Erilaiset kasvinpuolustusteoriat tarjoavat tärkeää teoreettista ohjausta kasvien erikoistuneen aineenvaihdunnan mallien selittämiseen, mutta niiden keskeisiä ennusteita on vielä testattava. Tässä tutkimuksessa käytimme puolueetonta tandem-massaspektrometriaa (MS/MS) tutkiaksemme systemaattisesti tupakan heikennettyjen kantojen metabolomia yksittäisistä kasveista populaatioihin ja läheisesti sukua oleviin lajeihin, ja käsittelimme suuren määrän massaspektrometrisiä ominaisuusteorioita, jotka perustuvat informaatiossa oleviin yhdisteiden spektreihin. Kehys optimaalisen puolustuksen (OD) ja liikkuvan kohteen (MT) teorioiden keskeisten ennusteiden testaamiseksi. Kasvien metabolomiikan informaatiokomponentti on yhdenmukainen OD-teorian kanssa, mutta ristiriidassa MT-teorian pääennusteen kanssa kasvinsyöjien aiheuttamasta metabolomiikkadynamiikasta. Mikro- ja makrotason evolutiiviselta tasolta jasmonaattisignaali tunnistettiin OD:n pääasialliseksi määrääjäksi, kun taas etyleenisignaali tarjosi MS/MS-molekyyliverkon annotoiman kasvinsyöjäkohtaisen vasteen hienosäätöä.
Erilaiset rakenteensa omaavat erityiset metaboliitit ovat tärkeimpiä osallistujia kasvien sopeutumisessa ympäristöön, erityisesti vihollisten puolustautumisessa (1). Kasvien erityisen aineenvaihdunnan hämmästyttävä monimuotoistuminen on käynnistänyt vuosikymmeniä kestäneen perusteellisen tutkimuksen sen monista ekologisista toiminnoista ja muodostanut pitkän listan kasvinpuolustusteorioita, jotka käsittelevät kasvien ja hyönteisten vuorovaikutusten evolutiivista ja ekologista kehitystä. Empiirinen tutkimus tarjoaa tärkeää ohjausta (2). Nämä kasvinpuolustusteoriat eivät kuitenkaan seuranneet hypoteettisen deduktiivisen päättelyn normatiivista polkua, jossa keskeiset ennusteet olivat samalla analyysitasolla (3) ja testattiin kokeellisesti teoreettisen kehityksen seuraavan syklin edistämiseksi (4). Tekniset rajoitukset rajoittavat tiedonkeruun tiettyihin aineenvaihduntakategorioihin ja sulkevat pois erikoistuneiden aineenvaihduntatuotteiden kattavan analyysin, estäen siten teoreettisen kehityksen kannalta välttämättömät kategorioiden väliset vertailut (5). Kattavien metabolomiikkatietojen ja yhteisen valuutan puute aineenvaihduntatilan prosessointityönkulun vertailemiseksi eri kasviryhmien välillä haittaa alan tieteellistä kypsyyttä.
Tandemmassaspektrometrian (MS/MS) metabolomiikan uusimmat kehitysaskeleet pystyvät kattavasti kuvaamaan aineenvaihdunnan muutoksia tietyn järjestelmäkladin lajien sisällä ja niiden välillä, ja ne voidaan yhdistää laskennallisiin menetelmiin näiden monimutkaisten seosten rakenteellisen samankaltaisuuden laskemiseksi. Kemian ennakko-osaaminen (5). Edistyneiden analyysi- ja laskentateknologioiden yhdistelmä tarjoaa tarvittavan kehyksen monien aineenvaihdunnan monimuotoisuutta koskevien ekologisten ja evoluutioteorioiden ennusteiden pitkäaikaiselle testaamiselle. Shannon (6) esitteli informaatioteorian ensimmäistä kertaa uraauurtavassa artikkelissaan vuonna 1948, luoden perustan informaation matemaattiselle analyysille, jota on käytetty monilla muillakin aloilla kuin sen alkuperäisessä sovelluksessa. Genomiikassa informaatioteoriaa on sovellettu onnistuneesti sekvenssikonservatiivisen informaation kvantifiointiin (7). Transkriptomiikkatutkimuksessa informaatioteoria analysoi transkriptomin kokonaismuutoksia (8). Aiemmassa tutkimuksessa sovelsimme informaatioteorian tilastollista viitekehystä metabolomiikkaan kuvaamaan kasvien kudostason aineenvaihdunnallista asiantuntemusta (9). Tässä yhdistämme MS/MS-pohjaisen työnkulun informaatioteorian tilastolliseen viitekehykseen, jolle on ominaista yhteisen valuutan metabolinen monimuotoisuus, verrataksemme kasvinsuojeluteorian keskeisiä ennusteita kasvinsyöjien indusoimasta metabolomista.
Kasvinpuolustuksen teoreettiset viitekehykset ovat yleensä toisensa kattavia ja ne voidaan jakaa kahteen luokkaan: ne, jotka yrittävät selittää kasvikohtaisten metaboliittien jakautumista puolustustoimintojen perusteella, kuten optimaalisen puolustuksen (OD) (10), liikkuvan kohteen (MT) (11) ja ulkonäön (12) teoria, kun taas toiset etsivät mekaanisia selityksiä sille, miten resurssien saatavuuden muutokset vaikuttavat kasvien kasvuun ja erikoistuneiden metaboliittien, kuten hiilen, kertymiseen: ravinnetasapainohypoteesi (13), kasvunopeushypoteesi (14) ja kasvu- ja erilaistumistasapainohypoteesi (15). Nämä kaksi teoriajoukkoa ovat analyysin eri tasoilla (4). Kaksi toiminnallisen tason puolustustoimintoja koskevaa teoriaa hallitsee kuitenkin keskustelua kasvien konstitutiivisesta ja indusoitavasta puolustuksesta: OD-teoria, joka olettaa, että kasvit investoivat kalliisiin kemiallisiin puolustuksiinsa vain tarvittaessa, esimerkiksi silloin, kun niitä nautitaan. Kun ruohoeläin hyökkää, puolustustoimintoa omaava yhdiste määrätään tulevan hyökkäyksen mahdollisuuden mukaan (10); MT-hypoteesi esittää, että aineenvaihduntatuotteiden suuntaavalla muutosakselilla ei ole akselia, vaan aineenvaihduntatuotteet muuttuvat satunnaisesti, mikä luo mahdollisuuden estää hyökkäävien kasvinsyöjien aineenvaihdunnan "liikekohteen". Toisin sanoen nämä kaksi teoriaa tekevät vastakkaisia ​​ennusteita kasvinsyöjien hyökkäyksen jälkeisestä aineenvaihdunnan uudelleenmuodostuksesta: puolustavan toiminnan omaavien aineenvaihduntatuotteiden (OD) yksisuuntaisen kertymisen ja suuntaamattomien aineenvaihduntamuutosten (MT) välisestä suhteesta (11).
OD- ja MT-hypoteesit eivät käsittele ainoastaan ​​metabolomissa indusoituja muutoksia, vaan myös näiden metaboliittien kertymisen ekologisia ja evolutiivisia seurauksia, kuten näiden metabolisten muutosten sopeutumiskustannuksia ja -hyödyjä tietyssä ekologisessa ympäristössä (16). Vaikka molemmat hypoteesit tunnustavat erikoistuneiden metaboliittien puolustusfunktion, joka voi olla kallista tai ei, OD- ja MT-hypoteesien keskeinen erottava ennuste on indusoitujen metabolisten muutosten suunta. OD-teorian ennustaminen on saanut tähän mennessä eniten kokeellista huomiota. Näihin testeihin kuuluu tiettyjen yhdisteiden eri kudosten suorien tai epäsuorien puolustusfunktioiden tutkiminen kasvihuoneissa ja luonnollisissa olosuhteissa sekä kasvien kehitysvaiheen muutokset (17-19). Toistaiseksi kuitenkin puuttuu työnkulku ja tilastollinen viitekehys minkä tahansa organismin metabolisen monimuotoisuuden kattavaan analyysiin, joten näiden kahden teorian välinen tärkein eroennuste (eli metabolisten muutosten suunta) on vielä testaamatta. Tässä tarjoamme tällaisen analyysin.
Yksi kasvispesifisten metaboliittien merkittävimmistä ominaisuuksista on niiden äärimmäinen rakenteellinen monimuotoisuus kaikilla tasoilla yksittäisistä kasveista, populaatioista samankaltaisiin lajeihin (20). Populaatiotasolla voidaan havaita monia määrällisiä muutoksia erikoistuneissa metaboliiteissa, kun taas lajitasolla säilyy yleensä voimakkaita laadullisia eroja (20). Siksi kasvien aineenvaihdunnan monimuotoisuus on toiminnallisen monimuotoisuuden tärkein osa-alue, joka heijastaa sopeutumiskykyä erilaisiin markkinarakoihin, erityisesti niihin markkinarakoihin, joilla on erilaiset invaasiot erityisillä hyönteisillä ja yleisillä kasvinsyöjillä (21). Fraenkelin (22) uraauurtavan artikkelin kasvispesifisten metaboliittien olemassaolon syistä jälkeen vuorovaikutuksia eri hyönteisten kanssa on pidetty tärkeinä valintapaineina, ja näiden vuorovaikutusten uskotaan muokanneen kasveja evoluution aikana. Aineenvaihduntareitti (23). Lajien väliset erot erikoistuneiden metaboliittien monimuotoisuudessa voivat myös heijastaa fysiologista tasapainoa, joka liittyy kasvien konstitutiiviseen ja indusoituvaan puolustukseen kasvinsyöjästrategioita vastaan, koska nämä kaksi lajia korreloivat usein negatiivisesti keskenään (24). Vaikka hyvän puolustuskyvyn ylläpitäminen jatkuvasti voi olla hyödyllistä, puolustukseen liittyvät oikea-aikaiset aineenvaihdunnan muutokset tarjoavat selkeitä etuja, koska ne mahdollistavat kasvien kohdentaa arvokkaita resursseja muihin fysiologisiin investointeihin (19, 24) ja välttävät symbioosin tarpeen. Sivuvahingot (25). Lisäksi nämä hyönteiskasvinsyöjien aiheuttamat erikoistuneiden aineenvaihduntatuotteiden uudelleenjärjestelyt voivat johtaa tuhoisaan jakautumiseen populaatiossa (26) ja heijastaa suoria lukemia jasmonihapposignaalin (JA) huomattavista luonnollisista muutoksista, jotka voivat säilyä populaatiossa. Korkeat ja matalat JA-signaalit ovat kompromisseja kasvinsyöjiä vastaan ​​​​puolustuksen ja tiettyjen lajien kanssa kilpailun välillä (27). Lisäksi erikoistuneet aineenvaihduntatuotteiden biosynteesireitit häviävät ja muuttuvat nopeasti evoluution aikana, mikä johtaa epätasaiseen aineenvaihdunnan jakautumiseen läheisesti sukua olevien lajien kesken (28). Nämä polymorfismit voivat muodostua nopeasti vastauksena muuttuviin kasvinsyöjämallien muutoksiin (29), mikä tarkoittaa, että kasvinsyöjäyhteisöjen vaihtelu on keskeinen tekijä aineenvaihdunnan heterogeenisyydessä.
