Olemme aiemmin raportoineet, että suolistosta peräisin olevan tryptofaanimetaboliitin indoli-3-propionihapon (IPA) seerumipitoisuudet ovat alhaisemmat maksafibroosia sairastavilla potilailla. Tässä tutkimuksessa tutkimme transkriptomia ja DNA-metylomia lihavissa maksoissa suhteessa seerumin IPA-pitoisuuksiin sekä IPA:n roolia maksan tähtisolusolujen (HSC) fenotyyppisen inaktivaation indusoinnissa in vitro.
Tutkimukseen osallistui 116 lihavaa potilasta, joilla ei ollut tyypin 2 diabetesta (T2DM) (ikä 46,8 ± 9,3 vuotta; painoindeksi: 42,7 ± 5,0 kg/m²), joille tehtiin lihavuusleikkaus Kuopion lihavuuskirurgian keskuksessa (KOBS). Verenkierrossa olevan IPA:n pitoisuudet mitattiin nestekromatografia-massaspektrometrialla (LC-MS), maksan transkriptomianalyysi suoritettiin kokonais-RNA-sekvensoinnilla ja DNA:n metylaatioanalyysi Infinium HumanMethylation450 BeadChip -sirulla. In vitro -kokeissa käytettiin ihmisen maksan stellaattisoluja (LX-2).
Seerumin IPA-tasot korreloivat maksan apoptoosiin, mitofagisuuteen ja pitkäikäisyyteen liittyvien geenien ilmentymisen kanssa. AKT-seriini/treoniinikinaasi 1 (AKT1) -geeni oli runsain ja hallitsevin vuorovaikutuksessa oleva geeni maksan transkripti- ja DNA-metylaatioprofiileissa. IPA-hoito indusoi apoptoosia, vähensi mitokondriaalista hengitystä ja muutti solumorfologiaa ja mitokondrioiden dynamiikkaa moduloimalla LX-2-solujen fibroosia, apoptoosia ja eloonjäämistä säätelevien geenien ilmentymistä.
Yhdessä nämä tiedot tukevat sitä, että IPA:lla on potentiaalisia terapeuttisia vaikutuksia ja että se voi indusoida apoptoosia ja siirtää HSC-fenotyyppiä inaktiiviseen tilaan, mikä laajentaa maksafibroosin estämisen mahdollisuutta häiritsemällä HSC-aktivaatiota ja mitokondrioiden aineenvaihduntaa.
Lihavuuden ja metabolisen oireyhtymän esiintyvyys on yhdistetty metaboliseen rasvamaksaan (MASLD) liittyvän sairauden yleistymiseen; sairaus vaikuttaa 25–30 prosenttiin väestöstä [1]. MASLD:n etiologian pääasiallinen seuraus on maksafibroosi, dynaaminen prosessi, jolle on ominaista sidekudoksen solunulkoisen matriisin (ECM) jatkuva kertyminen [2]. Tärkeimmät maksafibroosiin osallistuvat solut ovat maksan tähtisolut (HSC:t), joilla on neljä tunnettua fenotyyppiä: lepotilassa olevat, aktivoituneet, inaktivoituneet ja ikääntyvät [3, 4]. HSC:t voivat aktivoitua ja transdifferentioitua lepotilasta proliferatiivisiksi fibroblastien kaltaisiksi soluiksi, joilla on suuri energiankulutus ja lisääntynyt α-sileän lihaksen aktiinin (α-SMA) ja tyypin I kollageenin (Col-I) ilmentyminen [5, 6]. Maksafibroosin palautumisen aikana aktivoituneet HSC:t eliminoituvat apoptoosin tai inaktivaation kautta. Näihin prosesseihin kuuluvat fibrogeenisten geenien alasääntely ja prosurvival-geenien (kuten NF-κB- ja PI3K/Akt-signalointireittien) modulointi [7, 8], sekä muutokset mitokondrioiden dynamiikassa ja toiminnassa [9].
Tryptofaanimetaboliitin indoli-3-propionihapon (IPA) seerumipitoisuuksien on havaittu laskevan suolistossa esiintyvissä aineenvaihduntasairauksissa, kuten MASLD:ssä [10–13]. IPA liittyy ravintokuidun saantiin, se tunnetaan antioksidanttisista ja tulehdusta ehkäisevistä vaikutuksistaan, ja se heikentää ruokavalion aiheuttamaa alkoholitonta steatohepatiittia (NASH) sekä in vivo että in vitro [11–14]. Jonkin verran näyttöä on peräisin aiemmasta tutkimuksestamme, joka osoitti, että seerumin IPA-pitoisuudet olivat alhaisemmat maksafibroosia sairastavilla potilailla kuin lihavilla potilailla, joilla ei ollut maksafibroosia Kuopion bariatriakirurgian tutkimuksessa (KOBS). Lisäksi osoitimme, että IPA-hoito voi vähentää sellaisten geenien ilmentymistä, jotka ovat klassisia soluadheesion, solujen migraation ja hematopoieettisten kantasolujen aktivaation markkereita ihmisen maksan tähtisolumallissa (LX-2) ja on mahdollinen maksansuojaava metaboliitti [15]. On kuitenkin edelleen epäselvää, miten IPA indusoi maksafibroosin regressiota aktivoimalla HSC-apoptoosia ja mitokondrioiden bioenergetiikkaa.
Tässä tutkimuksessa osoitamme, että seerumin IPA liittyy apoptoosiin, mitofagiaan ja pitkäikäisyysreitteihin rikastuneiden geenien ilmentymiseen lihavien, mutta ei tyypin 2 diabetesta (KOBS) sairastavien henkilöiden maksassa. Lisäksi havaitsimme, että IPA voi indusoida aktivoituneiden hematopoieettisten kantasolujen (HSC) poistumista ja hajoamista inaktivaatioreitin kautta. Nämä tulokset paljastavat IPA:lle uuden roolin, mikä tekee siitä potentiaalisen terapeuttisen kohteen maksafibroosin regression edistämiseksi.
