivat dyynille.
Tuulitunnelitesti suoritettiin avoimessa tuulitunnelissa, jonka pituus oli 8 m, leveys 0,4 m ja korkeus 1 m (kuva 4a). Tuulitunneli on valmistettu galvanoiduista teräslevyistä ja se voi tuottaa jopa 25 m/s tuulennopeuden. Lisäksi taajuusmuuttajaa käytetään tuulettimen taajuuden säätämiseen ja taajuuden asteittaiseen lisäämiseen tavoitellun tuulen nopeuden saavuttamiseksi. Kuva 4b esittää kaaviokuvan tuulen kuluttamista hiekkadyyneistä ja tuulitunnelissa mitatusta tuulen nopeusprofiilista.
Lopuksi, tässä tutkimuksessa ehdotetun ei-urealyyttisen MICP-formulaation tulosten vertaamiseksi urealyyttisen MICP-kontrollitestin tuloksiin valmistettiin myös dyyninäytteitä ja käsiteltiin biologisella liuoksella, joka sisälsi ureaa, kalsiumkloridia ja Sporosarcina pasteuriita (koska Sporosarcina pasteuriilla on merkittävä kyky tuottaa ureaasia63). Bakteeriliuoksen optinen tiheys oli 1,5 ja urean ja kalsiumkloridin pitoisuudet olivat 1 M (valittu aiemmissa tutkimuksissa suositeltujen arvojen perusteella36,64,65). Viljelyalusta koostui ravinneliemestä (8 g/l) ja ureasta (20 g/l). Bakteeriliuos ruiskutettiin dyynien pinnalle ja annettiin seistä 24 tuntia bakteerien kiinnittymistä varten. 24 tunnin kiinnittymisen jälkeen ruiskutettiin sementointiliuosta (kalsiumkloridia ja ureaa). Urealyyttistä MICP-kontrollitestiä kutsutaan jäljempänä UMC:ksi. Urealyyttisesti ja ei-urealyyttisesti käsiteltyjen maanäytteiden kalsiumkarbonaattipitoisuus määritettiin pesemällä Choin ym.66 ehdottaman menetelmän mukaisesti.
Kuva 5 esittää Bacillus amyloliquefaciensin ja Bacillus subtiliksen kasvukäyriä viljelyalustassa (ravinneliuoksessa), jonka alku-pH-alue oli 5–10. Kuten kuvassa näkyy, Bacillus amyloliquefaciens ja Bacillus subtilis kasvoivat nopeammin pH-arvoissa 6–8 ja 7–9. Siksi tätä pH-aluetta käytettiin optimointivaiheessa.
(a) Bacillus amyloliquefaciensin ja (b) Bacillus subtiliksen kasvukäyrät ravintoalustan eri alku-pH-arvoilla.
Kuva 6 esittää Bernardin kalkkimittarissa tuotetun hiilidioksidin määrän, joka edustaa saostunutta kalsiumkarbonaattia (CaCO3). Koska yksi tekijä oli kiinteä jokaisessa yhdistelmässä ja muita tekijöitä vaihdeltiin, jokainen piste näissä kaavioissa vastaa hiilidioksidin enimmäistilavuutta kyseisessä koesarjassa. Kuten kuvassa näkyy, kalsiumlähteen pitoisuuden kasvaessa kalsiumkarbonaatin tuotanto kasvoi. Siksi kalsiumlähteen pitoisuus vaikuttaa suoraan kalsiumkarbonaatin tuotantoon. Koska kalsiumlähde ja hiililähde ovat samat (eli kalsiumformiaatti ja kalsiumasetaatti), mitä enemmän kalsiumioneja vapautuu, sitä enemmän kalsiumkarbonaattia muodostuu (kuva 6a). AS- ja AA-formulaatioissa kalsiumkarbonaatin tuotanto jatkoi kasvuaan kovettumisajan pidentyessä, kunnes saostuman määrä oli lähes muuttumaton 9 päivän kuluttua. FA-formulaatiossa kalsiumkarbonaatin muodostumisnopeus laski, kun kovettumisaika ylitti 6 päivää. Verrattuna muihin formulaatioihin, FS-formulaatio osoitti suhteellisen alhaisen kalsiumkarbonaatin muodostumisnopeuden 3 päivän kuluttua (kuva 6b). Formulaatioissa FA ja FS kalsiumkarbonaatin kokonaistuotannosta saatiin 70 % ja 87 % kolmen päivän kuluttua, kun taas formulaatioissa AA ja AS tämä osuus oli vain noin 46 % ja 45 %. Tämä osoittaa, että muurahaishappopohjaisella formulaatiolla on korkeampi CaCO3:n muodostumisnopeus alkuvaiheessa verrattuna asetaattipohjaiseen formulaatioon. Muodostumisnopeus kuitenkin hidastuu kovettumisajan kasvaessa. Kuvasta 6c voidaan päätellä, että edes OD1:tä suuremmilla bakteeripitoisuuksilla ei ole merkittävää vaikutusta kalsiumkarbonaatin muodostumiseen.