Tässä työssä ratkaisimme erityisesti seuraavat ongelmat. (I) Miten kasvinsyöjähyönteinen uudelleenkonfiguroi kasvin metabolomia? (Ii) Mitkä ovat metabolisen plastisuuden tärkeimmät informaatiokomponentit, joita voidaan kvantifioida pitkän aikavälin puolustusteorian ennusteiden testaamiseksi? (Iii) Pitäisikö kasvin metabolomi uudelleenohjelmoida hyökkääjälle ainutlaatuisella tavalla, ja jos pitäisi, niin mikä rooli kasvihormonilla on tietyn metabolisen vasteen räätälöimisessä, ja mitkä metaboliitit vaikuttavat puolustuksen lajispesifisyyteen? (Iv) Koska monien puolustusteorioiden ennusteita voidaan laajentaa kaikille biologisten kudosten tasoille, kysyimme, kuinka johdonmukainen metabolinen vaste on sisäisestä vertailusta lajien väliseen vertailuun? Tätä varten olemme systemaattisesti tutkineet tupakkanikotiinin lehtimetabolomia. Tupakka on ekologinen mallikasvi, jolla on rikas erikoistunut aineenvaihdunta ja joka tehoaa kahden alkuperäisen kasvinsyöjän, Lepidoptera Datura (Ms) (erittäin aggressiivinen, pääasiassa syödään), toukkiin. Solanaceae- ja Spodoptera littoralis (Sl) -kasveilla puuvillanlehtimadot ovat eräänlainen "suku", jonka isäntäkasveja ovat Solanaceae-suku ja muut isännät muista sukuista ja heimoista (Kasvien ravinto). Jäsensimme MS/MS-metabolomiikkaspektrin ja otimme informaatioteorian tilastolliset kuvaajat vertaillaksemme OD- ja MT-teorioita. Loimme spesifisyyskarttoja keskeisten metaboliittien identiteetin paljastamiseksi. Analyysi laajennettiin N. nasi -lajin alkuperäiseen populaatioon ja läheisiin sukuihin kuuluviin tupakkalajeihin, jotta voisimme analysoida tarkemmin kasvihormonisignaloinnin ja OD-induktion välistä kovarianssia.
Saadaksemme kokonaiskuvan kasvissyöjätupakan lehtimetabolomin plastisuudesta ja rakenteesta, käytimme aiemmin kehitettyä analyysi- ja laskentaprosessia kerätäksemme ja dekonvoluutioidaksemme kattavasti korkean resoluution datasta riippumattomia MS/MS-spektrejä kasviuutteista (9). Tämä erottamaton menetelmä (MS/MS) voi rakentaa ei-redundantteja yhdistespektrejä, joita voidaan sitten käyttää kaikkiin tässä kuvattuihin yhdistetason analyyseihin. Nämä dekonvoluutiot kasvimetaboliitit ovat erityyppisiä ja koostuvat sadoista tuhansiin metaboliitteihin (tässä noin 500–1000 s/MS/MS). Tässä tarkastelemme metabolista plastisuutta informaatioteorian kehyksessä ja kvantifioimme metabolomin monimuotoisuuden ja ammattimaisuuden metabolisen frekvenssijakauman Shannonin entropian perusteella. Käyttämällä aiemmin toteutettua kaavaa (8) laskimme joukon indikaattoreita, joita voidaan käyttää metabolomin monimuotoisuuden (Hj-indikaattori), metaboliaprofiilin erikoistumisen (δj-indikaattori) ja yksittäisen metaboliitin metabolisen spesifisyyden (Si-indikaattori) kvantifiointiin. Lisäksi käytimme suhteellisen etäisyyden plastisuusindeksiä (RDPI) kasvinsyöjien metabolomien indusoituvuuden kvantifiointiin (kuva 1A) (30). Tässä tilastollisessa viitekehyksessä käsittelemme MS/MS-spektriä perustietoyksikkönä ja käsittelemme MS/MS-spektrin suhteellisen runsauden frekvenssijakaumakartaksi ja käytämme sitten Shannonin entropiaa metabolomien monimuotoisuuden arvioimiseen sen perusteella. Metabolomien erikoistuminen mitataan yksittäisen MS/MS-spektrin keskimääräisellä spesifisyydellä. Näin ollen joidenkin MS/MS-luokkien runsauden kasvu kasvinsyöjäinduktion jälkeen muuttuu spektraaliseksi indusoituvuudeksi, RDPI:ksi ja erikoistumiseksi, eli δj-indeksin kasvuksi, koska tuotetaan enemmän erikoistuneita metaboliitteja ja tuotetaan korkea Si-indeksi. Hj-diversiteetti-indeksin lasku heijastaa joko tuotettujen MS/MS-spektrien määrän vähenemistä tai profiilifrekvenssijakauman muutosta epätasaisempaan suuntaan samalla, kun sen yleinen epävarmuus pienenee. Si-indeksilaskelman avulla on mahdollista korostaa, mitkä MS/MS-taudit ovat tiettyjen kasvinsyöjien indusoimia ja mitkä MS/MS-taudit eivät reagoi induktioon. Tämä on keskeinen indikaattori MT- ja OD-ennusteiden erottamiseksi toisistaan.
(A) Kasvinsyöjälajien (H1-Hx) MS/MS-datan indusoituvuuden (RDPI), monimuotoisuuden (Hj-indeksi), erikoistumisen (δj-indeksi) ja metaboliittispesifisyyden (Si-indeksi) tilastolliset kuvaajat. Erikoistumisasteen (δj) kasvu osoittaa, että keskimäärin tuotetaan enemmän kasvinsyöjälajeille spesifisiä metaboliitteja, kun taas monimuotoisuuden (Hj) lasku osoittaa metaboliittien tuotannon vähenemistä tai metaboliittien epätasaista jakautumista jakautumiskartalla. Si-arvo arvioi, onko metaboliitti spesifinen tietylle olosuhteelle (tässä kasvinsyöjälaji) vai pysyykö se päinvastoin samalla tasolla. (B) Puolustusteorian ennustamisen käsitteellinen kaavio informaatioteorian akselia käyttäen. OD-teoria ennustaa, että kasvinsyöjän hyökkäys lisää puolustusmetaboliitteja, mikä lisää δj:tä. Samaan aikaan Hj pienenee, koska profiili järjestyy uudelleen kohti metaboliatiedon epävarmuuden vähenemistä. MT-teoria ennustaa, että kasvinsyöjien hyökkäys aiheuttaa suuntaamattomia muutoksia metabolomissa, mikä lisää Hj:tä metaboliatiedon epävarmuuden lisääntymisen indikaattorina ja aiheuttaa Si:n satunnaisen jakauman. Esitimme myös sekamallin, parhaan MT:n, jossa joidenkin korkeampien puolustusarvojen omaavien metaboliittien määrä kasvaa erityisesti (korkea Si-arvo), kun taas toiset reagoivat satunnaisesti (alhaisempi Si-arvo).
Käyttämällä informaatioteorian kuvaajia tulkitsemme OD-teoriaa ennustaaksemme, että kasvinsyöjien aiheuttamat erityisten metaboliittien muutokset indusoimattomassa konstitutiivisessa tilassa johtavat (i) metabolisen spesifisyyden (Si-indeksi) kasvuun, mikä puolestaan ​​lisää metabonomista spesifisyyttä (δj-indeksi) (tiettyjen erityisten metaboliittiryhmien, joilla on korkeampi puolustusarvo, lisääntymiseen), ja (ii) metabolomidiversiteetin (Hj-indeksi) vähenemiseen johtuen metabolisen frekvenssijakauman muutoksesta kohti leptiinikehon jakaumaa. Yksittäisen metaboliitin tasolla odotetaan järjestettyä Si-jakaumaa, jossa metaboliitti kasvattaa Si-arvoa puolustusarvonsa mukaisesti (kuva 1B). Tämän mukaisesti selitämme MT-teorian ennustaaksemme, että viritys johtaa (i) metaboliittien suuntaamattomiin muutoksiin, jotka johtavat δj-indeksin laskuun, ja (ii) Hj-indeksin nousuun metabolisen epävarmuuden lisääntymisen vuoksi. Tai satunnaisuuteen, joka voidaan kvantifioida Shannonin entropialla yleistetyn monimuotoisuuden muodossa. Metabolisen koostumuksen osalta MT-teoria ennustaa Si:n satunnaisen jakauman. Ottaen huomioon, että tietyt metaboliitit esiintyvät tietyissä olosuhteissa tietyissä olosuhteissa ja toiset eivät, ja niiden puolustusarvo riippuu ympäristöstä, ehdotimme myös sekapuolustusmallia, jossa δj ja Hj jakautuvat kahteen osaan Si-kasvun suuntaisesti kaikkiin suuntiin. Vain tietyt metaboliittiryhmät, joilla on korkeammat puolustusarvot, lisäävät Si-pitoisuutta erityisesti, kun taas toisilla on satunnainen jakauma (kuva 1B).
Testataksemme uudelleenmääritellyn puolustusteorian ennustetta informaatioteorian kuvaajan akselilla, kasvatimme Nepenthes pallens -kasvin lehdillä asiantuntija- (Ms) tai generalistisia (Sl) kasvinsyöjätoukkia (kuva 2A). MS/MS-analyysin avulla saimme 599 ei-redundanttia MS/MS-spektriä (datatiedosto S1) toukkien ruokailun jälkeen kerätyn lehtikudoksen metanoliuutteista. RDPI-, Hj- ja δj-indeksien käyttö MS/MS-konfiguraatiotiedostojen informaatiosisällön uudelleenkonfiguraation visualisointiin paljastaa mielenkiintoisia malleja (kuva 2B). Yleinen trendi on, kuten informaatiodeskriptori kuvaa, että toukkien jatkaessa lehtien syömistä, kaiken aineenvaihdunnan uudelleenjärjestelyn aste kasvaa ajan myötä: 72 tuntia kasvinsyöjän syömisen jälkeen RDPI kasvaa merkittävästi. Verrattuna vahingoittumattomaan kontrolliin Hj pieneni merkittävästi, mikä johtui aineenvaihduntaprofiilin lisääntyneestä erikoistumisasteesta, joka kvantifioitiin δj-indeksillä. Tämä ilmeinen trendi on yhdenmukainen OD-teorian ennusteiden kanssa, mutta ristiriidassa MT-teorian pääennusteiden kanssa, joiden mukaan satunnaisia ​​(ei-suuntautuneita) muutoksia metaboliittitasoissa käytetään puolustavana naamiointina (kuva 1B). Vaikka näiden kahden kasvinsyöjän oraalisen erityksen (OS) elisiittoripitoisuus ja ruokailukäyttäytyminen eroavat toisistaan, niiden suora syöminen johti samanlaisiin muutoksiin Hj:n ja δj:n suussa 24 ja 72 tunnin sadonkorjuujaksojen aikana. Ainoa ero ilmeni 72 tunnin RDPI:n kohdalla. Verrattuna Ms-ruokinnan aiheuttamaan metaboliaan, Sl-ruokinnan aiheuttama kokonaismetabolia oli korkeampi.
(A) Koeasetelma: tavallisia sikoja (S1) tai asiantuntijakasvinsyöjiä (Ms) ruokitaan suolattomilla kannukkakasvien lehdillä, kun taas simuloidussa kasvinsyöjälajissa Ms:n (W + OSM) OS:ää käytetään standardoitujen lehtipaikkojen puhkaisemiseen. S1 (W + OSSl) toukat tai vesi (W + W). Kontrolli (C) on vahingoittumaton lehti. (B) Indusoituvuus (RDPI verrattuna kontrollikarttaan), monimuotoisuus (Hj-indeksi) ja erikoistumisindeksi (δj-indeksi) laskettu erityiselle metaboliittikartalle (599 MS/MS; datatiedosto S1). Asteriskit osoittavat merkittäviä eroja suoran kasvinsyöjäruokinnan ja kontrolliryhmän välillä (Studentin t-testi parittaisella t-testillä, *P<0,05 ja ***P<0,001). ns, ei tärkeä. (C) Päämetaboliitin (sininen laatikko, aminohappo, orgaaninen happo ja sokeri; datatiedosto S2) ja erityisen metaboliitin spektrin (punainen laatikko 443 MS/MS; datatiedosto S1) aikaresoluutioindeksi simuloidun kasvinsyöjäkäsittelyn jälkeen. Värillinen vyöhyke viittaa 95 %:n luottamusväliin. Tähti osoittaa merkitsevän eron käsittelyn ja kontrollin välillä [neliöllinen varianssianalyysi (ANOVA), jota seuraa Tukeyn rehellisesti merkitsevä ero (HSD) post hoc -monivertailuissa, *P<0,05, **P<0,01 ja *** P <0,001]. (D) Hajontakaavioiden ja erityisten metaboliittiprofiilien erikoistuminen (toistetut näytteet eri käsittelyillä).