Aiempi KOBS-kohortissa tehty tutkimus osoitti, että maksafibroosia sairastavilla potilailla oli alhaisemmat IPA-pitoisuudet verenkierrossa verrattuna potilaisiin, joilla ei ollut maksafibroosia [15]. Tyypin 2 diabeteksen mahdollisen sekoittavan vaikutuksen poissulkemiseksi rekrytoimme tutkimuspopulaatioksi 116 lihavaa potilasta, joilla ei ollut tyypin 2 diabetesta (keski-ikä ± keskihajonta: 46,8 ± 9,3 vuotta; painoindeksi: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (taulukko 1) meneillään olevasta KOBS-tutkimuksesta [16]. Kaikki osallistujat antoivat kirjallisen suostumuksensa tutkimukseen, ja Pohjois-Savon lääninsairaalan eettinen toimikunta hyväksyi tutkimusprotokollan Helsingin julistuksen (54/2005, 104/2008 ja 27/2010) mukaisesti.
Maksabiopsianäytteet otettiin lihavuusleikkauksen aikana, ja kokeneet patologit arvioivat ne histologisesti aiemmin kuvattujen kriteerien mukaisesti [17, 18]. Arviointikriteerit on esitetty yhteenvetona lisätaulukossa S1 ja ne on kuvattu aiemmin [19].
Paastosta otetut seeruminäytteet analysoitiin kohdentamattomalla nestekromatografia-massaspektrometrialla (LC-MS) metabolomiikka-analyysiä varten (n = 116). Näytteet analysoitiin UHPLC-qTOF-MS-järjestelmällä (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Saksa) aiemmin kuvatulla tavalla19. Isopropyylialkoholin (IPA) tunnistaminen perustui retentioaikaan ja MS/MS-spektrin vertailuun puhtaisiin standardeihin. IPA-signaalin intensiteetti (piikin pinta-ala) otettiin huomioon kaikissa jatkoanalyyseissä [20].
Koko maksan RNA-sekvensointi suoritettiin Illumina HiSeq 2500 -laitteella ja tiedot esikäsiteltiin aiemmin kuvatulla tavalla [19, 21, 22]. Suoritimme kohdennetun mitokondrioiden toimintaan/biogeneesiin vaikuttavien transkriptien differentiaalisen ilmentymisen analyysin käyttämällä 1957 geeniä, jotka valittiin MitoMiner 4.0 -tietokannasta [23]. Maksan DNA:n metylaatioanalyysi suoritettiin käyttämällä Infinium HumanMethylation450 BeadChip -mikropiiriä (Illumina, San Diego, CA, USA) käyttäen samaa menetelmää kuin aiemmin on kuvattu [24, 25].
Ihmisen maksan stellaattisolut (LX-2) saatiin ystävällisesti professori Stefano Romeolta, ja niitä viljeltiin ja ylläpidettiin DMEM/F12-elatusaineessa (Biowest, L0093-500, 1 % Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2 % FBS; Gibco, 10270-106). IPA:n käyttöannoksen valitsemiseksi LX-2-soluja käsiteltiin eri IPA-pitoisuuksilla (10 μM, 100 μM ja 1 mM; Sigma, 220027) DMEM/F12-elatusaineessa 24 tunnin ajan. Lisäksi IPA:n kyvyn tutkimiseksi inaktivoida HSC-soluja LX-2-soluja käsiteltiin yhdessä 5 ng/ml TGF-β1:llä (R&D systems, 240-B-002/CF) ja 1 mM IPA:lla seerumittomassa elatusaineessa 24 tunnin ajan. Vastaavina vehikkelikontrolleina TGF-β1-käsittelyyn käytettiin 4 nM HCl:ää, joka sisälsi 0,1 % BSA:ta, ja IPA-käsittelyyn 0,05 % DMSO:ta, ja molempia käytettiin yhdessä yhdistelmäkäsittelyssä.
Apoptoosia arvioitiin käyttämällä FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit -pakkausta ja 7-AAD:tä (Biolegend, San Diego, CA, USA, tuotenro 640922) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti sanottuna LX-2-soluja (1 × 105 solua/kuoppa) viljeltiin yön yli 12-kuoppalevyillä ja käsiteltiin sitten useilla IPA-annoksilla tai IPA:lla ja TGF-β1:llä. Seuraavana päivänä kelluvat ja kiinnittyneet solut kerättiin, trypsinoitiin, pestiin PBS:llä, suspendoitiin uudelleen anneksiini V:tä sitovaan puskuriin ja inkuboitiin FITC-anneksiini V:n ja 7-AAD:n kanssa 15 minuuttia.
Elävien solujen mitokondriot värjättiin oksidatiivisen aktiivisuuden varalta Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) -värillä (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). MTR-määrityksiä varten LX-2-soluja inkuboitiin yhtä suurilla tiheyksillä IPA:n ja TGF-β1:n kanssa. 24 tunnin kuluttua elävät solut trypsinoitiin, pestiin PBS:llä ja inkuboitiin sitten 100 μM MTR:n kanssa seerumittomassa elatusaineessa 37 °C:ssa 20 minuutin ajan aiemmin kuvatulla tavalla [26]. Elävien solujen morfologia-analyysissä solujen kokoa ja sytoplasman kompleksisuutta analysoitiin käyttämällä eteenpäin sirontaa (FSC) ja sivusirontaparametreja (SSC).
Kaikki tiedot (30 000 tapahtumaa) hankittiin NovoCyte Quanteonilla (Agilent) ja analysoitiin NovoExpress® 1.4.1- tai FlowJo V.10 -ohjelmistolla.
Hapenkulutusnopeus (OCR) ja solunulkoinen happamoitumisnopeus (ECAR) mitattiin reaaliajassa Seahorse Extracellular Flux Analyzer -laitteella (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), joka oli varustettu Seahorse XF Cell Mito Stress -laitteella valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti sanottuna, 2 × 104 LX-2-solua/kuoppa kylvettiin XF96-soluviljelylevyille. Yön yli inkuboinnin jälkeen solut käsiteltiin isopropanolilla (IPA) ja TGF-β1:llä (lisämenetelmät 1). Data-analyysi suoritettiin Seahorse XF Wave -ohjelmistolla, joka sisältää Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator -ohjelmiston. Tästä laskettiin bioenergeettinen terveysindeksi (BHI) [27].
Kokonais-RNA transkriptoitiin cDNA:ksi. Tarkemmat menetelmät löytyvät viitteestä [15]. Konstitutiivisina geenikontrolleina käytettiin ihmisen 60S ribosomaalisen happaman proteiinin P0 (RPLP0) ja syklofiliini A1:n (PPIA) mRNA-tasoja. QuantStudio 6 pro Real-Time PCR -järjestelmää (Thermo Fisher, Landsmeer, Alankomaat) käytettiin TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kitin (Applied Biosystems) tai Sensifast SYBR Lo-ROX Kitin (Bioline, BIO 94050) kanssa, ja suhteellinen geenien ilmentymiskerroin laskettiin käyttämällä vertailevia Ct-arvon sykliparametreja (ΔΔCt) ja ∆∆Ct-menetelmää. Alukkeiden tiedot on esitetty lisätaulukoissa S2 ja S3.