Bernardin kalsimetrillä mitatun CO2-tilavuuden (ja vastaavan CaCO3-pitoisuuden) muutos funktiona seuraavista: (a) kalsiumlähteen pitoisuus, (b) kovettumisaika, (c) OD, (d) alku-pH, (e) kalsiumlähteen ja bakteeriliuoksen suhde (kullakin formulaatiolla); ja (f) kunkin kalsiumlähteen ja bakteerien yhdistelmän tuottama kalsiumkarbonaatin enimmäismäärä.
Kuvio 6d osoittaa, että FA:n ja FS:n osalta CaCO3:n tuotanto saavutti maksimiarvon pH-arvossa 7. Tämä havainto on yhdenmukainen aiempien tutkimusten kanssa, joiden mukaan FDH-entsyymit ovat stabiileimpia pH-arvossa 7–6,7. AA:n ja AS:n osalta CaCO3:n saostuminen kuitenkin lisääntyi, kun pH ylitti arvon 7. Aiemmat tutkimukset osoittivat myös, että optimaalinen pH-alue CoA-entsyymiaktiivisuudelle on 8:sta 9,2–6,8:aan. Koska optimaaliset pH-alueet CoA-entsyymiaktiivisuudelle ja B. amyloliquefaciensin kasvulle ovat (8–9,2) ja (6–8) (kuvio 5a), AA-formulaation optimaalisen pH:n odotetaan olevan 8, ja nämä kaksi pH-aluetta ovat päällekkäisiä. Tämä tosiasia vahvistettiin kokeilla, kuten kuviossa 6d on esitetty. Koska B. subtilis -kasvun optimaalinen pH on 7–9 (kuva 5b) ja CoA-entsyymiaktiivisuuden optimaalinen pH on 8–9,2, CaCO3-saostumisen maksimisaannon odotetaan olevan pH-alueella 8–9, mikä on vahvistettu kuvassa 6d (eli optimaalinen saostumisen pH on 9). Kuvassa 6e esitetyt tulokset osoittavat, että kalsiumlähdeliuoksen ja bakteeriliuoksen optimaalinen suhde on 1 sekä asetaatti- että formiaattiliuoksille. Vertailun vuoksi eri formulaatioiden (eli AA, AS, FA ja FS) suorituskykyä arvioitiin CaCO3:n maksimituotannon perusteella eri olosuhteissa (eli kalsiumlähdepitoisuus, kovettumisaika, OD, kalsiumlähdeliuoksen ja bakteeriliuoksen suhde ja alkuperäinen pH). Tutkituista formulaatioista formulaatiolla FS oli suurin CaCO3:n tuotanto, joka oli noin kolme kertaa suurempi kuin formulaatiolla AA (kuva 6f). Molemmille kalsiumlähteille tehtiin neljä bakteeritonta kontrollikoetta, eikä CaCO3:n saostumista havaittu 30 päivän kuluttua.