Selvittääksemme, heijastuuko kasvinsyöjien aiheuttama metabolomitason uudelleenmuokkaus yksittäisten metaboliittien tason muutoksissa, keskityimme ensin aiemmin tutkittuihin metaboliitteihin Nepenthes pallens -lehdissä, joilla on todistettu kasvinsyöjäresistenssi. Fenoliamidit ovat hydroksikinnamamidi-polyamiinikonjugaatteja, jotka kertyvät hyönteisten kasvinsyöjäprosessin aikana ja joiden tiedetään heikentävän hyönteisten suorituskykyä (32). Etsimme vastaavien MS/MS-menetelmien esiasteita ja piirsimme niiden kumulatiiviset kineettiset käyrät (kuva S1). Ei ole yllättävää, että fenolijohdannaiset, jotka eivät ole suoraan mukana kasvinsyöjiä vastaan ​​​​suojautumisessa, kuten klorogeenihappo (CGA) ja rutiini, vähenevät kasvinsyöjän jälkeen. Sitä vastoin kasvinsyöjät voivat tehdä fenoliamideista erittäin voimakkaita. Kahden kasvinsyöjän jatkuva syöminen johti lähes samaan fenoliamidien viritysspektriin, ja tämä kuvio oli erityisen ilmeinen fenoliamidien de novo -synteesissä. Sama ilmiö havaitaan tutkittaessa 17-hydroksigeranyyli-nonanedioli-diterpeeniglykosidien (17-HGL-DTG) ekspressioreittiä, joka tuottaa suuren määrän asyklisiä diterpeenejä, joilla on tehokkaita kasvinsyöjiä torjuvia toimintoja (33). Näistä Ms-proteiinin syöttäminen Sl-proteiinilla laukaisi samanlaisen ilmentymisprofiilin (kuva S1).
Suorien kasvinsyöjäruokintakokeiden mahdollinen haittapuoli on kasvinsyöjien lehtien kulutusnopeuden ja ruokailuajan ero, mikä vaikeuttaa haavojen ja kasvinsyöjien aiheuttamien kasvinsyöjäkohtaisten vaikutusten eliminointia. Jotta voitaisiin paremmin ratkaista indusoidun lehtimetaboliavaiteen kasvinsyöjälajikohtainen spesifisyys, simuloimme Ms- ja Sl-toukkien ruokailua levittämällä välittömästi tuoreeltaan kerättyä OS:ää (OSM ja OSS1) standardipunktioon W yhdenmukaisissa lehtipaikoissa. Tätä menetelmää kutsutaan W + OS -käsittelyksi, ja se standardoi induktion ajoittamalla tarkasti kasvinsyöjän aiheuttaman vasteen alkamisen aiheuttamatta sekoittavia vaikutuksia kudoskadon nopeuden tai määrän eroista (kuva 2A) (34). Käyttämällä MS/MS-analyysi- ja laskentaputkea saimme 443 MS/MS-spektriä (datatiedosto S1), jotka olivat päällekkäisiä aiemmin suorista ruokintakokeista koottujen spektrien kanssa. Tämän MS/MS-datajoukon informaatioteoria-analyysi osoitti, että lehtiin erikoistuneiden metabolomien uudelleenohjelmointi simuloimalla kasvinsyöjiä osoitti OS-kohtaisia ​​indusointeja (kuva 2C). Erityisesti OSM lisäsi metabolomi-erikoistumista 4 tunnissa verrattuna OSS1-käsittelyyn. On syytä huomata, että verrattuna suoraan kasvinsyöjien ruokintaan liittyvään kokeelliseen datajoukkoon, kaksiulotteisessa avaruudessa Hj:n ja δj:n koordinaatteina visualisoitu metabolomi-kinetiikka ja metabolomi-erikoistumisen suunta simuloidun kasvinsyöjäkäsittelyn vasteena ajan kuluessa kasvoivat johdonmukaisesti (kuva 2D). Samanaikaisesti kvantifioimme aminohappojen, orgaanisten happojen ja sokereiden pitoisuudet (datatiedosto S2) tutkiaksemme, johtuuko tämä kohdennettu metabolomi-asiantuntemuksen lisääntyminen keskeisen hiiliaineenvaihdunnan uudelleenkonfiguraatiosta simuloitujen kasvinsyöjien vasteena (kuva S2). Selvittääksemme tätä kuviota paremmin seurasimme edelleen aiemmin käsiteltyjen fenoliamidi- ja 17-HGL-DTG-reittien metabolista kertymiskinetiikkaa. Kasvinsyöjien OS-spesifinen induktio muuttuu fenoliamidiaineenvaihdunnan differentiaaliseksi uudelleenjärjestymiskuvioksi (kuva S3). OSS1 indusoi ensisijaisesti kumariini- ja kofeoyyliryhmiä sisältäviä fenoliamideja, kun taas OSM:t laukaisevat spesifisen ferulyylikonjugaattien induktion. 17-HGL-DTG-reitillä havaittiin erilainen OS:n induktio alavirran malonylaatio- ja dimalonylaatiotuotteiden kautta (kuva S3).
Seuraavaksi tutkimme OS:n indusoimaa transkriptomin plastisuutta käyttämällä aikakulumikrosiruaineistoa, joka simuloi OSM:ien käyttöä ruusukekasvien lehtien käsittelyssä kasvinsyöjillä. Näytteenottokinetiikka on pohjimmiltaan päällekkäinen tässä metabolomiikkatutkimuksessa käytetyn kinetiikan kanssa (35). Verrattuna metabolomikonkonfiguraatioon, jossa metabolinen plastisuus lisääntyy erityisesti ajan myötä, havaitsemme Ms:n indusoimia ohimeneviä transkriptiopurskeita lehdissä, joissa transkriptomin indusoituvuus (RDPI) ja erikoistuminen (δj) ovat 1. Tuntien ja monimuotoisuuden (Hj) määrässä havaittiin merkittävä kasvu tässä ajankohtana, BMP1:n ilmentyminen väheni merkittävästi, minkä jälkeen transkriptomin erikoistuminen väheni (kuva S4). Metaboliset geeniperheet (kuten P450, glykosyylitransferaasi ja BAHD-asyylitransferaasi) osallistuvat erityisten metaboliittien kokoamisprosessiin primaarisesta aineenvaihdunnasta peräisin olevista rakenneyksiköistä edellä mainitun varhaisen korkean erikoistumisen mallin mukaisesti. Tapaustutkimuksena analysoitiin fenyylialaniinin reittiä. Analyysi vahvisti, että fenoliamidimetabolian ydingeenit ovat kasvinsyöjillä voimakkaasti OS-indusoituja verrattuna houkuttelemattomiin kasveihin, ja niiden ilmentymismallit ovat läheisesti samankaltaisia. Transkriptiotekijä MYB8 ja rakennegeenit PAL1, PAL2, C4H ja 4CL tämän reitin ylävirtaan osoittivat transkription varhaista alkamista. Asyylitransferaasit, joilla on rooli fenoliamidin lopullisessa kokoonpanossa, kuten AT1, DH29 ja CV86, osoittavat pitkittynyttä ylössäätelymallia (kuva S4). Yllä olevat havainnot osoittavat, että transkriptomin erikoistumisen varhainen alkaminen ja metabolomiikan erikoistumisen myöhempi tehostuminen ovat kytkeytyneitä, mikä voi johtua synkronisesta säätelyjärjestelmästä, joka käynnistää voimakkaan puolustusvasteen.
Kasvihormonien signaloinnin uudelleenkonfiguraatio toimii säätelykerroksena, joka integroi kasvinsyöjäinformaatiota kasvien fysiologian uudelleenohjelmoimiseksi. Kasvinsyöjäsimulaation jälkeen mittasimme keskeisten kasvihormonien luokkien kumulatiivista dynamiikkaa ja visualisoimme niiden välisen ajallisen koekspression [Pearsonin korrelaatiokerroin (PCC) > 0,4] (kuva 3A). Kuten odotettua, biosynteesiin liittyvät kasvihormonit ovat yhteydessä kasvihormonien koekspressioverkostoon. Lisäksi metabolinen spesifisyys (Si-indeksi) on kartoitettu tähän verkostoon korostamaan eri käsittelyjen indusoimia kasvihormoneja. Kasvinsyöjäspesifisen vasteen kaksi pääaluetta on piirretty: toinen on JA-klusterissa, jossa JA (sen biologisesti aktiivinen muoto JA-Ile) ja muut JA-johdannaiset osoittavat korkeimman Si-pistemäärän; toinen on etyleeni (ET). Gibberelliini osoitti vain kohtalaista kasvua kasvinsyöjäspesifisyydessä, kun taas muilla kasvihormoneilla, kuten sytokiniinilla, auksiinilla ja abskissihapolla, oli alhainen induktiospesifisyys kasvinsyöjille. Verrattuna pelkän W + W -yhdisteen käyttöön, JA-johdannaisten huippuarvon monistuminen OS-sovelluksen (W + OS) kautta voidaan periaatteessa muuntaa vahvaksi spesifiseksi JA-indikaattoriksi. Yllättäen eri elisiittoripitoisuuksilla varustettujen OSM:n ja OSS1:n tiedetään aiheuttavan samanlaista JA:n ja JA-Ile:n kertymistä. Toisin kuin OSS1, OSM:t indusoivat OSM:n spesifisesti ja voimakkaasti, kun taas OSS1 ei monista basaalihaavojen vastetta (kuva 3B).
(A) Kasvinsyöjien indusoiman kasvihormonin kertymiskinetiikan simulaatioon perustuva koekspressioverkostoanalyysi, joka perustuu PCC-laskentaan. Solmu edustaa yhtä kasvihormonia, ja solmun koko edustaa kasvihormonille spesifistä Si-indeksiä käsittelyjen välillä. (B) Eri käsittelyjen aiheuttama JA:n, JA-Ile:n ja ET:n kertyminen lehdissä eri väreillä merkittynä: aprikoosi, W + OSM; sininen, W + OSSl; musta, W + W; harmaa, C (kontrolli). Asteriskit osoittavat merkittäviä eroja käsittelyn ja kontrollin välillä (kaksisuuntainen ANOVA, jota seurasi Tukey HSD post hoc -monivertailu, *** P <0,001). Informaatioteorian analyysi (C)697 MS/MS:stä (datatiedosto S1) JA-biosynteesissä ja heikentyneessä havaintospektrissä (irAOC ja irCOI1) ja (D)585 MS/MS:stä (datatiedosto S1) ETR1:ssä heikentyneellä ET-signaalilla. Kaksi simuloitua kasvinsyöjäkäsittelyä laukaisi kasvilinjoja ja tyhjiä vehikkeli-kontrollikasveja (EV). Asteriskit osoittavat merkittäviä eroja W+OS-käsittelyn ja vahingoittumattoman kontrollin välillä (kaksisuuntainen ANOVA, jota seurasi Tukey HSD post hoc -monivertailu, *P<0,05, **P<0,01 ja ***P<0,001). (E) Hajontakaaviot hajaantuneesta erikoistumisen vastustuksesta. Värit edustavat eri geneettisesti muunnettuja kantoja; symbolit edustavat eri käsittelymenetelmiä: kolmio, W + OSS1; suorakulmio, W + OSM; ympyrä C
Seuraavaksi käytämme geneettisesti muunnettua heikennettyä Nepenthes-kantaa (irCOI1 ja sETR1) JA- ja ET-biosynteesin (irAOC ja irACO) ja havainnoinnin (irCOI1 ja sETR1) avainvaiheissa analysoidaksemme näiden kahden kasvihormonin metaboliaa kasvinsyöjillä. Uudelleenohjelmoinnin suhteellinen osuus. Aiempien kokeiden mukaisesti vahvistimme kasvinsyöjä-OS:n induktion tyhjissä kantajakasveissa (EV) (kuva 3, C-D) ja OSM:n aiheuttaman Hj-indeksin kokonaislaskun, kun taas δj-indeksi kasvoi. Vaste on voimakkaampi kuin OSS1:n laukaisema vaste. Kaksisuorainen kuvaaja, jossa Hj ja δj ovat koordinaatteja, näyttää spesifisen säätelyn purkautumisen (kuva 3E). Selvin trendi on, että kannoissa, joilta puuttuu JA-signaali, kasvinsyöjien aiheuttamat metabolomidiversiteetti- ja erikoistumismuutokset eliminoituvat lähes kokonaan (kuva 3C). Sitä vastoin hiljainen ET-havaitseminen sETR1-kasveissa vaimentaa Hj- ja δj-indeksien eroa OSM- ja OSS1-viritysten välillä, vaikka sen kokonaisvaikutus kasvinsyöjäaineenvaihdunnan muutoksiin on paljon pienempi kuin JA-signaloinnin, mutta se vaimentaa Hj- ja δj-indeksien eroa OSM- ja OSS1-viritysten välillä (kuva 3D ja kuva S5). Tämä osoittaa, että JA-signaalitransduktion ydintoiminnon lisäksi ET-signaalitransduktio toimii myös kasvinsyöjien lajikohtaisen aineenvaihduntavasteen hienosäätönä. Tämän hienosäätöfunktion mukaisesti sETR1-kasvien metabolomien indusoituvuudessa ei havaittu muutosta. Toisaalta irACO-kasvit indusoivat kasvinsyöjien aiheuttamia aineenvaihduntamuutoksia samankaltaisilla kokonaisamplitudeilla kuin sETR1-kasvit, mutta niillä oli merkittävästi erilaiset Hj- ja δj-pisteet OSM- ja OSS1-altistusten välillä (kuva S5).