Ydin-DNA (ncDNA) ja mitokondrio-DNA (mtDNA) eristettiin DNeasy-veri- ja kudospakkauksella (Qiagen) aiemmin kuvatulla tavalla [28]. Mitokondriaalisen DNA:n suhteellinen määrä laskettiin laskemalla kunkin kohde-mtDNA-alueen suhde kolmen ydin-DNA-alueen geometriseen keskiarvoon (mtDNA/ncDNA), kuten on yksityiskohtaisesti kuvattu lisämenetelmissä 2. Yksityiskohdat mitokondriaalisen DNA:n ja ncDNA:n alukkeista on esitetty lisätaulukossa S4.
Elävät solut värjättiin Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) -värillä (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) solujen välisten ja solunsisäisten mitokondrioverkostojen visualisoimiseksi. LX-2-soluja (1 × 104 solua/kuoppa) viljeltiin lasilevyillä vastaavissa lasipohjaisissa viljelylevyissä (Ibidi GmbH, Martinsried, Saksa). 24 tunnin kuluttua eläviä LX-2-soluja inkuboitiin 100 μM MTR:n kanssa 20 minuuttia 37 °C:ssa ja solujen tumat värjättiin DAPI:lla (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) aiemmin kuvatulla tavalla [29]. Mitokondrioverkostot visualisoitiin käyttämällä Zeiss Axio Observer -käänteismikroskooppia (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Saksa), joka oli varustettu Zeiss LSM 800 -konfokaalimoduulilla, 37 °C:ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5 % CO2:ta, käyttäen 63×NA 1,3 -objektiivia. Otimme kymmenen Z-sarjan kuvaa jokaisesta näytetyypistä. Jokainen Z-sarja sisältää 30 leikettä, joiden paksuus on 9,86 μm. Jokaisesta näytteestä otettiin kuvat kymmenestä eri näkökentästä ZEN 2009 -ohjelmistolla (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Saksa), ja mitokondrioiden morfologia-analyysi suoritettiin ImageJ-ohjelmistolla (v1.54d) [30, 31] lisämenetelmissä 3 yksityiskohtaisesti kuvattujen parametrien mukaisesti.
Solut fiksoitiin 2 % glutaraldehydillä 0,1 M fosfaattipuskurissa, minkä jälkeen ne fiksoitiin 1 % osmiumtetroksidiliuoksella (Sigma Aldrich, MO, USA), kuivattiin vähitellen asetonilla (Merck, Darmstadt, Saksa) ja lopuksi upotettiin epoksihartsiin. Valmistettiin erittäin ohuita leikkeitä, jotka värjättiin 1 % uranyyliasetaatilla (Merck, Darmstadt, Saksa) ja 1 % lyijysitraatilla (Merck, Darmstadt, Saksa). Ultrastruktuurikuvat saatiin käyttämällä JEM 2100F EXII -transmissioelektronimikroskooppia (JEOL Ltd, Tokio, Japani) 80 kV:n kiihtyvyysjännitteellä.
IPA:lla 24 tunnin ajan käsiteltyjen LX-2-solujen morfologiaa analysoitiin faasikontrastimikroskopialla 50-kertaisella suurennuksella käyttäen Zeissin käänteisvalomikroskooppia (Zeiss Axio Vert.A1 ja AxioCam MRm, Jena, Saksa).
Kliiniset tiedot ilmaistiin keskiarvona ± keskihajonta tai mediaanina (kvartiilien välinen alue: IQR). Kolmen tutkimusryhmän välisten erojen vertailemiseen käytettiin yksisuuntaista varianssianalyysia (jatkuvat muuttujat) tai χ²-testiä (kategoriset muuttujat). Väärien positiivisten tulosten osuutta (FDR) käytettiin korjaamaan useiden testien vaikutus, ja geenejä, joiden FDR oli < 0,05, pidettiin tilastollisesti merkitsevinä. Spearmanin korrelaatioanalyysia käytettiin CpG-DNA:n metylaation korreloimiseen IPA-signaalin intensiteetin kanssa, ja raportoitiin nimelliset p-arvot (p < 0,05).
Polkuanalyysi suoritettiin käyttämällä verkkopohjaista geenijoukkoanalyysityökalua (WebGestalt) 268 transkriptille (nimellinen p < 0,01), 119 mitokondrioihin liittyvälle transkriptille (nimellinen p < 0,05) ja 4350 CpG:lle 3093 maksatranskriptista, jotka liittyivät verenkierrossa olevaan seerumin IPA-tasoon. Vapaasti saatavilla olevaa Venny DB (versio 2.1.0) -työkalua käytettiin päällekkäisten geenien löytämiseen ja StringDB:tä (versio 11.5) käytettiin proteiini-proteiini-vuorovaikutusten visualisointiin.
LX-2-kokeessa näytteiden normaalius testattiin D'Agostino-Pearson-testillä. Tiedot saatiin vähintään kolmesta biologisesta toistosta ja niille tehtiin yksisuuntainen ANOVA Bonferroni post hoc -testillä. Alle 0,05:n p-arvoa pidettiin tilastollisesti merkitsevänä. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta, ja kokeiden lukumäärä on ilmoitettu kussakin kuvassa. Kaikki analyysit ja kaaviot tehtiin käyttämällä GraphPad Prism 8 -tilasto-ohjelmistoa Windowsille (GraphPad Software Inc., versio 8.4.3, San Diego, USA).
Ensin tutkimme seerumin IPA-tasojen yhteyttä maksan, koko kehon ja mitokondrioiden transkripteihin. Kokonaistranskriptiprofiilissa voimakkaimmin seerumin IPA-tasoihin liittyvä geeni oli MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; mitogeeniaktivoitu proteiinikinaasi-aktivoitu proteiinikinaasi 3); mitokondrioihin liittyvässä transkriptiprofiilissa voimakkaimmin liittyvä geeni oli AKT1 (FDR = 0,7621; AKT seriini/treoniinikinaasi 1) (lisätiedosto 1 ja lisätiedosto 2).