Kaikkien formulaatioiden optiset mikroskopiakuvat osoittivat, että vateriitti oli pääasiallinen faasi, jossa kalsiumkarbonaatti muodostui (kuva 7). Vateriittikiteet olivat muodoltaan pallomaisia69,70,71. Havaittiin, että kalsiumkarbonaatti saostui bakteerisolujen pinnalle, koska bakteerisolujen pinta oli negatiivisesti varautunut ja saattoi toimia adsorbenttina kaksiarvoisille kationeille. Tässä tutkimuksessa esimerkkinä formulaatiosta FS 24 tunnin kuluttua kalsiumkarbonaattia alkoi muodostua joidenkin bakteerisolujen pinnalle (kuva 7a), ja 48 tunnin kuluttua kalsiumkarbonaatilla päällystettyjen bakteerisolujen määrä kasvoi merkittävästi. Lisäksi, kuten kuvassa 7b on esitetty, voitiin havaita myös vateriittihiukkasia. Lopuksi 72 tunnin kuluttua suuri määrä bakteereja näytti olevan sitoutuneena vateriittikiteisiin, ja vateriittihiukkasten määrä kasvoi merkittävästi (kuva 7c).
CaCO3-saostumisen optiset mikroskopiahavainnot FS-koostumuksissa ajan kuluessa: (a) 24, (b) 48 ja (c) 72 tuntia.
Saostuneen faasin morfologian tutkimiseksi tehtiin jauheiden röntgendiffraktio- (XRD) ja SEM-analyysit. XRD-spektrit (kuva 8a) ja SEM-mikrokuvat (kuva 8b, c) vahvistivat vateriittikiteiden läsnäolon, sillä niillä oli salaattimainen muoto ja vateriittipiikkien ja saostuman piikkien välillä havaittiin vastaavuus.
(a) Muodostuneen CaCO3:n ja vateriitin röntgendiffraktiospektrien vertailu. Vateriitin SEM-mikrokuvat (b) 1 kHz:n ja (c) 5,27 kHz:n suurennuksilla.
Tuulitunnelikokeiden tulokset on esitetty kuvassa 9a, b. Kuvasta 9a voidaan nähdä, että käsittelemättömän hiekan kynnyseroosionopeus (TDV) on noin 4,32 m/s. Levitysmäärällä 1 l/m² (kuva 9a) maaperän hävikkikäyrien kulmakertoimet fraktioille FA, FS, AA ja UMC ovat suunnilleen samat kuin käsittelemättömällä dyynillä. Tämä osoittaa, että käsittely tällä levitysmäärällä on tehotonta, ja heti kun tuulen nopeus ylittää TDV:n, ohut maakerros katoaa ja dyynien eroosionopeus on sama kuin käsittelemättömällä dyynillä. Fraktion AS eroosiokulma on myös pienempi kuin muiden fraktioiden, joilla on matalampi abskissa (eli TDV) (kuva 9a). Kuvan 9b nuolet osoittavat, että suurimmalla tuulennopeudella 25 m/s käsitellyillä dyyneillä ei esiintynyt eroosiota levitysmäärillä 2 ja 3 l/m². Toisin sanoen FS-, FA-, AS- ja UMC-lajikkeiden kohdalla dyynit olivat vastustuskykyisempiä CaCO³-laskeuman aiheuttamalle tuulieroosiolle 2 ja 3 l/m²:n levitysmäärillä kuin suurimmalla tuulennopeudella (eli 25 m/s). Näin ollen näissä testeissä saatu TDV-arvo 25 m/s on kuvassa 9b esitettyjen levitysmäärien alaraja, lukuun ottamatta AA-lajiketta, jossa TDV on lähes yhtä suuri kuin tuulitunnelin suurin nopeus.
Tuulieroosiotesti (a) Painonpudotus tuulen nopeuden funktiona (levitysmäärä 1 l/m2), (b) Kynnysrepäisynopeus levitysmäärän ja koostumuksen funktiona (CA kalsiumasetaatille, CF kalsiumformiaatille).