Kasvinsyöjien lajispesifiseen vasteeseen tärkeän erikoistuneiden metaboliittien tunnistamiseksi ja niiden tuotannon hienosäätämiseksi ET-signaalien avulla käytimme aiemmin kehitettyä rakenteellista MS/MS-menetelmää. Tämä menetelmä perustuu kaksoisklusterointimenetelmään metaboliaperheen uudelleenpäättelemiseksi MS/MS-fragmenteista [normalisoitu pistetulo (NDP)] ja neutraalihäviöön (NL) perustuvasta samankaltaisuuspisteytyksestä. ET-transgeenisten linjojen analyysin avulla konstruoitu MS/MS-datajoukko tuotti 585 MS/MS:ää (datatiedosto S1), jotka eroteltiin klusteroimalla ne seitsemään pää-MS/MS-moduuliin (M) (kuva 4A). Jotkut näistä moduuleista ovat tiheästi pakattuja aiemmin karakterisoitujen erityismetaboliittien kanssa: esimerkiksi M1, M2, M3, M4 ja M7 ovat runsaasti erilaisia ​​fenolijohdannaisia ​​(M1), flavonoidiglykosideja (M2), asyylisokereita (M3 ja M4) ja 17-HGL-DTG:tä (M7). Lisäksi kussakin moduulissa lasketaan yksittäisen metaboliitin metabolinen spesifinen informaatio (Si-indeksi), ja sen Si-jakauma on intuitiivisesti nähtävissä. Lyhyesti sanottuna korkeaa kasvinsyöjä- ja genotyyppispesifisyyttä osoittaville MS/MS-spektreille on ominaista korkeat Si-arvot, ja kurtoosi-tilastot osoittavat karvan jakautumisen oikeassa hännänkulmassa. Yksi tällainen laiha kolloidijakauma havaittiin M1:ssä, jossa fenoliamidilla oli korkein Si-fraktio (kuva 4B). Aiemmin mainittu kasvinsyöjällä indusoituva 17-HGL-DTG M7:ssä osoitti kohtalaista Si-pistettä, mikä viittaa kohtalaiseen erilaiseen säätelyyn kahden OS-tyypin välillä. Sitä vastoin useimmat konstitutiivisesti tuotetut erikoistuneet metaboliitit, kuten rutiini, CGA ja asyylisokerit, ovat alhaisimpien Si-pisteiden joukossa. Jotta erityismetaboliittien rakenteellista monimutkaisuutta ja Si-jakaumaa voitaisiin tutkia paremmin, jokaiselle moduulille rakennettiin molekyyliverkosto (kuva 4B). Tärkeä OD-teorian ennuste (yhteenveto kuvassa 1B) on, että tiettyjen metaboliittien uudelleenjärjestäytymisen kasvinsyöjähyönteisten jälkeen pitäisi johtaa yksisuuntaisiin muutoksiin korkean puolustusarvon omaavissa metaboliiteissa, erityisesti lisäämällä niiden spesifisyyttä (toisin kuin satunnaisjakauma) (Mode) MT-teorian ennustama puolustava metaboliitti. Suurin osa M1:een kertyneistä fenolijohdannaisista liittyy toiminnallisesti hyönteisten suorituskyvyn laskuun (32). Kun verrattiin M1-metaboliittien Si-arvoja indusoitujen lehtien ja EV-kontrollikasvien lehtien välillä 24 tunnin kohdalla, havaitsimme, että monien metaboliittien metabolinen spesifisyys kasvinsyöjähyönteisten jälkeen on merkittävästi kasvava trendi (kuva 4C). Si-arvon spesifinen nousu havaittiin vain puolustavissa fenoliamideissa, mutta Si-arvon nousua ei havaittu muissa fenoleissa ja tuntemattomissa metaboliiteissa, joita esiintyi samanaikaisesti tässä moduulissa. Tämä on erikoistunut malli, joka liittyy OD-teoriaan. Kasvinsyöjien aiheuttamien metabolisten muutosten pääennusteet ovat johdonmukaisia. Jotta voisimme testata, johtuiko OS-spesifinen ET tästä fenoliamidispektrin erityispiirteestä, piirsimme metaboliitin Si-indeksin ja aiheutimme erilaisen ilmentymisarvon OSM:n ja OSS1:n välille EV- ja sETR1-genotyypeissä (kuva 4D). sETR1:ssä fenamidin aiheuttama ero OSM:n ja OSS1:n välillä pieneni huomattavasti. Kaksoisklusterointimenetelmää sovellettiin myös MS/MS-dataan, joka oli kerätty kannoista, joissa JA ei ollut riittävän suuri JA-geenin määrittämiseksi, jotta voitaisiin päätellä JA-säätelemään aineenvaihdunnan erikoistumiseen liittyvät tärkeimmät MS/MS-moduulit (kuva S6).
(A) 585 MS/MS:n klusterointitulokset, jotka perustuvat jaettuun fragmenttiin (NDP-samankaltaisuus) ja jaettuun neutraalihäviöön (NL-samankaltaisuus), johtavat siihen, että moduuli (M) on yhdenmukainen tunnetun yhdisteperheen kanssa tai tuntemattoman tai heikosti metaboloituvan metaboliitin koostumuksen kanssa. Kunkin moduulin vieressä on esitetty metaboliitin (MS/MS) spesifinen (Si) jakauma. (B) Modulaarinen molekyyliverkosto: Solmut edustavat MS/MS:ää ja reunoja, NDP (punainen) ja NL (sininen) MS/MS-pisteitä (raja-arvo > 0,6). Porrastettu metaboliittispesifisyysindeksi (Si) on väritetty moduulin perusteella (vasen) ja kartoitettu molekyyliverkostoon (oikea). (C) EV-kasvin moduuli M1 konstitutiivisessa (kontrolli) ja indusoidussa tilassa (simuloitu kasvinsyöjä) 24 tunnin kohdalla: molekyyliverkostokaavio (Si-arvo on solmun koko, defensiivinen fenoliamidi on korostettu sinisellä). (D) Spektriviivan sETR1 M1-molekyyliverkkokaavio heikentyneellä EV- ja ET-havaintokyvyllä: vihreän ympyrän solmun edustama fenoliyhdiste ja W + OSM- ja W + OSS1-käsittelyjen välinen merkitsevä ero (P-arvo) solmun koon mukaan. CP, N-kofeoyylityrosiini; CS, N-kofeoyylispermidiini; FP, N-feruliinihappoesteri-virtsahappo; FS, N-ferulyylispermidiini; CoP, N', N"-kumarolyylityrosiini; DCS, N', N"-dikafeoyylispermidiini; CFS, N', N"-kofeoyyli, feruloyylispermidiini; Lycium barbarum -uutteessa (Golfberry Son); Nickelodeon. O-AS, O-asyylisokeri.
Laajensimme analyysiä edelleen yhdestä heikennetystä Nepenthes-genotyypistä luonnonpopulaatioihin, joissa on aiemmin kuvattu voimakkaita lajinsisäisiä muutoksia kasvinsyöjä-JA-tasoissa ja spesifisissä metaboliittitasoissa luonnollisissa populaatioissa (26). Käytä tätä aineistoa kattamaan 43 sukusolua. Nämä sukusolut koostuvat 123 N. pallens -kasvilajista. Nämä kasvit otettiin siemenistä, jotka kerättiin eri alkuperäisistä elinympäristöistä Utahissa, Nevadassa, Arizonassa ja Kaliforniassa (kuva S7), ja laskimme metabolomidiversiteetin (tässä kutsutaan populaatiotasoksi) ja OSM:n aiheuttaman erikoistumisen. Aiempien tutkimusten mukaisesti havaitsimme laajan kirjon aineenvaihduntamuutoksia Hj- ja δj-akseleilla, mikä osoittaa, että sukusoluilla on merkittäviä eroja kasvinsyöjille aiheuttamien aineenvaihduntavasteidensa plastisuudessa (kuva S7). Tämä organisaatio muistuttaa aiempia havaintoja kasvinsyöjien aiheuttamien JA-muutosten dynaamisesta alueesta ja on säilyttänyt erittäin korkean arvon yhdessä populaatiossa (26, 36). Käyttämällä JA:ta ja JA-Ile:tä testaamaan Hj:n ja δj:n välistä kokonaistason korrelaatiota, havaitsimme, että JA:n ja metabolomin β monimuotoisuus- ja erikoistumisindeksin välillä on merkittävä positiivinen korrelaatio (kuva S7). Tämä viittaa siihen, että kasvinsyöjien aiheuttama JA-entsyymien induktion heterogeenisuus populaatiotasolla voi johtua keskeisistä metabolisista polymorfismeista, jotka johtuvat hyönteiskasvinsyöjistä tapahtuvasta valinnasta.
Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että tupakkalajit eroavat suuresti toisistaan ​​tyypin ja indusoitujen ja konstitutiivisten aineenvaihduntamekanismien suhteellisen riippuvuuden suhteen. Uskotaan, että näitä muutoksia kasvinsyöjävastaisissa signaalitransduktioissa ja puolustuskyvyssä säätelevät hyönteispopulaatiopaine, kasvin elinkaari ja puolustuskykykustannukset siinä markkinaraossa, jossa tietty laji kasvaa. Tutkimme kuuden Pohjois- ja Etelä-Amerikasta kotoisin olevan Nicotiana-lajin kasvinsyöjien indusoiman lehtimetabolomien uudelleenmuodostuksen johdonmukaisuutta. Nämä lajit ovat läheistä sukua Nepenthes North Americalle, nimittäin Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. attenuated grass, Nicotiana tabacum, lineaarinen tupakka, tupakka (Nicotiana spegazzinii) ja tupakanlehtitupakka (Nicotiana obtusifolia) (kuva 5A) (37). Kuusi näistä lajeista, mukaan lukien hyvin karakterisoitu laji N. please, ovat petunia-alaan kuuluvia yksivuotisia kasveja, ja obtusifolia N. on sisaralaan Trigonophyllae kuuluvia monivuotisia kasveja (38). Myöhemmin näille seitsemälle lajille suoritettiin W + W, W + OSM ja W + OSS1 -induktio hyönteisten ruokailun lajitason metabolisen uudelleenjärjestelyn tutkimiseksi.