Analysoimme sitten globaaleja transkripteja (n = 268; p < 0,01) ja mitokondrioihin liittyviä transkripteja (n = 119; p < 0,05) ja tunnistimme lopulta apoptoosin merkittävimmäksi kanoniseksi signalointireitiksi (p = 0,0089). Seerumin IPA-tasoihin liittyvien mitokondrioiden transkriptien osalta keskityimme apoptoosiin (FDR = 0,00001), mitofagiaan (FDR = 0,00029) ja TNF-signalointireitteihin (FDR = 0,000006) (kuva 1A, taulukko 2 ja lisäkuvat 1A-B).
Globaalien, mitokondrioihin liittyvien transkriptien ja DNA:n metylaation päällekkäisyysanalyysi ihmisen maksassa suhteessa seerumin IPA-tasoihin. A edustaa 268 globaalia transkriptia, 119 mitokondrioihin liittyvää transkriptia ja DNA:n metylaatiota sisältäviä transkripteja, jotka on kartoitettu 3092 CpG-kohtaan, jotka liittyvät seerumin IPA-tasoihin (p-arvot < 0,01 globaaleille transkripteille ja metyloidulle DNA:lle ja p-arvot < 0,05 mitokondrioiden transkripteille). Tärkeimmät päällekkäiset transkriptit on esitetty keskellä (AKT1 ja YKT6). B Niiden 13 geenin vuorovaikutuskartta, joilla on korkein vuorovaikutuspistemäärä (0,900) muiden geenien kanssa, konstruoitiin 56 päällekkäisestä geenistä (musta viiva -alue), jotka liittyivät merkittävästi seerumin IPA-tasoihin, käyttämällä StringDB-verkkotyökalua. Vihreä: Geenit, jotka on kartoitettu Gene Ontology (GO) -solukomponenttiin: mitokondriot (GO:0005739). AKT1 on proteiini, jolla on korkein pistemäärä (0,900) vuorovaikutuksista muiden proteiinien kanssa datan perusteella (perustuu tekstinlouhintaan, kokeisiin, tietokantoihin ja yhteisilmentymiseen). Verkkosolmut edustavat proteiineja ja reunat edustavat proteiinien välisiä yhteyksiä.
Koska suoliston mikrobiotan metaboliitit voivat säädellä epigeneettistä koostumusta DNA-metylaation kautta [32], tutkimme, oliko seerumin IPA-tasoilla yhteyttä maksan DNA-metylaatioon. Havaitsimme, että kaksi tärkeintä seerumin IPA-tasoihin liittyvää metylaatiokohtaa olivat lähellä proliini-seriinipitoista aluetta 3 (C19orf55) ja lämpöshokkiproteiiniperheen B (pieni) jäsentä 6 (HSPB6) (lisätiedosto 3). 4350 CpG:n DNA-metylaatio (p < 0,01) korreloi seerumin IPA-tasojen kanssa ja oli rikastettu pitkäikäisyyttä säätelevillä reiteillä (p = 0,006) (kuva 1A, taulukko 2 ja lisäkuva 1C).
Ymmärtääksemme seerumin IPA-tasojen, globaalien transkriptien, mitokondrioihin liittyvien transkriptien ja ihmisen maksan DNA-metylaation välisten yhteyksien taustalla olevia biologisia mekanismeja suoritimme päällekkäisyysanalyysin edellisessä reittianalyysissä tunnistetuista geeneistä (kuva 1A). 56 päällekkäisen geenin (mustan viivan sisällä kuvassa 1A) reittien rikastusanalyysin tulokset osoittivat, että apoptoosireitti (p = 0,00029) korosti kahta geeniä, jotka olivat yhteisiä kolmelle analyysille: AKT1 ja YKT6 (YKT6 v-SNARE homologi), kuten Venn-diagrammi (lisäkuva 2 ja kuva 1A) osoittaa. Mielenkiintoista kyllä, havaitsimme, että AKT1 (cg19831386) ja YKT6 (cg24161647) korreloivat positiivisesti seerumin IPA-tasojen kanssa (lisätiedosto 3). Geenituotteiden välisten mahdollisten proteiinivuorovaikutusten tunnistamiseksi valitsimme 56 päällekkäisen geenin joukosta 13 geeniä, joilla oli korkein yhteisen alueen pisteytys (0,900), ja laadimme vuorovaikutuskartan. Luottamustason (marginaalisen luotettavuuden) mukaan korkeimman pistemäärän (0,900) saanut AKT1-geeni oli ylimmällä (kuva 1B).
Reittianalyysin perusteella havaitsimme, että apoptoosi oli tärkein reitti, joten tutkimme, vaikuttaisiko IPA-käsittely HSC-solujen apoptoosiin in vitro. Olimme aiemmin osoittaneet, että eri IPA-annokset (10 μM, 100 μM ja 1 mM) eivät olleet toksisia LX-2-soluille [15]. Tämä tutkimus osoitti, että IPA-käsittely pitoisuuksina 10 μM ja 100 μM lisäsi elinkelpoisten ja nekroottisten solujen määrää. Verrattuna kontrolliryhmään solujen elinkelpoisuus kuitenkin laski 1 mM IPA-pitoisuudella, kun taas solunekroosinopeus pysyi muuttumattomana (kuva 2A, B). Seuraavaksi, löytääksemme optimaalisen pitoisuuden apoptoosin indusoimiseksi LX-2-soluissa, testasimme 10 μM, 100 μM ja 1 mM IPA-pitoisuuksia 24 tunnin ajan (kuva 2A-E ja lisäkuva 3A-B). Mielenkiintoista kyllä, IPA 10 μM ja 100 μM laskivat apoptoosin nopeutta (%), mutta IPA 1 mM lisäsi myöhäistä apoptoosia ja apoptoosin nopeutta (%) kontrolliin verrattuna, ja siksi se valittiin jatkokokeisiin (kuvat 2A–D).