Kuva 10 esittää eri koostumuksilla ja levitysmäärillä käsiteltyjen hiekkadyynien pintaeroosiota hiekkapommitustestin jälkeen, ja kvantitatiiviset tulokset on esitetty kuvassa 11. Käsittelemätöntä tapausta ei ole esitetty, koska se ei osoittanut vastustuskykyä ja erodoitui kokonaan (kokonaismassahävikki) hiekkapommitustestin aikana. Kuvasta 11 käy ilmi, että biokoostumuksella AA käsitelty näyte menetti 83,5 % painostaan ​​2 l/m2:n levitysmäärällä, kun taas kaikki muut näytteet osoittivat alle 30 %:n eroosiota hiekkapommitusprosessin aikana. Kun levitysmäärää nostettiin 3 l/m2:iin, kaikki käsitellyt näytteet menettivät alle 25 % painostaan. Molemmilla levitysmäärillä yhdiste FS osoitti parasta vastustuskykyä hiekkapommitukselle. FS- ja AA-käsiteltyjen näytteiden suurin ja pienin pommituskestävyys voidaan katsoa johtuvan niiden suurimmasta ja pienimmästä CaCO3-saostumisesta (kuva 6f).
Eri koostumuksilla varustettujen hiekkadyynien pommituksen tulokset virtausnopeuksilla 2 ja 3 l/m2 (nuolet osoittavat tuulen suunnan, ristit osoittavat piirustuksen tasoon nähden kohtisuoran tuulen suunnan).
Kuten kuvassa 12 on esitetty, kaikkien koostumusten kalsiumkarbonaattipitoisuus kasvoi levitysmäärän kasvaessa 1 l/m²:stä 3 l/m²:ään. Lisäksi kaikilla levitysmäärillä korkeimman kalsiumkarbonaattipitoisuuden omaava koostumus oli FS, jota seurasivat FA ja UMC. Tämä viittaa siihen, että näillä koostumuksilla voi olla parempi pinnankestävyys.
Kuvio 13a esittää käsittelemättömän, kontrolli- ja käsitellyn maanäytteen pintaresistanssin muutoksen permeametritestillä mitattuna. Kuviosta käy ilmi, että UMC-, AS-, FA- ja FS-formulaatioiden pintaresistanssi kasvoi merkittävästi levitysmäärän kasvaessa. Pinnan lujuuden kasvu oli kuitenkin suhteellisen pieni AA-formulaatiossa. Kuten kuviosta käy ilmi, urealla hajottamattomien MICP-valmisteiden FA- ja FS-formulaatioilla on parempi pinnan läpäisevyys verrattuna urealla hajotettuun MICP:hen. Kuvio 13b esittää TDV:n muutoksen maan pintaresistanssin mukaan. Kuviosta käy selvästi ilmi, että dyyneillä, joiden pintaresistanssi on yli 100 kPa, irtoamisnopeuden kynnys ylittää 25 m/s. Koska in situ -pintaresistanssi voidaan helposti mitata permeametrillä, tämä tieto voi auttaa arvioimaan TDV:tä ilman tuulitunnelikokeita, ja siten se toimii laadunvalvontaindikaattorina kenttäsovelluksissa.
SEM-tulokset on esitetty kuvassa 14. Kuvat 14a-b esittävät käsittelemättömän maanäytteen suurentuneita hiukkasia, mikä osoittaa selvästi, että se on koheesiivinen eikä siinä ole luonnollista sidosta tai sementaatiota. Kuva 14c esittää urealla hajotetulla MICP:llä käsitellyn kontrollinäytteen SEM-mikrokuvaa. Tämä kuva osoittaa CaCO3-saostumien läsnäolon kalsiittipolymorfeina. Kuten kuvissa 14d-o on esitetty, saostunut CaCO3 sitoo hiukkaset yhteen; SEM-mikrokuvissa voidaan tunnistaa myös pallomaisia ​​vateriittikiteitä. Tämän ja aiempien tutkimusten tulokset osoittavat, että vateriittipolymorfeina muodostuneet CaCO3-sidokset voivat myös tarjota kohtuullisen mekaanisen lujuuden; tuloksemme osoittavat, että pintavastus kasvaa 350 kPa:iin ja kynnyserotaationopeus kasvaa 4,32:sta yli 25 m/s:iin. Tämä tulos on yhdenmukainen aiempien tutkimusten tulosten kanssa, joiden mukaan MICP:llä saostetun CaCO3:n matriisi on vateriitti, jolla on kohtuullinen mekaaninen lujuus ja tuulieroosionkestävyys13,40 ja joka voi säilyttää kohtuullisen tuulieroosionkestävyyden jopa 180 päivän kenttäolosuhteille altistumisen jälkeen13.