(A) Bootstrap-fylogeneettinen puu, joka perustuu maksimitodennäköisyyteen [ydinglutamiinisynteesille (38)] ja seitsemän läheisesti sukua olevan Nicotiana-lajin maantieteelliseen jakaumaan (eri värit) (37). (B) Hajontakaavio seitsemän Nicotiana-lajin aineenvaihduntaprofiilien erikoistuneesta monimuotoisuudesta (939 MS/MS; datatiedosto S1). Lajitasolla metabolomidiversiteetti korreloi negatiivisesti erikoistumisasteen kanssa. Lajitason korrelaation analyysi aineenvaihdunnan monimuotoisuuden ja erikoistumisen sekä JA-kertymisen välillä on esitetty kuvassa 2. S9. Väri, eri tyypit; kolmio, W + OSS1; suorakulmio, W + OSM; (C) Nicotiana JA- ja JA-Ile-dynamiikat on luokiteltu OS-viritysamplitudin mukaan (kaksisuuntainen ANOVA ja Tukey HSD monivertailujen jälkeen, * P <0,05, ** P <0,01 ja * ** W + OS:n ja W + W:n vertailussa P <0,001). Laatikkodiagrammi (D) monimuotoisuudesta ja (E) erikoistumisesta kunkin lajin osalta kasvinsyöjä- ja metyyli-JA:n (MeJA) simuloinnin jälkeen. Tähti osoittaa merkitsevän eron W + OS:n ja W + W:n tai lanoliini plus W:n (Lan + W) tai Lan plus MeJA:n (Lan + MeJa) ja Lan-kontrollin välillä (kaksisuuntainen varianssianalyysi, jota seurasi Tukeyn HSD:n post hoc -monivertailu, *P<0,05, **P<0,01 ja ***P<0,001).
Käyttämällä kaksoisklusterimenetelmää tunnistimme 9 moduulia, joista jokainen koostui 939 MS/MS:stä (datatiedosto S1). Eri käsittelyjen uudelleenkonfiguroimien MS/MS:ien koostumus vaihtelee suuresti eri moduulien välillä lajien välillä (kuva S8). Hj:n (tässä viitataan lajitason γ-diversiteettinä) ja δj:n visualisointi paljastaa, että eri lajit aggregoituvat hyvin erilaisiksi ryhmiksi aineenvaihduntatilassa, jossa lajitason jakautuminen on yleensä voimakkaampaa kuin eksitaatio. N. linearia ja N. obliquutta lukuun ottamatta niillä on laaja dynaaminen induktiovaikutusten alue (kuva 5B). Sitä vastoin lajeilla, kuten N. purpurealla ja N. obtusifolialla, on vähemmän ilmeinen metabolinen vaste käsittelylle, mutta metabolomi on monimuotoisempi. Indusoidun metabolisen vasteen lajikohtainen jakauma johti merkittävään negatiiviseen korrelaatioon erikoistumisen ja gamma-diversiteettien välillä (PCC = -0,46, P = 4,9×10-8). OS:n aiheuttamat muutokset JA-tasoissa korreloivat positiivisesti metabolomi-erikoistumisen kanssa ja negatiivisesti kunkin lajin metabolisen gamma-diversiteettien kanssa (kuva 5B ja kuva S9). On syytä huomata, että kuvassa 5C puhekielessä "signaalivasteeseen" reagoiviksi lajeiksi kutsutut lajit, kuten Nepenthes-sukkulamadot, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute ja Nepenthes attenuated, aiheuttivat merkittäviä merkkejä 30 minuutin kohdalla. Viimeaikaiset OS-spesifiset JA- ja JA-Ile-epidemiat, kun taas muut "signaaliin reagoimattomiksi" kutsutut bakteerit, kuten Nepenthes mills, Nepenthes powdery ja N. obtusifolia, osoittavat vain JA-Ile Edge -induktiota ilman OS-spesifisyyttä (kuva 5C). Metabolian tasolla, kuten edellä mainittiin, heikennetyllä Nepenthes-lajilla signaaliin reagoivat aineet osoittivat OS-spesifisyyttä ja lisäsivät merkittävästi δj:tä samalla kun Hj pieneni. Tätä OS-spesifistä herätevaikutusta ei havaittu signaaliin reagoimattomiksi lajeiksi luokitelluissa lajeissa (kuva 5, D ja E). OS-spesifisiä metaboliitteja esiintyy useammin signaaliin reagoivien lajien välillä, ja nämä signaaliryppäät ryppäävät heikommin signaalivasteisiin reagoivien lajien kanssa, kun taas heikommin signaalivasteisiin reagoivat lajit osoittavat vähemmän keskinäisriippuvuutta (kuva S8). Tämä tulos osoittaa, että JA:iden OS-spesifinen induktio ja alavirran metabolomin OS-spesifinen uudelleenkonfiguraatio ovat kytköksissä lajitasolla.
Seuraavaksi käytimme metyyli-JA:ta (MeJA) sisältävää lanoliinitahnaa kasvien käsittelyyn tutkiaksemme, rajoittaako kasvien sytoplasmassa olevan eksogeenisen JA:n saatavuus näitä kytkentämoodeja. Nopea deesteröityminen on JA:ta. Havaitsimme saman trendin, jossa signaaliin reagoivista lajeista signaaliin reagoimattomiin lajeihin tapahtui asteittain JA:n jatkuvan saannin vuoksi (kuva 5, D ja E). Lyhyesti sanottuna MeJA-käsittely ohjelmoi voimakkaasti uudelleen lineaaristen sukkulamatojen, N. obliquusin, N. aquaticuksen, N. pallensin ja N. mikimotoin, metabolomit, mikä johti merkittävään δj:n nousuun ja Hj:n laskuun. N. purpurea osoitti vain δj:n nousua, mutta ei Hj:tä. N. obtusifolia, jonka on aiemmin osoitettu keräävän erittäin alhaisia ​​JA-tasoja, reagoi myös heikosti MeJA-käsittelyyn metabolomien uudelleenkonfiguraation suhteen. Nämä tulokset osoittavat, että JA-tuotanto tai signaalinvälitys on fysiologisesti rajoittunutta signaaliin reagoimattomilla lajeilla. Tämän hypoteesin testaamiseksi tutkimme neljää lajia (N. pallens, N. mills, N. pink ja N. microphylla), joita indusoivat W + W, W + OSM:t ja W + OSS1 -transkriptomi (39). Metabolomiremodeloinnin kuvion mukaisesti lajit ovat hyvin erillään transkriptomiavaruudessa, joista N. attenuated osoitti korkeinta OS:n indusoimaa RDPI:tä, kun taas N. graciliksella oli alhaisin (kuva 6A). Havaittiin kuitenkin, että N. oblongan indusoima transkriptomidiversiteetti oli neljän lajin joukossa pienin, toisin kuin N. oblongan aiemmin seitsemällä lajilla osoitettu korkein metabonominen monimuotoisuus. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että joukko varhaisiin puolustussignaaleihin, mukaan lukien JA-signaalit, liittyviä geenejä selittää kasvinsyöjiin liittyvien elisiittorien indusoimien varhaisten puolustusvasteiden spesifisyyden Nicotiana-lajeissa (39). Näiden neljän lajin JA-signalointireittien vertailu paljasti mielenkiintoisen kuvion (kuva 6B). Useimmat tämän reitin geenit, kuten AOC, OPR3, ACX ja COI1, osoittivat suhteellisen korkeita induktiotasoja näissä neljässä lajissa. Keskeinen geeni, JAR4, muuntaa kuitenkin JA:n biologisesti aktiiviseen muotoonsa JA-Ile:n kertyneistä transkripteista, ja sen transkriptiotaso on hyvin alhainen, erityisesti N. mills-, Nepenthes pieris- ja N. microphylla -lajeissa. Lisäksi vain toisen geenin, AOS:n, transkriptia ei havaittu N. bifidumissa. Nämä geenien ilmentymisen muutokset voivat olla vastuussa äärimmäisistä fenotyypeistä, jotka johtuvat signaalianergisten lajien alhaisesta JA-tuotannosta ja N. gracilis -bakteerin induktiosta.
(A) Informaatioteorian analyysi neljän läheisen sukua olevan tupakkalajin varhaisten transkriptiovasteiden uudelleenohjelmoinnista 30 minuuttia kasvinsyöjäinduktion jälkeen otettujen näytteiden perusteella. RDPI lasketaan vertaamalla kasvinsyöjä-OS:n indusoimia lehtiä haavakontrolliin. Värit osoittavat eri lajeja ja symbolit eri käsittelymenetelmiä. (B) Geenien ilmentymisen analyysi JA-signalointireiteillä neljällä lajilla. Yksinkertaistettu JA-reitti on esitetty laatikkodiagrammin vieressä. Eri värit osoittavat eri käsittelymenetelmiä. Tähti osoittaa, että W + OS -käsittelyn ja W + W -kontrollin välillä on merkittävä ero (Studentin t-testissä parittaisille eroille *P<0,05, **P<0,01 ja ***P<0,001). OPDA, 12-oksofytodieenihappo; OPC-8: 0,3-okso-2(2'(Z)-pentenyyli)syklopentaani-1-oktaanihappo.
Viimeisessä osassa tutkimme, miten eri kasvilajien metabolomin hyönteislajikohtainen uudelleenmuokkaus voi olla resistenttiä kasvinsyöjille. Aiempi tutkimus painotti Nicotiana-sukua. Niiden vastustuskyky Ms:lle ja toukille eroaa suuresti (40). Tässä tutkimme tämän mallin ja niiden metabolisen plastisuuden välistä yhteyttä. Käyttämällä edellä mainittuja neljää tupakkalajia ja testaamalla kasvinsyöjien aiheuttaman metabolomin monimuotoisuuden ja erikoistumisen sekä kasvien Ms:lle ja Sl:lle aiheuttaman resistenssin välistä korrelaatiota havaitsimme, että resistenssi, monimuotoisuus ja erikoistuminen generalistiselle Sl All:lle korreloivat positiivisesti, kun taas korrelaatio asiantuntijalajille asetetun resistenssin ja erikoistumisen välillä on heikko, eikä korrelaatio monimuotoisuuden kanssa ole merkitsevä (kuva S10). S1-resistenssin osalta sekä heikennetyllä N. chinensis- että N. gracilis -lajilla, joilla aiemmin on osoitettu olevan sekä JA-signaalitransduktiotasoja että metabolomin plastisuutta, oli hyvin erilaisia ​​vasteita kasvinsyöjäinduktiolle, ja ne osoittivat myös samanlaista korkeaa resistenssiä. Sukupuoli.
Viimeisten kuudenkymmenen vuoden aikana kasvinpuolustusteoria on tarjonnut teoreettisen viitekehyksen, jonka perusteella tutkijat ovat ennustaneet huomattavan määrän kasvien erikoistuneiden metaboliittien evoluutiota ja toimintoja. Useimmat näistä teorioista eivät noudata normaalia vahvojen päätelmien menettelyä (41). Ne esittävät keskeisiä ennusteita (3) samalla analyysitasolla. Kun keskeisten ennusteiden testaaminen mahdollistaa tiettyjen teorioiden analysoinnin, tämä tekee Ala menee eteenpäin. Saadaan tukea, mutta hylätään muita (42). Sen sijaan uusi teoria tekee ennusteita eri analyysitasoilla ja lisää uuden kuvailevien näkökohtien kerroksen (42). Kaksi toiminnallisella tasolla ehdotettua teoriaa, MT ja OD, voidaan kuitenkin helposti selittää tärkeinä ennusteina kasvinsyöjien aiheuttamista erikoistuneista aineenvaihduntamuutoksista: OD-teoria uskoo, että muutokset erikoistuneessa aineenvaihdunta"tilassa" ovat erittäin suuntaavia. MT-teoria uskoo, että nämä muutokset ovat suuntaamattomia ja sijaitsevat satunnaisesti aineenvaihduntatilassa, ja niillä on yleensä korkean puolustusarvon aineenvaihduntatuotteita. Aiempia OD- ja MT-ennusteiden tutkimuksia on testattu käyttämällä kapeaa joukkoa a priori "puolustus"yhdisteitä. Nämä metaboliittikeskeiset testit estävät metabolomikon uudelleenkonfiguraation laajuuden ja etenemisen analysoinnin kasvinsyöjäkasvien aikana, eivätkä ne salli testausta johdonmukaisessa tilastollisessa viitekehyksessä, joka vaatisi keskeisiä ennusteita, joita voidaan pitää kokonaisuutena. Kasvin metabolomikon muutosten kvantifiointi. Tässä käytimme innovatiivista laskennalliseen MS:ään perustuvaa metabolomiikan teknologiaa ja suoritimme dekonvoluutio-MS-analyysin informaatioteorian yleisten kuvaajien avulla testataksemme näiden kahden välistä eroa globaalilla metabolomiikan tasolla. Tämän teorian keskeinen ennuste. Informaatioteoriaa on sovellettu monilla aloilla, erityisesti luonnon monimuotoisuuden ja ravinnevirtaustutkimuksen yhteydessä (43). Tämä on kuitenkin tietääksemme ensimmäinen sovellus, jota on käytetty kuvaamaan kasvien aineenvaihdunnan informaatioavaruutta ja ratkaisemaan ekologisia ongelmia, jotka liittyvät tilapäisiin aineenvaihdunnan muutoksiin ympäristövihjeiden vaikutuksesta. Erityisesti tämän menetelmän kyky piilee sen kyvyssä vertailla malleja kasvilajien sisällä ja niiden välillä tutkiakseen, miten kasvinsyöjät ovat kehittyneet eri lajeista lajien välisiksi makroevolutiivisiksi malleiksi eri evoluution tasoilla. Aineenvaihdunta.