IPA indusoi LX-2-solujen apoptoosin. Apoptoottisen nopeuden ja solumorfologian kvantifiointiin virtaussytometrialla käytettiin Annexin V- ja 7-AAD-kaksoisvärjäysmenetelmää. BA-soluja inkuboitiin 10 μM:n, 100 μM:n ja 1 mM:n IPA:n kanssa 24 tuntia tai F–H TGF-β1:n (5 ng/ml) ja 1 mM IPA:n kanssa seerumittomassa elatusaineessa 24 tuntia. A: elävät solut (Annexin V -/ 7AAD-); B: nekroottiset solut (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: varhainen (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: myöhäinen (Annexin V+/7AAD.+); E, H: varhaisten ja myöhäisten apoptoottisten solujen kokonaismäärän prosenttiosuus apoptoosinopeudesta (%). Tiedot on ilmaistu keskiarvona ± keskihajonta, n = 3 riippumatonta koetta. Tilastolliset vertailut tehtiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVAa ja Bonferroni post hoc -testiä. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Kuten olemme aiemmin osoittaneet, 5 ng/ml TGF-β1 voi indusoida HSC-aktivaatiota lisäämällä klassisten markkerigeenien ilmentymistä [15]. LX-2-soluja käsiteltiin 5 ng/ml TGF-β1:llä ja 1 mM IPA:lla yhdessä (kuva 2E–H). TGF-β1-käsittely ei muuttanut apoptoosin nopeutta, mutta IPA-yhteiskäsittely lisäsi myöhäistä apoptoosia ja apoptoosin nopeutta (%) verrattuna TGF-β1-käsittelyyn (kuva 2E–H). Nämä tulokset osoittavat, että 1 mM IPA voi edistää apoptoosia LX-2-soluissa TGF-β1-induktiosta riippumatta.
Tutkimme edelleen IPA:n vaikutusta mitokondriaaliseen hengitykseen LX-2-soluissa. Tulokset osoittivat, että 1 mM IPA laski hapenkulutusnopeutta (OCR) kuvaavia parametreja: ei-mitokondriaalista hengitystä, perus- ja maksimaalista hengitystä, protonivuotoa ja ATP-tuotantoa verrattuna kontrolliryhmään (kuva 3A, B), kun taas bioenergeettisen terveyden indeksi (BHI) ei muuttunut.
IPA vähentää mitokondriaalista hengitystä LX-2-soluissa. Mitokondriaalista hengityskäyrää (OCR) esitetään mitokondriaalisen hengityksen parametreina (ei-mitokondriaalinen hengitys, perushengitys, maksimaalinen hengitys, protonivuoto, ATP:n muodostuminen, SRC ja BHI). Soluja A ja B inkuboitiin vastaavasti 10 μM:n, 100 μM:n ja 1 mM:n IPA:n kanssa 24 tuntia. Soluja C ja D inkuboitiin TGF-β1:n (5 ng/ml) ja 1 mM:n IPA:n kanssa seerumittomassa elatusaineessa 24 tuntia. Kaikki mittaukset normalisoitiin DNA-pitoisuuteen käyttämällä CyQuant-pakkausta. BHI: bioenergeettinen terveysindeksi; SRC: hengitysreservikapasiteetti; OCR: hapenkulutusnopeus. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta (SD), n = 5 riippumatonta koetta. Tilastolliset vertailut tehtiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVAa ja Bonferroni post hoc -testiä. *p < 0,05; **p < 0,01; ja ***p < 0,001
Saadaksemme kattavamman ymmärryksen IPA:n vaikutuksesta TGF-β1:n aktivoimien LX-2-solujen bioenergeettiseen profiiliin, analysoimme mitokondrioiden oksidatiivista fosforylaatiota OCR:llä (kuva 3C, D). Tulokset osoittivat, että TGF-β1-hoito voi vähentää maksimaalista hengitystä, hengitysreservikapasiteettia (SRC) ja BHI:tä verrattuna kontrolliryhmään (kuva 3C, D). Lisäksi yhdistelmähoito vähensi basaalista hengitystä, protonivuotoa ja ATP-tuotantoa, mutta SRC ja BHI olivat merkitsevästi korkeammat kuin TGF-β1:llä hoidetuilla (kuva 3C, D).
Suoritimme myös Seahorse-ohjelmiston tarjoaman ”Cellular Energy Phenotype Test” -testin (lisäkuva 4A–D). Kuten lisäkuvassa 3B on esitetty, sekä OCR:n että ECAR:n metabolinen potentiaali laski TGF-β1-hoidon jälkeen, mutta yhdistelmä- ja IPA-hoitoryhmissä ei havaittu eroa kontrolliryhmään verrattuna. Lisäksi sekä OCR:n perustasot että stressitasot laskivat yhdistelmä- ja IPA-hoidon jälkeen verrattuna kontrolliryhmään (lisäkuva 4C). Mielenkiintoista on, että samanlainen kuvio havaittiin yhdistelmähoidossa, jossa ECAR:n perustasoissa ja stressitasoissa ei havaittu muutosta TGF-β1-hoitoon verrattuna (lisäkuva 4C). HSC-soluissa mitokondrioiden oksidatiivisen fosforylaation väheneminen ja yhdistelmähoidon kyky palauttaa SCR ja BHI TGF-β1-hoidon jälkeen eivät muuttaneet metabolista potentiaalia (OCR ja ECAR). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että IPA saattaa vähentää bioenergetiikkaa HSC-soluissa, mikä viittaa siihen, että IPA voi indusoida alhaisemman energeettisen profiilin, joka siirtää HSC-fenotyyppiä kohti inaktivaatiota (lisäkuva 4D).
IPA:n vaikutusta mitokondrioiden dynamiikkaan tutkittiin käyttämällä mitokondrioiden morfologian ja verkostoyhteyksien kolmiulotteista kvantifiointia sekä MTR-värjäystä (kuva 4 ja lisäkuva 5). Kuva 4 osoittaa, että kontrolliryhmään verrattuna TGF-β1-käsittely pienensi keskimääräistä pinta-alaa, haarojen lukumäärää, haarojen kokonaispituutta ja haarojen liitoskohtien lukumäärää (kuva 4A ja B) ja muutti mitokondrioiden osuuden pallomaisesta keskimääräiseen morfologiaan (kuva 4C). Vain IPA-käsittely pienensi keskimääräistä mitokondrioiden tilavuutta ja muutti mitokondrioiden osuuden pallomaisesta keskimääräiseen morfologiaan verrattuna kontrolliryhmään (kuva 4A). Sitä vastoin pallomaisuus, keskimääräinen haarojen pituus ja mitokondrioiden aktiivisuus, arvioituna mitokondrioiden kalvopotentiaalista riippuvalla MTR:llä (kuva 4A ja E), pysyivät muuttumattomina, eivätkä nämä parametrit eronneet ryhmien välillä. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että TGF-β1- ja IPA-käsittely näyttävät moduloivan mitokondrioiden muotoa ja kokoa sekä verkoston monimutkaisuutta elävissä LX-2-soluissa.