(a, b) käsittelemättömän maaperän SEM-mikrokuvat, (c) MICP-urean hajoamisen kontrolli, (df) AA-käsitellyt näytteet, (gi) AS-käsitellyt näytteet, (jl) FA-käsitellyt näytteet ja (mo) FS-käsitellyt näytteet 3 l/m2:n levitysnopeudella eri suurennuksilla.
Kuva 14d-f osoittaa, että AA-yhdisteillä käsittelyn jälkeen kalsiumkarbonaattia saostui pinnalle ja hiekanjyvien väliin, ja havaittiin myös joitakin päällystämättömiä hiekanjyviä. AS-komponenttien tapauksessa, vaikka muodostuneen CaCO3:n määrä ei lisääntynyt merkittävästi (kuva 6f), CaCO3:n aiheuttamien hiekanjyvien välisten kontaktien määrä kasvoi merkittävästi verrattuna AA-yhdisteisiin (kuva 14g-i).
Kuvista 14j-l ja 14m-o käy ilmi, että kalsiumformiaatin käyttö kalsiumlähteenä johtaa CaCO3-saostumisen lisääntymiseen entisestään AS-yhdisteeseen verrattuna, mikä on yhdenmukaista kuvan 6f kalsiummittarin mittausten kanssa. Tämä ylimääräinen CaCO3 näyttää kertyvän pääasiassa hiekkapartikkeleihin eikä välttämättä paranna kosketuslaatua. Tämä vahvistaa aiemmin havaitun käyttäytymisen: huolimatta CaCO3-saostumisen määrän eroista (kuva 6f), kolme formulaatiota (AS, FA ja FS) eivät eroa merkittävästi tuulisuuden (kuva 11) ja pinnan kestävyyden (kuva 13a) suhteen.
CaCO3-päällystettyjen bakteerisolujen ja saostuneiden kiteiden bakteerijäljen visualisoimiseksi paremmin otettiin suurilla suurennoksilla varustettuja SEM-mikrokuvia, ja tulokset on esitetty kuvassa 15. Kuten kuvassa näkyy, kalsiumkarbonaatti saostuu bakteerisolujen pinnalle ja tarjoaa niihin saostumiseen tarvittavat tumat. Kuvassa on myös esitetty CaCO3:n indusoimat aktiiviset ja inaktiiviset sidokset. Voidaan päätellä, että inaktiivisten sidosten lisääntyminen ei välttämättä johda mekaanisen käyttäytymisen paranemiseen entisestään. Siksi CaCO3-saostumisen lisääntyminen ei välttämättä johda suurempaan mekaaniseen lujuuteen, ja saostumiskuviolla on tärkeä rooli. Tätä seikkaa on tutkittu myös Terzisin ja Lalouin72 sekä Soghin ja Al-Kabanin45,73 töissä. Saostumiskuvion ja mekaanisen lujuuden välisen suhteen tutkimiseksi tarkemmin suositellaan MICP-tutkimuksia µCT-kuvantamisen avulla, mikä ei kuulu tämän tutkimuksen piiriin (eli erilaisten kalsiumlähteen ja bakteerien yhdistelmien käyttöönotto ammoniakittoman MICP:n saamiseksi).
CaCO3 indusoi aktiivisia ja inaktiivisia sidoksia (a) AS-koostumuksella ja (b) FS-koostumuksella käsitellyissä näytteissä ja jätti bakteerisolujen jäljen sedimenttiin.
Kuten kuvissa 14j-o ja 15b on esitetty, kalvossa on CaCO3-kalvo (EDX-analyysin mukaan kunkin alkuaineen prosentuaalinen koostumus kalvossa on hiili 11 %, happi 46,62 % ja kalsium 42,39 %, mikä on hyvin lähellä kuvan 16 CaCO3-prosenttiosuutta). Tämä kalvo peittää vateriittikiteet ja maapartikkelit, mikä auttaa ylläpitämään maa-sedimenttijärjestelmän eheyttä. Tämän kalvon läsnäoloa havaittiin vain formiaattipohjaisella formulaatiolla käsitellyissä näytteissä.