Pääkomponenttianalyysi (PCA) muuntaa monimuuttujaisen datajoukon dimensionaalisuuden vähentämiseen tarkoitetuksi tilaksi, jotta datan pääasiallinen trendi voidaan selittää. Sitä käytetään yleensä tutkimustekniikkana datajoukon jäsentämiseen, kuten dekonvoluutiometabolomin analysointiin. Dimensionaalisuuden vähentäminen kuitenkin menettää osan datajoukon informaatiosisällöstä, eikä PCA voi tarjota kvantitatiivista tietoa ominaisuuksista, jotka ovat erityisen merkityksellisiä ekologisen teorian kannalta, kuten: miten kasvinsyöjät muokkaavat monimuotoisuutta erikoistuneilla aloilla (esimerkiksi rikkaus, levinneisyys ja runsaus) ja metaboliiteissa? Mitkä metaboliitit ennustavat tietyn kasvinsyöjän indusoitua tilaa? Spesifisyyden, monimuotoisuuden ja indusoitavuuden näkökulmasta lehtikohtaisen metaboliittiprofiilin informaatiosisältö hajoaa, ja havaitaan, että kasvinsyöjien syöminen voi aktivoida spesifistä aineenvaihduntaa. Yllättäen havaitsimme, että kuten toteutetuissa informaatioteorian indikaattoreissa on kuvattu, tuloksena oleva aineenvaihduntatilanne on päällekkäinen kahden kasvinsyöjän (yösyövän generalistin Sl) ja Solanaceae-asiantuntijan Ms. hyökkäysten jälkeen. Vaikka niiden ruokailukäyttäytyminen ja keskittyminen eroavat merkittävästi toisistaan. Rasvahappo-aminohappokonjugaatin (FAC) initiaattori OS:ssä (31). Käyttämällä kasvinsyöjä OS:ää standardoitujen pistohaavojen hoitoon, simuloitu kasvinsyöjähoito osoitti myös samanlaisen trendin. Tämä standardoitu menetelmä kasvien vasteen simuloimiseksi kasvinsyöjien hyökkäyksiin eliminoi kasvinsyöjien syömiskäyttäytymisen muutosten aiheuttamat sekoittavat tekijät, jotka johtavat vaihtelevaan vaurioasteeseen eri aikoina (34). FAC, jonka tiedetään olevan OSM:n pääasiallinen aiheuttaja, vähentää JAS:n ja muiden kasvihormonien vasteita OSS1:ssä, kun taas OSS1 vähentää satoja kertoja (31). OSS1 aiheutti kuitenkin samanlaisia ​​JA-kertymiä kuin OSM. Aikaisemmin on osoitettu, että JA-vaste heikennetyissä Nepenthes-lajeissa on erittäin herkkä OSM:lle, jossa FAC voi säilyttää aktiivisuutensa, vaikka se laimennetaan vedellä suhteessa 1:1000 (44). Siksi verrattuna OSM:ään, vaikka FAC on OSS1:ssä hyvin alhainen, se riittää indusoimaan riittävän JA-epidemian. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että poriinin kaltaisia ​​proteiineja (45) ja oligosakkarideja (46) voidaan käyttää molekyylitason vihjeinä kasvien puolustusvasteiden laukaisemiseksi OSS1:ssä. On kuitenkin edelleen epäselvää, ovatko nämä OSS1:n elisiittorit vastuussa tässä tutkimuksessa havaitusta JA:n kertymisestä.
Vaikka eri kasvinsyöjien tai eksogeenisen JA:n tai SA:n (salisyylihappo) käytön aiheuttamia erilaisia ​​aineenvaihduntasormenjälkiä kuvaavia tutkimuksia on vähän (47), kukaan ei ole häirinnyt kasvinsyöjälajikohtaista häiriötä kasvin ruohoverkostossa ja sen vaikutuksia tiettyihin henkilötietoihin. Aineenvaihdunnan kokonaisvaikutusta tutkitaan systemaattisesti. Tämä analyysi vahvisti edelleen, että sisäisen hormoniverkoston yhteys muihin kasvihormoneihin kuin JA:ihin muokkaa kasvinsyöjien aiheuttaman aineenvaihdunnan uudelleenjärjestelyn spesifisyyttä. Havaitsimme erityisesti, että OSM:n aiheuttama ET oli merkittävästi suurempi kuin OSS1:n aiheuttama. Tämä tila on yhdenmukainen OSM:n suuremman FAC-pitoisuuden kanssa, mikä on välttämätön ja riittävä edellytys ET-purkauksen laukaisemiseksi (48). Kasvien ja kasvinsyöjien välisen vuorovaikutuksen yhteydessä ET:n signalointifunktio kasvispesifiseen aineenvaihduntadynamiikkaan on edelleen satunnaista ja kohdistuu vain yhteen yhdisteryhmään. Lisäksi useimmissa tutkimuksissa on käytetty ET:n tai sen esiasteiden tai erilaisten estäjien eksogeenista käyttöä ET:n säätelyn tutkimiseksi, ja nämä eksogeeniset kemikaalisovellukset tuottavat monia epäspesifisiä sivuvaikutuksia. Tietojemme mukaan tämä tutkimus on ensimmäinen laajamittainen systemaattinen tutkimus ET:n roolista ET:n käytössä heikentyneiden transgeenisten kasvien tuottamiseen ja havaitsemiseen kasvien metabolomidynamiikan koordinoimiseksi. Kasvinsyöjäkohtainen ET-induktio voi lopulta moduloida metabolomivastetta. Merkittävin on ET-biosynteesi- (ACO) ja -havainto- (ETR1) geenien transgeeninen manipulointi, joka paljasti kasvinsyöjäkohtaisen fenoliamidien de novo -kertymisen. Aiemmin on osoitettu, että ET voi hienosäätää JA:n indusoimaa nikotiinin kertymistä säätelemällä putreskiini-N-metyylitransferaasia (49). Mekaanisesta näkökulmasta ei kuitenkaan ole selvää, miten ET hienosäätää fenamidin induktiota. ET:n signaalinvälitysfunktion lisäksi metabolinen virtaus voidaan myös ohjata S-adenosyyli-1-metioniiniin säätelemään polyaminofenoliamideihin sitoutumista. S-adenosyyli-1-metioniini on ET ja polyamiinien biosynteesireitin yhteinen välituote. Mekanismi, jolla ET-signaali säätelee fenoliamidin määrää, vaatii lisätutkimuksia.
Pitkään tiettyjen aineenvaihduntakategorioiden tarkka tarkastelu ei ole kyennyt tarkasti arvioimaan aineenvaihdunnan monimuotoisuuden ajallisia muutoksia biologisten vuorovaikutusten jälkeen, koska rakenteeltaan tuntemattomia erityismetaboliitteja on paljon. Tällä hetkellä informaatioteorian analyysin perusteella harhattomiin metaboliitteihin perustuvan MS/MS-spektrin hankinnan päätulos on, että kasvinsyöjiä syövät tai niitä simuloivat kasvinsyöjät vähentävät edelleen lehden metabolomin yleistä metabolista monimuotoisuutta samalla, kun sen erikoistumisaste kasvaa. Tämä kasvinsyöjien aiheuttama väliaikainen metabolomin spesifisyyden lisääntyminen liittyy transkriptomin spesifisyyden synergistiseen lisääntymiseen. Ominaisuus, joka eniten edistää tätä suurempaa metabolomin erikoistumista (jolla on korkeampi Si-arvo), on erityinen metaboliitti, jolla on aiemmin karakterisoitu kasvinsyöjäfunktio. Tämä malli on yhdenmukainen OD-teorian ennusteen kanssa, mutta metabolomin uudelleenohjelmoinnin satunnaisuuteen liittyvä MT:n ennuste ei ole yhdenmukainen. Tämä data on kuitenkin yhdenmukainen myös sekamallin ennusteen kanssa (paras MT; kuva 1B), koska muut karakterisoimattomat metaboliitit, joilla on tuntemattomia puolustustoimintoja, voivat silti noudattaa satunnaista Si-jakaumaa.
Merkillepantava kuvio, jonka tämä tutkimus edelleen havaitsi, on se, että mikroevoluutiotasolta (yksittäinen kasvi ja tupakkapopulaatio) suurempaan evoluutiomittakaavaan (läheisesti sukua olevat tupakkalajit) eri evolutiivisen organisaation tasot ovat "parhaassa puolustusasemassa". Kasvinsyöjien kyvyissä on merkittäviä eroja. Moore ym. (20) sekä Kessler ja Kalske (1) ehdottivat itsenäisesti Whittakerin (50) alun perin erottamien kolmen biodiversiteetin funktionaalisen tason muuttamista kemiallisen monimuotoisuuden konstitutiivisiksi ja indusoiduiksi ajallisiksi muutoksiksi; nämä kirjoittajat eivät myöskään tiivistäneet, miten metabolinen monimuotoisuus lasketaan näistä tiedoista. Tässä tutkimuksessa Whittakerin funktionaaliseen luokitteluun tehdään pieniä muutoksia, joissa α-metabolista monimuotoisuutta pidetään tietyn kasvin MS/MS-spektrien monimuotoisuutena ja β-metabolista monimuotoisuutta populaatioryhmän peruslajinsisäisenä aineenvaihduntana ja γ-metabolinen monimuotoisuus on samankaltaisten lajien analyysin laajennus.
JA-signaali on välttämätön monille kasvinsyöjien aineenvaihduntavasteille. JA-biosynteesin lajinsisäisen säätelyn osuudesta metabolomidiversiteettiin ei kuitenkaan ole tehty tarkkoja kvantitatiivisia testejä, ja onko JA-signaali yleinen stressin aiheuttaman aineenvaihdunnan monimuotoistumisen kohde korkeammalla makroevolutiivisella mittakaavalla, on edelleen vaikeaselkoista. Havaitsimme, että Nepenthes-kasvinsyöjälajin kasvinsyöjäluonne indusoi metabolomierikoistumista, ja metabolomierikoistumisen vaihtelu Nicotiana-lajien populaatiossa ja läheisesti sukua olevien Nicotiana-lajien välillä korreloi systemaattisesti positiivisesti JA-signaloinnin kanssa. Lisäksi, kun JA-signaali heikentyy, yksittäisen genotyypin kasvinsyöjän indusoima metabolinen spesifisyys mitätöityy (kuva 3, C ja E). Koska luonnollisesti heikentyneiden Nepenthes-populaatioiden metaboliaspektrin muutokset ovat enimmäkseen kvantitatiivisia, tässä analyysissä havaitut muutokset metabolisessa β-diversiteetissä ja -spesifisyydessä voivat johtua suurelta osin metaboliittirikkaiden yhdisteluokkien voimakkaasta herätteestä. Nämä yhdisteluokat hallitsevat osaa metabolomiprofiilista ja johtavat positiiviseen korrelaatioon JA-signaalien kanssa.