IPA muuttaa mitokondrioiden dynamiikkaa ja mitokondrioiden DNA:n runsautta LX-2-soluissa. A. Edustavat konfokaalikuvat elävistä LX-2-soluista, joita on inkuboitu TGF-β1:n (5 ng/ml) ja 1 mM IPA:n kanssa 24 tunnin ajan seerumittomassa elatusaineessa, ja jotka osoittavat Mitotracker™ Red CMXRos -värillä värjättyjä mitokondrioverkostoja ja DAPI:lla sinisiksi värjättyjä tumia. Kaikki tiedot sisälsivät vähintään 15 kuvaa ryhmää kohden. Hankimme 10 Z-pino-kuvaa jokaisesta näytetyypistä. Jokainen Z-akselin sekvenssi sisälsi 30 viipaletta, joiden paksuus oli 9,86 μm. Skaalapalkki: 10 μm. B. Edustavat objektit (vain mitokondriot), jotka tunnistettiin soveltamalla kuvaan adaptiivista kynnysarvoa. Mitokondrioiden morfologisten verkostoyhteyksien kvantitatiivinen analyysi ja vertailu suoritettiin kaikille soluille kussakin ryhmässä. C. Mitokondrioiden muotosuhteiden frekvenssi. Arvot lähellä 0:aa osoittavat pallomaisia ​​muotoja ja arvot lähellä 1:tä osoittavat filamenttimuotoja. D Mitokondrioiden DNA:n (mtDNA) pitoisuus määritettiin Materiaalit ja menetelmät -osiossa kuvatulla tavalla. E Mitotracker™ Red CMXRos -analyysi tehtiin virtaussytometrialla (30 000 tapahtumaa) Materiaalit ja menetelmät -osiossa kuvatulla tavalla. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta, n = 3 riippumatonta koetta. Tilastolliset vertailut tehtiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVAa ja Bonferroni post hoc -testiä. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Sitten analysoimme LX-2-solujen mtDNA-pitoisuutta mitokondrioiden lukumäärän indikaattorina. Verrattuna kontrolliryhmään, mtDNA-pitoisuus oli kohonnut TGF-β1-käsitellyssä ryhmässä (kuva 4D). Verrattuna TGF-β1-käsiteltyyn ryhmään, mtDNA-pitoisuus oli pienentynyt yhdistelmähoitoryhmässä (kuva 4D), mikä viittaa siihen, että IPA saattaa vähentää mtDNA-pitoisuutta ja mahdollisesti mitokondrioiden lukumäärää sekä mitokondriaalista hengitystä (kuva 3C). Lisäksi IPA näytti vähentävän mtDNA-pitoisuutta yhdistelmähoidossa, mutta ei vaikuttanut MTR-välitteiseen mitokondrioiden aktiivisuuteen (kuvat 4A–C).
Tutkimme IPA:n yhteyttä fibroosiin, apoptoosiin, eloonjäämiseen ja mitokondrioiden dynamiikkaan liittyvien geenien mRNA-tasoihin LX-2-soluissa (kuva 5A–D). Kontrolliryhmään verrattuna TGF-β1-käsitellyssä ryhmässä havaittiin lisääntynyttä geenien, kuten tyypin I kollageenin α2-ketjun (COL1A2), α-sileän lihaksen aktiinin (αSMA), matriksin metalloproteinaasi 2:n (MMP2), metalloproteinaasi 1:n kudosinhibiittorin (TIMP1) ja dynamiini 1:n kaltaisen geenin (DRP1), ilmentymistä, mikä viittaa lisääntyneeseen fibroosiin ja aktivaatioon. Lisäksi kontrolliryhmään verrattuna TGF-β1-käsittely alensi tumallisen pregnaani X -reseptorin (PXR), kaspaasi 8:n (CASP8), MAPKAPK3:n, B-solujen α:n estäjän, tumatekijä κ -geenin kevytpeptidin tehostajan (NFκB1A) ja tumatekijä κB -kinaasialayksikkö β:n estäjän (IKBKB) mRNA-tasoja (kuva 5A–D). Verrattuna TGF-β1-hoitoon, TGF-β1:n ja IPA:n yhdistelmähoito vähensi COL1A2:n ja MMP2:n ilmentymistä, mutta lisäsi PXR:n, TIMP1:n, B-solulymfooma-2:n (BCL-2), CASP8:n, NFκB1A:n, NFκB1-β:n ja IKBKB:n mRNA-tasoja. IPA-hoito vähensi merkittävästi MMP2:n, Bcl-2-associated protein X:n (BAX), AKT1:n, optikusnärsykkeen surkastumisproteiini 1:n (OPA1) ja mitokondriaalisen fuusioproteiini 2:n (MFN2) ilmentymistä, kun taas CASP8:n, NFκB1A:n, NFκB1B:n ja IKBKB:n ilmentyminen lisääntyi verrattuna kontrolliryhmään. Kaspaasi-3:n (CASP3), apoptoottisen peptidaasin aktivoivan tekijän 1 (APAF1), mitokondriaalisen fuusioproteiinin 1 (MFN1) ja fissioproteiinin 1 (FIS1) ilmentymisessä ei kuitenkaan havaittu eroa. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että IPA-hoito moduloi fibroosiin, apoptoosiin, eloonjäämiseen ja mitokondrioiden dynamiikkaan liittyvien geenien ilmentymistä. Datamme viittaavat siihen, että IPA-hoito vähentää fibroosia LX-2-soluissa; samalla se stimuloi eloonjäämistä muuttamalla fenotyyppiä inaktivoitumisen suuntaan.