Taulukossa 2 vertaillaan aiemmissa tutkimuksissa ja tässä tutkimuksessa ureaa hajottavilla ja ureaa hajottamattomilla MICP-reiteillä käsiteltyjen maaperien pintalujuutta, irtoamisen kynnysnopeutta ja bioindusoitua CaCO3-pitoisuutta. MICP-käsiteltyjen dyyninäytteiden tuulieroosiokestävyyttä koskevat tutkimukset ovat rajalliset. Meng ym. tutkivat MICP-käsiteltyjen ureaa hajottavien dyyninäytteiden tuulieroosiokestävyyttä lehtipuhaltimella,13 kun taas tässä tutkimuksessa ureaa hajottamattomia dyyninäytteitä (sekä ureaa hajottavia kontrollinäytteitä) testattiin tuulitunnelissa ja käsiteltiin neljällä eri bakteeri- ja aineyhdistelmällä.
Kuten voidaan nähdä, joissakin aiemmissa tutkimuksissa on tarkasteltu yli 4 l/m²:n käyttömääriä13,41,74. On syytä huomata, että suuria käyttömääriä ei välttämättä ole taloudellisesta näkökulmasta helppo soveltaa pellolla vedenjakeluun, kuljetukseen ja suurten vesimäärien levittämiseen liittyvien kustannusten vuoksi. Myös pienemmät käyttömäärät, kuten 1,62–2 l/m², saavuttivat melko hyvät pinnanlujuudet, jopa 190 kPa, ja yli 25 m/s TDV:n. Tässä tutkimuksessa formiaattipohjaisella MICP:llä ilman urean hajoamista käsitellyt dyynit saavuttivat korkeat pinnanlujuudet, jotka olivat verrattavissa urean hajoamisreitillä saatuihin lujuuksiin samalla käyttömääräalueella (ts. formiaattipohjaisella MICP:llä ilman urean hajoamista käsitellyt näytteet pystyivät myös saavuttamaan saman pinnanlujuusarvojen alueen kuin Meng et al., 13, kuva 13a raportoivat) suuremmilla käyttömäärillä. Voidaan myös nähdä, että 2 l/m2:n levitysmäärällä tuulieroosiota vähentävän kalsiumkarbonaatin saanto 25 m/s tuulennopeudella oli formiaattipohjaisella MICP:llä ilman urean hajoamista 2,25 %, mikä on hyvin lähellä vaadittua CaCO3-määrää (eli 2,41 %) verrattuna dyyneihin, joita käsiteltiin samalla levitysmäärällä ja samalla tuulennopeudella (25 m/s) kontrolli-MICP:llä, jossa oli urean hajoamista.
Tästä taulukosta voidaan siis päätellä, että sekä urean hajoamisreitti että ureaton hajoamisreitti voivat tarjota varsin hyväksyttävän suorituskyvyn pintakestävyyden ja TDV:n suhteen. Tärkein ero on, että ureaton hajoamisreitti ei sisällä ammoniakkia ja siksi sillä on pienemmät ympäristövaikutukset. Lisäksi tässä tutkimuksessa ehdotettu formiaattipohjainen MICP-menetelmä ilman urean hajoamista näyttää toimivan paremmin kuin asetaattipohjainen MICP-menetelmä ilman urean hajoamista. Vaikka Mohebbi ym. tutkivat asetaattipohjaista MICP-menetelmää ilman urean hajoamista, heidän tutkimuksessaan oli mukana tasaisilla pinnoilla olevia näytteitä9. Dyyninäytteiden ympärille muodostuvien pyörteiden ja siitä johtuvan leikkauksen aiheuttaman suuremman eroosioasteen ja alhaisemman TDV:n vuoksi dyyninäytteiden tuulieroosion odotetaan olevan selvempää kuin tasaisilla pinnoilla samalla nopeudella.