Koska läheisesti sukua olevien tupakkalajien biokemialliset mekanismit ovat hyvin erilaiset, metaboliitit tunnistetaan spesifisesti kvalitatiivisessa näkökulmassa, joten se on analyyttisempi. Informaatioteorian käsittelemä kaapattu metabolinen profiili paljastaa, että kasvinsyöjien induktio pahentaa metabolisen gamman monimuotoisuuden ja erikoistumisen välistä kompromissia. JA-signaalilla on keskeinen rooli tässä kompromississa. Metabolomin erikoistumisen lisääntyminen on yhdenmukaista pääasiallisen OD-ennusteen kanssa ja korreloi positiivisesti JA-signaalin kanssa, kun taas JA-signaali korreloi negatiivisesti metabolisen gamman monimuotoisuuden kanssa. Nämä mallit osoittavat, että kasvien OD-kapasiteetti määräytyy pääasiassa JA:n plastisuuden perusteella, olipa kyseessä sitten mikroevolutiivinen mittakaava tai laajempi evolutiivinen mittakaava. Eksogeeniset JA-sovelluskokeet, jotka kiertävät JA-biosynteesivirheitä, paljastavat edelleen, että läheisesti sukua olevat tupakkalajit voidaan erottaa signaaliin reagoiviksi ja signaaliin reagoimattomiksi lajeiksi, aivan kuten niiden JA-tila ja metabolomin plastisuus, jonka kasvinsyöjät indusoivat. Signaaliin reagoimattomat lajit eivät pysty reagoimaan, koska ne eivät kykene tuottamaan endogeenistä JA:ta, ja siksi ne ovat fysiologisten rajoitusten alaisia. Tämä voi johtua joidenkin JA-signalointireitin avaingeenien (AOS ja JAR4 N. crescensissä) mutaatioista. Tämä tulos korostaa, että nämä lajien väliset makroevolutiiviset mallit voivat johtua pääasiassa sisäisten hormonien havaitsemisen ja reagoinnin muutoksista.
Kasvien ja kasvinsyöjien välisen vuorovaikutuksen lisäksi metabolisen monimuotoisuuden tutkiminen liittyy kaikkiin tärkeisiin teoreettisiin edistysaskeliin biologisen sopeutumisen tutkimuksessa ympäristöön ja monimutkaisten fenotyyppisten ominaisuuksien evoluutiossa. Nykyaikaisten MS-laitteiden hankkiman datan määrän kasvun myötä metabolisen monimuotoisuuden hypoteesien testaus voi nyt ylittää yksilöiden/luokkien metaboliittien väliset erot ja suorittaa globaalia analyysia odottamattomien suuntausten paljastamiseksi. Laajamittaisen analyysin prosessissa tärkeä metafora on ajatus merkityksellisten karttojen luomisesta, joita voidaan käyttää datan tutkimiseen. Siksi tärkeä tulos nykyisestä puolueettoman MS/MS-metabolomiikan ja informaatioteorian yhdistelmästä on se, että se tarjoaa yksinkertaisen mittarin, jota voidaan käyttää karttojen rakentamiseen metabolisen monimuotoisuuden selaamiseksi eri taksonomisilla tasoilla. Se on tämän menetelmän perusvaatimus. Mikro/makroevoluution ja yhteisöekologian tutkimus.
Makroevoluution tasolla Ehrlichin ja Ravenin (51) kasvi-hyönteinen-koevoluutioteorian ydin on ennustaa, että lajien välisen aineenvaihdunnan monimuotoisuuden vaihtelu on syynä kasvilinjojen monimuotoistumiseen. Tämän uraauurtavan teoksen julkaisua seuranneina viitenäkymmenenä vuotena tätä hypoteesia on kuitenkin testattu harvoin (52). Tämä johtuu suurelta osin pitkän matkan kasvilinjojen vertailukelpoisten aineenvaihdunnan ominaisuuksien fylogeneettisistä ominaisuuksista. Harvinaisuutta voidaan käyttää kohdeanalyysimenetelmien ankkuroinnissa. Nykyinen informaatioteorian käsittelemä MS/MS-työnkulku kvantifioi tuntemattomien metaboliittien MS/MS-rakenteellisen samankaltaisuuden (ilman aiempaa metaboliittivalintaa) ja muuntaa nämä MS/MS:t joukoksi MS/MS:iä, mikä tekee ammattimaisesta aineenvaihdunnasta... Näitä makroevoluutiomalleja verrataan luokitteluasteikolla. Yksinkertaiset tilastolliset indikaattorit. Prosessi on samanlainen kuin fylogeneettinen analyysi, jossa voidaan käyttää sekvenssien linjausta monimuotoistumisen tai ominaisuuksien evoluution nopeuden kvantifiointiin ilman aiempaa ennustamista.
Biokemiallisella tasolla Firnin ja Jonesin (53) seulontahypoteesi osoittaa, että metabolinen monimuotoisuus säilyy eri tasoilla, jotta voidaan tarjota raaka-aineita aiemmin toisiinsa liittymättömien tai korvattujen metaboliittien biologisten aktiivisuuksien toteuttamiseen. Informaatioteorian menetelmät tarjoavat viitekehyksen, jossa näitä metaboliittikohtaisia ​​evolutiivisia siirtymiä, jotka tapahtuvat metaboliittien erikoistumisen aikana, voidaan kvantifioida osana ehdotettua evolutiivista seulontaprosessia: biologisesti aktiivinen sopeutuminen matalasta spesifisyydestä korkeaan spesifisyyteen tietyn ympäristön estyneet metaboliitit.
Kaiken kaikkiaan molekyylibiologian alkuaikoina kehitettiin tärkeitä kasvinpuolustusteorioita, ja deduktiivisia hypoteesipohjaisia ​​menetelmiä pidetään laajalti ainoana tieteellisen edistyksen keinona. Tämä johtuu suurelta osin koko metabolomin mittaamisen teknisistä rajoituksista. Vaikka hypoteesipohjaiset menetelmät ovat erityisen hyödyllisiä muiden syy-seuraussuhteiden mekanismien valinnassa, niiden kyky edistää ymmärrystämme biokemiallisista verkostoista on rajallisempi kuin nykyajan dataintensiivisessä tieteessä tällä hetkellä käytettävissä olevilla laskennallisilla menetelmillä. Siksi teoriat, joita ei voida ennustaa, ovat kaukana saatavilla olevan datan laajuudesta, joten hypoteettista kaava/testi-sykliä tutkimuksen edistyksessä ei voida lakkauttaa (4). Ennakoimme, että tässä esitelty metabolomiikan laskennallinen työnkulku voi herättää uudelleen kiinnostuksen aineenvaihdunnan monimuotoisuuden viimeaikaisiin (miten) ja lopullisiin (miksi) kysymyksiin ja edistää teoreettisesti ohjatun datatieteen uutta aikakautta. Aikakausi tarkasteli uudelleen tärkeitä teorioita, jotka inspiroivat aiempia sukupolvia.
Suora kasvinsyöjäruokinta suoritetaan kasvattamalla toisen vaiheen toukka eli Sl-toukka yhden ruusun kukkivan kasvin yhdelle vaalealle kannukkakasvin lehdelle, 10 kasvia kohden. Hyönteisten toukat puristettiin puristimilla, ja jäljelle jäänyt lehtikudos kerättiin 24 ja 72 tuntia infektion jälkeen ja pakastettiin, ja metaboliitit uutettiin.
Simuloi kasvinsyöjäkäsittelyä erittäin synkronoidulla tavalla. Menetelmässä käytetään kangaskuviopyöriä puhkaisemaan kolme riviä piikkejä kasvin kolmen täysin laajentuneen lehden keskiosan kummallakin puolella kangasseppeleen kasvuvaiheessa ja levitetään välittömästi 1:5 laimennettua Ms:ää. Tai käytä hansikoita S1 OS:n työntämiseen pistohaavaan. Korjaa ja käsittele lehti edellä kuvatulla tavalla. Käytä aiemmin kuvattua menetelmää primaaristen metaboliittien ja kasvihormonien uuttamiseen (54).
Eksogeenisessä JA-käsittelyssä kunkin lajin kuuden ruusun kukinnan kolme lehteä käsitellään 20 μl:lla lanoliinitahnaa, joka sisältää 150 μg MeJA:ta (Lan + MeJA), ja 20 μl:lla lanoliinia ja haavanhoitoa (Lan + W) tai käytetään 20 μl puhdasta lanoliinia kontrollina. Lehdet kerättiin 72 tuntia käsittelyn jälkeen, pikapakastettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 °C:ssa käyttöön asti.
Tutkimusryhmässämme on tunnistettu neljä JA- ja ET-transgeenistä linjaa, nimittäin irAOC (36), irCOI1 (55), irACO ja sETR1 (48). irAOC:ssa JA- ja JA-Ile-tasot laskivat voimakkaasti, kun taas irCOI1 ei ollut herkkä JA-ille. EV:hen verrattuna JA-Ile:n kertyminen lisääntyi. Vastaavasti irACO vähentää ET:n tuotantoa, ja EV:hen verrattuna sETR1, joka on ET:lle epäherkkä, lisää ET:n tuotantoa.
ET-mittaus suoritetaan ei-invasiivisesti fotoakustisella laserspektrometrillä (Sensor Sense ETD-300 reaaliaikainen ET-sensori). Välittömästi käsittelyn jälkeen puolet lehdistä leikattiin ja siirrettiin 4 ml:n suljettuun lasipulloon, ja höyryn annettiin kertyä nesteen pinnalle 5 tunnin kuluessa. Mittauksen aikana kutakin pulloa huuhdeltiin 2 litran/tunti puhtaalla ilmalla 8 minuutin ajan. Ilma oli ensin johdettu Sensor Sensen toimittaman katalyytin läpi CO2:n ja veden poistamiseksi.
Mikrosirutiedot julkaistiin alun perin julkaisussa (35) ja tallennettiin National Center for Biotechnology Informationin (NCBI) geeniekspression kattavaan tietokantaan (lisäysnumero GSE30287). Tässä tutkimuksessa otettiin huomioon W + OSM-käsittelyn ja vahingoittumattoman kontrollin aiheuttamat lehdet. Raaka-intensiteetti on log2. Ennen tilastollista analyysia lähtötaso muunnettiin ja normalisoitiin 75. persentiiliin R-ohjelmistopaketilla.
Nicotiana-lajien alkuperäiset RNA-sekvensointitiedot (RNA-seq) haettiin NCBI:n lyhytlukuarkistosta (SRA), projektinumero PRJNA301787, jonka Zhou ym. (39) raportoivat, ja etenevät julkaisussa (56) kuvatulla tavalla. W + W-, W + OSM- ja W + OSS1-ohjelmien käsittelemät Nicotiana-lajeja vastaavat raakadata valittiin analysoitavaksi tässä tutkimuksessa ja käsiteltiin seuraavalla tavalla: Ensin raakat RNA-sekvensointitulokset muunnettiin FASTQ-muotoon. HISAT2 muuntaa FASTQ-tiedostot SAM-muotoon ja SAMtools muuntaa SAM-tiedostot lajitelluiksi BAM-tiedostoiksi. StringTie-ohjelmaa käytetään geenien ilmentymisen laskemiseen, ja sen ilmentymismenetelmänä on, että fragmentteja on tuhatta emäsfragmenttia miljoonaa sekvensoitua transkriptiofragmenttia kohden.
Analyysissä käytetty Acclaim-kromatografiakolonni (150 mm x 2,1 mm; hiukkaskoko 2,2 μm) ja 4 mm x 4 mm:n suojakolonni koostuvat samasta materiaalista. Dionex UltiMate 3000 Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC) -järjestelmässä käytetään seuraavaa binääristä gradienttia: 0–0,5 minuuttia, isokraattinen 90 % A [deionisoitu vesi, 0,1 % (v/v) asetonitriiliä ja 0,05 % muurahaishappoa], 10 % B (asetonitriiliä ja 0,05 % muurahaishappoa); 0,5–23,5 minuuttia, gradienttifaasi on 10 % A ja 90 % B; 23,5–25 minuuttia, isokraattinen 10 % A ja 90 % B. Virtausnopeus on 400 μl/min. Kaikissa MS-analyyseissä kolonnieluentti injektoidaan kvadrupoli- ja lentoaika-analysaattoriin (qTOF), joka on varustettu positiivisessa ionisaatiotilassa toimivalla sähkösuihkutuslähteellä (kapillaarijännite 4500 V; kapillaarin ulostulo 130 V; kuivauslämpötila 200 °C; kuivausilmavirtaus 10 litraa/min).