IPA moduloi fibroblastien, apoptoosin, elinkykyisyyden ja mitokondrioiden dynamiikan geenien ilmentymistä LX-2-soluissa. Histogrammit näyttävät mRNA:n ilmentymisen suhteessa endogeeniseen kontrolliin (RPLP0 tai PPIA) sen jälkeen, kun LX-2-soluja indusoitiin TGF-β1:llä ja IPA:lla seerumittomassa elatusaineessa 24 tunnin ajan. A osoittaa fibroblasteja, B osoittaa apoptoottisia soluja, C osoittaa eloonjääneitä soluja ja D osoittaa mitokondrioiden dynamiikan geenien ilmentymistä. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta (SD), n = 3 riippumatonta koetta. Tilastolliset vertailut tehtiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVAa ja Bonferroni post hoc -testiä. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Sitten solukoon (FSC-H) ja sytoplasman kompleksisuuden (SSC-H) muutoksia arvioitiin virtaussytometrialla (kuva 6A, B), ja solumorfologian muutoksia IPA-käsittelyn jälkeen arvioitiin läpäisyelektronimikroskopialla (TEM) ja faasikontrastimikroskopialla (lisäkuva 6A-B). Kuten odotettua, TGF-β1-käsitellyn ryhmän solut kasvoivat kooltaan verrattuna kontrolliryhmään (kuva 6A, B), mikä osoittaa karkean endoplasmisen retikulumin (ER*) ja fagolysosomien (P) klassista laajenemista, mikä viittaa hematopoieettisten kantasolujen (HSC) aktivaatioon (lisäkuva 6A). Kuitenkin verrattuna TGF-β1-käsiteltyyn ryhmään, solukoko, sytoplasman kompleksisuus (kuva 6A, B) ja ER*-pitoisuus olivat pienentyneet TGF-β1- ja IPA-yhdistelmähoitoryhmässä (lisäkuva 6A). Lisäksi IPA-käsittely pienensi solukokoa, sytoplasman kompleksisuutta (kuvat 6A, B), P- ja ER*-pitoisuuksia (lisäkuva 6A) verrattuna kontrolliryhmään. Lisäksi apoptoottisten solujen määrä lisääntyi 24 tunnin IPA-käsittelyn jälkeen verrattuna kontrolliryhmään (valkoiset nuolet, lisäkuva 6B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että 1 mM IPA voi stimuloida HSC-apoptoosin ja kääntää TGF-β1:n aiheuttamat muutokset solujen morfologisissa parametreissa, säädellen siten solujen kokoa ja kompleksisuutta, jotka voivat liittyä HSC-inaktivaatioon.
IPA muuttaa solukokoa ja sytoplasman kompleksisuutta LX-2-soluissa. Virtaussytometria-analyysin edustavia kuvia. Analyysissä käytettiin LX-2-soluille spesifistä tahdistusstrategiaa: SSC-A/FSC-A solupopulaation määrittämiseen, FSC-H/FSC-A dublettien tunnistamiseen ja SSC-H/FSC-H solukoon ja kompleksisuuden analysointiin. Soluja inkuboitiin TGF-β1:n (5 ng/ml) ja 1 mM IPA:n kanssa seerumittomassa elatusaineessa 24 tunnin ajan. LX-2-solut jaettiin vasempaan alakulmaan (SSC-H-/FSC-H-), vasempaan yläkvadranttiin (SSC-H+/FSC-H-), oikeaan alakulmaan (SSC-H-/FSC-H+) ja oikeaan yläkvadranttiin (SSC-H+/FSC-H+) solukoon ja sytoplasman kompleksisuuden analysointia varten. B. Solumorfologia analysoitiin virtaussytometrialla käyttäen FSC-H:ta (eteenpäin sironta, solukoko) ja SSC-H:ta (sivusironta, sytoplasman kompleksisuus) (30 000 tapahtumaa). Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta, n = 3 riippumatonta koetta. Tilastolliset vertailut tehtiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVAa ja Bonferroni post hoc -testiä. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 ja ****p < 0,0001
Suoliston metaboliiteista, kuten IPA:sta, on tullut kuuma tutkimusaihe, mikä viittaa siihen, että suoliston mikrobistosta voidaan löytää uusia kohteita. Siksi on mielenkiintoista, että IPA, metaboliitti, jonka olemme yhdistäneet ihmisten maksafibroosiin [15], on osoitettu olevan potentiaalinen antifibroottinen yhdiste eläinmalleissa [13, 14]. Tässä tutkimuksessa osoitamme ensimmäistä kertaa yhteyden seerumin IPA:n ja maksan globaalin transkriptomiikan ja DNA:n metylaation välillä lihavilla henkilöillä, joilla ei ole tyypin 2 diabetesta (T2D), korostaen apoptoosia, mitofagiaa ja pitkäikäisyyttä sekä mahdollista AKT1-geeniä, joka säätelee maksan homeostaasia. Tutkimuksemme toinen uutuus on se, että osoitimme IPA-hoidon vuorovaikutuksen apoptoosin, solumorfologian, mitokondrioiden bioenergetiikan ja dynamiikan kanssa LX-2-soluissa, mikä viittaa matalamman energian spektriin, joka siirtää HSC-fenotyyppiä kohti inaktivaatiota, mikä tekee IPA:sta potentiaalisen ehdokkaan maksafibroosin parantamiseksi.
Havaitsimme, että apoptoosi, mitofagia ja pitkäikäisyys olivat tärkeimmät kanoniset reitit, joita runsaasti esiintyi maksassa kiertävän seerumin IPA:han liittyvissä geeneissä. Mitokondrioiden laadunvalvontajärjestelmän (MQC) häiriintyminen voi johtaa mitokondrioiden toimintahäiriöihin, mitofagiaan ja apoptoosiin, mikä edistää MASLD:n esiintymistä [33, 34]. Siksi voimme spekuloida, että IPA saattaa olla mukana ylläpitämässä soludynamiikkaa ja mitokondrioiden eheyttä apoptoosin, mitofagian ja pitkäikäisyyden kautta maksassa. Datamme osoittivat, että kaksi geeniä oli yhteisiä kaikissa kolmessa määrityksessä: YKT6 ja AKT1. On syytä huomata, että YKT6 on SNARE-proteiini, joka osallistuu solukalvon fuusioprosessiin. Se osallistuu autofagiaan ja mitofagiaan muodostamalla aloituskompleksin STX17:n ja SNAP29:n kanssa autofagosomissa, mikä edistää autofagosomien ja lysosomien fuusiota [35]. Lisäksi YKT6-toiminnan menetys johtaa heikentyneeseen mitofagiaan [36], kun taas YKT6:n lisääntynyt ilmentyminen liittyy maksasolusyövän (HCC) etenemiseen, mikä osoittaa lisääntynyttä solujen eloonjäämistä [37]. Toisaalta AKT1 on tärkein vuorovaikutuksessa oleva geeni ja sillä on tärkeä rooli maksasairauksissa, mukaan lukien PI3K/AKT-signalointireitti, solusykli, solujen migraatio, proliferaatio, fokaalinen adheesio, mitokondrioiden toiminta ja kollageenin eritys [38–40]. Aktivoitunut PI3K/AKT-signalointireitti voi aktivoida hematopoieettisia kantasoluja (HSC), jotka ovat vastuussa solunulkoisen matriisin (ECM) tuotannosta, ja sen säätelyn häiriintyminen voi edistää maksafibroosin esiintymistä ja etenemistä [40]. Lisäksi AKT on yksi keskeisistä solujen eloonjäämistekijöistä, joka estää p53-riippuvaista soluapoptoosin, ja AKT:n aktivaatio voi liittyä maksasolujen apoptoosin estämiseen [41, 42]. Saadut tulokset viittaavat siihen, että IPA voi olla osallisena maksan mitokondrioihin liittyvässä apoptoosissa vaikuttamalla maksasolujen päätökseen apoptoosiin siirtymisen ja selviytymisen välillä. Näitä vaikutuksia voivat säädellä AKT- ja/tai YKT6-ehdokasgeenit, jotka ovat kriittisiä maksan homeostaasille.