Suorita MS/MS-fragmenttianalyysi (jäljempänä MS/MS), joka on epäolennaista tai jota ei voida erottaa datasta, saadaksesi rakenteellista tietoa havaittavasta kokonaismetaboliaprofiilista. Erottelemattoman MS/MS-menetelmän käsite perustuu siihen, että kvadrupolilla on erittäin suuri massaeristysikkuna [siksi kaikkia massa-varaussuhde (m/z) -signaaleja pidetään fragmentteina]. Tästä syystä, koska Impact II -instrumentti ei pystynyt luomaan CE-kallistumaa, suoritettiin useita riippumattomia analyysejä käyttämällä korotettuja törmäyksen aiheuttaman dissosiaation törmäysenergian (CE) arvoja. Lyhyesti sanottuna analysoi ensin näyte UHPLC-sähkösuihkutusionisaatiolla/qTOF-MS:llä käyttäen yksittäistä massaspektrometriatilaa (alhaisen fragmentoitumisen olosuhteet, jotka syntyvät lähteen sisäisestä fragmentoinnista) ja skannaamalla m/z:sta 50:een - 1500:aan 5 Hz:n toistotaajuudella. Käytä typpeä törmäyskaasuna MS/MS-analyysissä ja suorita riippumattomat mittaukset seuraavilla neljällä eri törmäyksen aiheuttamalla dissosiaatiojännitteellä: 20, 30, 40 ja 50 eV. Koko mittausprosessin ajan kvadrupolilla on suurin massaeristysikkuna, m/z 50:stä 1500:aan. Kun etukappaleen m/z ja eristysleveyden koe asetetaan arvoon 200, laitteen käyttöohjelmisto aktivoi massa-alueen automaattisesti ja arvo on 0 Da. Skannaa massafragmentteja kuten yksittäismassatilassa. Käytä natriumformiaattia (50 ml isopropanolia, 200 μl muurahaishappoa ja 1 ml 1 M NaOH:n vesiliuosta) massakalibrointiin. Brukerin erittäin tarkkaa kalibrointialgoritmia käyttäen datatiedosto kalibroidaan tietyn ajanjakson keskimääräisen spektrin suorittamisen jälkeen. Käytä Data Analysis v4.0 -ohjelmiston (Brook Dalton, Bremen, Saksa) vientitoimintoa raakadatatiedostojen muuntamiseen NetCDF-muotoon. MS/MS-datajoukko on tallennettu avoimeen metabolomiikkatietokantaan MetaboLights (www.ebi.ac.uk) lisäysnumerolla MTBLS1471.
MS/MS-kokoonpano voidaan toteuttaa MS1:n ja MS/MS-laatusignaalien välisen korrelaatioanalyysin avulla matalan ja korkean törmäysenergian osalta sekä uusien sääntöjen avulla. R-skriptiä käytetään esiasteen jakauman korrelaatioanalyysin toteuttamiseen tuotteelle ja C#-skriptiä (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) käytetään sääntöjen toteuttamiseen.
Vähentääksemme taustamelun ja tiettyjen m/z-ominaisuuksien havaitsemisesta vain muutamassa näytteessä johtuvien väärien positiivisten virheiden määrää käytämme R-paketin XCMS:n "täytetty huippu" -funktiota (taustamelun korjaukseen). Sitä tulisi käyttää korvaamaan "NA" (havaitsematon huippu) -intensiteetti. Kun täytetty huippu -funktiota käytetään, datajoukossa on silti monia "0"-intensiteettiarvoja, jotka vaikuttavat korrelaatiolaskentaan. Sitten vertaamme datankäsittelytuloksia, jotka on saatu täytettyä huippua käytettäessä ja ilman täytettyä huippua, ja laskemme taustamelun arvon keskimääräisen korjatun arvioidun arvon perusteella ja korvaamme sitten nämä 0-intensiteettiarvot lasketulla tausta-arvolla. Otimme huomioon vain ne ominaisuudet, joiden intensiteetti ylitti kolminkertaisesti tausta-arvon, ja pidimme niitä "todellisina piikkeinä". PCC-laskelmissa otetaan huomioon vain näytteen esiasteen (MS1) ja fragmenttidatajoukkojen m/z-signaalit, joissa on vähintään kahdeksan todellista piikkiä.
Jos koko näytteen esiastelaatuisen ominaisuuden intensiteetti korreloi merkittävästi saman laatuominaisuuden pienentyneen intensiteetin kanssa, joka altistuu matalalle tai korkealle törmäysenergialle, eikä CAMERA ole leimannut ominaisuutta isotooppipiikiksi, se voidaan määritellä tarkemmin. Sitten korrelaatioanalyysi suoritetaan laskemalla kaikki mahdolliset esiaste-tuote-parit 3 sekunnin sisällä (arvioitu retentioaikaikkuna piikin retentiolle). Vain silloin, kun m/z-arvo on pienempi kuin esiastearvo ja MS/MS-fragmentaatiota tapahtuu samassa näytekohdassa datajoukossa kuin esiaste, josta se on johdettu, sitä pidetään fragmenttina.
Näiden kahden yksinkertaisen säännön perusteella suljemme pois määritellyt fragmentit, joiden m/z-arvot ovat suurempia kuin tunnistetun prekursorin m/z-arvot, ja perustumme näytteen sijaintiin, jossa prekursori esiintyy, ja määritettyyn fragmenttiin. On myös mahdollista valita useiden MS1-tilassa luotujen lähdekoodin fragmenttien tuottamat laatuominaisuudet ehdokasprekursoreiksi, jolloin syntyy redundantteja MS/MS-yhdisteitä. Tämän dataredundanssin vähentämiseksi yhdistämme ne, jos spektrien NDP-samankaltaisuus ylittää 0,6 ja ne kuuluvat CAMERA-annotoituun kromatogrammiin "pcgroup". Lopuksi yhdistämme kaikki neljä prekursoriin ja fragmentteihin liittyvää CE-tulosta lopulliseen dekonvoluutoituun yhdistelmäspektriin valitsemalla korkeimman intensiteetin piikin kaikkien saman m/z-arvon omaavien ehdokaspiikkien joukosta eri törmäysenergioilla. Seuraavat käsittelyvaiheet perustuvat yhdistelmäspektrin käsitteeseen ja ottavat huomioon erilaiset CE-olosuhteet, joita tarvitaan fragmentoitumisen todennäköisyyden maksimoimiseksi, koska jotkut fragmentit voidaan havaita vain tietyllä törmäysenergialla.
RDPI:tä (30) käytettiin metaboliaprofiilin indusoituvuuden laskemiseen. Metabolian spektrin monimuotoisuus (Hj-indeksi) johdetaan MS/MS-esiasteiden runsaudesta käyttämällä MS/MS-frekvenssijakauman Shannonin entropiaa seuraavalla Martínezin ym. (8) kuvaamalla yhtälöllä. Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij), jossa Pij vastaa i:nnen MS/MS:n suhteellista frekvenssiä j:nnessä näytteessä (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
Metabolinen spesifisyys (Si-indeksi) määritellään tietyn MS/MS:n ilmentymisen identtisyytenä suhteessa tarkasteltavien näytteiden väliseen esiintymistiheyteen. MS/MS-spesifisyys lasketaan seuraavasti: Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Käytä seuraavaa kaavaa mitataksesi kunkin j näytteen metabolomikohtaisen δj-indeksin ja MS/MS-spesifisyyden keskiarvon δj = ∑i = 1mPijSi
MS/MS-spektrit kohdistetaan pareittain, ja samankaltaisuus lasketaan näiden kahden pistemäärän perusteella. Ensin käytetään standardi-NDP-menetelmää (tunnetaan myös kosinikorrelaatiomenetelmänä) ja pisteytetään spektrien segmenttien samankaltaisuus seuraavalla yhtälöllä: NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2, jossa S1 ja S2 Vastaavasti spektreille 1 ja 2 sekä WS1:lle, i:lle ja WS2:lle i edustaa painoarvoa, joka perustuu huippuintensiteettiin, jossa i:nnen yhteisen piikin ero kahden spektrin välillä on alle 0,01 Da. Painotus lasketaan seuraavasti: W = [huippuintensiteetti] m [laatu] n, m = 0,5, n = 2, MassBankin ehdottamalla tavalla.
Toisessa pisteytysmenetelmässä analysoitiin MS/MS-menetelmien välistä yhteistä NL-listaa. Tätä varten käytimme samanaikaisesti 52 NL-listaa, joita usein kohdataan MS-fragmentointiprosessin aikana, sekä tarkempaa NL-listaa (datatiedosto S1), joka on aiemmin annotoitu heikennettyjen Nepenthes-lajien sekundaaristen metaboliittien MS/MS-spektrille (9, 26). Luotiin binäärivektori, jossa on 1 ja 0, joka vastaa vastaavasti jonkin NL:n nykyistä ja olematonta arvoa. Euklidisen etäisyyssamankaltaisuuden perusteella lasketaan NL-samankaltaisuuspistemäärä jokaiselle binääri-NL-vektoriparille.
Kaksoisklusterointiin käytimme R-pakettia DiffCoEx, joka perustuu Weighted Gene Co-expression Analysis (WGCNA) -laajennukseen. Käytimme MS/MS-spektrien NDP- ja NL-pisteytysmatriiseja ja laskimme vertailevan korrelaatiomatriisin DiffCoEx-paketilla. Binääriklusterointi suoritetaan asettamalla ”cutreeDynamic”-parametrin arvoksi method = ”hybrid”, cutHeight = 0.9999, deepSplit = T ja minClusterSize = 10. DiffCoEx-paketin R-lähdekoodin latasivat Tesson et al. (57) lisätiedostosta 1; Vaadittava R WGCNA -ohjelmistopaketti löytyy osoitteesta https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
MS/MS-molekyyliverkostoanalyysin suorittamiseksi laskimme paritetun spektraalisen kytkeytyvyyden NDP- ja NL-samankaltaisuustyyppien perusteella ja visualisoimme verkoston topologian CyFilescape-ohjelmistolla orgaanisen asettelun avulla CyFilescape yFiles -asettelualgoritmilaajennussovelluksessa.
Käytä R-versiota 3.0.1 tilastolliseen analyysiin. Tilastollinen merkitsevyys arvioitiin kaksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA), jota seurasi Tukeyn rehellisesti merkitsevän eron (HSD) post-hoc -testi. Kasvinsyöjäkäsittelyn ja kontrollin välisen eron analysoimiseksi analysoitiin kahden saman varianssin omaavan näyteryhmän kaksisuuntainen jakauma Studentin t-testillä.
Tämän artikkelin lisämateriaaleja on osoitteessa http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Tämä on avoimen saatavuuden artikkeli, joka on jaettu Creative Commons Nimeä-EiKaupallinen -lisenssin ehtojen mukaisesti. Tämä lisenssi sallii käytön, jakelun ja kopioinnin missä tahansa mediassa, kunhan lopullinen käyttö ei ole kaupallista hyötyä varten ja lähtökohtana on, että alkuperäinen teos on oikein. Viite.
Huomautus: Pyydämme sinua antamaan sähköpostiosoitteesi vain, jotta sivulle suosittelemasi henkilö tietää, että haluat hänen näkevän sähköpostin ja että se ei ole roskapostia. Emme tallenna sähköpostiosoitteita.
Tätä kysymystä käytetään testaamaan, oletko vierailija, ja estämään automaattinen roskapostin lähetys.
Informaatioteoria tarjoaa universaalin valuutan erityisten metabolomien vertailuun ja testipuolustusteorioiden ennustamiseen.
Informaatioteoria tarjoaa universaalin valuutan erityisten metabolomien vertailuun ja testipuolustusteorioiden ennustamiseen.
©2021 American Association for the Advanced of Science. kaikki oikeudet pidätetään. AAAS on HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ja COUNTER kumppani. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.