Tuloksemme osoittivat, että 1 mM IPA indusoi apoptoosia ja vähensi mitokondriaalista hengitystä LX-2-soluissa riippumatta TGF-β1-hoidosta. On huomionarvoista, että apoptoosi on tärkeä reitti fibroosin hävittämiseen ja hematopoieettisten kantasolujen (HSC) aktivaatioon, ja se on myös keskeinen tapahtuma maksafibroosin palautuvassa fysiologisessa vasteessa [4, 43]. Lisäksi BHI:n palautuminen LX-2-soluissa yhdistelmähoidon jälkeen antoi uusia näkemyksiä IPA:n mahdollisesta roolista mitokondrioiden bioenergetiikkaa säätelevässä toiminnassa. Lepo- ja inaktiivisissa olosuhteissa hematopoieettiset solut käyttävät normaalisti mitokondrioiden oksidatiivista fosforylaatiota ATP:n tuottamiseen ja niiden metabolinen aktiivisuus on vähäistä. Toisaalta HSC:n aktivaatio tehostaa mitokondrioiden hengitystä ja biosynteesiä kompensoidakseen glykolyyttiseen tilaan siirtymisen energiantarpeita [44]. Se, että IPA ei vaikuttanut metaboliseen potentiaaliin eikä ECAR:iin, viittaa siihen, että glykolyyttinen reitti on vähemmän priorisoitu. Vastaavasti toinen tutkimus osoitti, että 1 mM IPA kykeni moduloimaan mitokondrioiden hengitysketjun aktiivisuutta sydänlihassyyteissä, ihmisen maksasolulinjassa (Huh7) ja ihmisen napanuoran laskimoendoteelisoluissa (HUVEC); IPA:lla ei kuitenkaan havaittu vaikutusta sydänlihassolujen glykolyysiin, mikä viittaa siihen, että IPA saattaa vaikuttaa muiden solutyyppien bioenergetiikkaan [45]. Siksi spekuloimme, että 1 mM IPA voi toimia lievänä kemiallisena irrottimena, koska se voi merkittävästi vähentää fibrogeenisten geenien ilmentymistä, solumorfologiaa ja mitokondrioiden bioenergetiikkaa muuttamatta mitokondriaalisen DNA:n määrää [46]. Mitokondrioiden irrottajaaineet voivat estää viljelmän indusoimaa fibroosia ja HSC-aktivaatiota [47] ja vähentää mitokondrioiden ATP-tuotantoa, jota säätelevät tai indusoivat tietyt proteiinit, kuten irrotusproteiinit (UCP) tai adeniininukleotiditranslokaasi (ANT). Solutyypistä riippuen tämä ilmiö voi suojata soluja apoptoosilta ja/tai edistää apoptoosia [46]. Tarvitaan kuitenkin lisätutkimuksia IPA:n roolin selvittämiseksi mitokondrioiden irrottajana hematopoieettisten kantasolujen inaktivaatiossa.
Tutkimme sitten, heijastuvatko mitokondrioiden hengityksen muutokset elävien LX-2-solujen mitokondrioiden morfologiaan. Mielenkiintoista on, että TGF-β1-käsittely muuttaa mitokondrioiden osuutta pallomaisesta keskikokoiseen, mikä vähentää mitokondrioiden haarautumista ja lisää DRP1:n ilmentymistä, joka on keskeinen tekijä mitokondrioiden fissiossa [48]. Lisäksi mitokondrioiden fragmentoituminen liittyy yleiseen verkoston monimutkaisuuteen, ja siirtyminen fuusiosta fissioon on ratkaisevan tärkeää hematopoieettisten kantasolujen (HSC) aktivoitumiselle, kun taas mitokondrioiden fissioiden estäminen johtaa HSC-apoptoosiin [49]. Tuloksemme osoittavat siis, että TGF-β1-käsittely voi indusoida mitokondrioiden verkoston monimutkaisuuden vähenemistä ja haarautumisen vähenemistä, mikä on yleisempää aktivoituneiden hematopoieettisten kantasolujen (HSC) yhteydessä olevassa mitokondrioiden fissiossa. Lisäksi datamme osoitti, että IPA voi muuttaa mitokondrioiden osuutta pallomaisesta keskikokoiseen, mikä vähentää OPA1:n ja MFN2:n ilmentymistä. Tutkimukset ovat osoittaneet, että OPA1:n alasääntely voi aiheuttaa mitokondrioiden kalvopotentiaalin laskua ja laukaista soluapoptoosin [50]. MFN2:n tiedetään välittävän mitokondrioiden fuusiota ja apoptoosia [51]. Saadut tulokset viittaavat siihen, että LX-2-solujen induktio TGF-β1:llä ja/tai IPA:lla näyttää moduloivan mitokondrioiden muotoa ja kokoa sekä aktivaatiotilaa ja verkoston monimutkaisuutta.
Tuloksemme osoittavat, että TGFβ-1:n ja IPA:n yhdistelmähoito voi vähentää mtDNA:n ja solujen morfologisia parametreja säätelemällä fibroosin, apoptoosin ja eloonjäämiseen liittyvien geenien mRNA:n ilmentymistä apoptoosia välttelevissä soluissa. IPA todellakin vähensi AKT1:n ja tärkeiden fibroosigeenien, kuten COL1A2:n ja MMP2:n, mRNA:n ilmentymistasoa, mutta lisäsi apoptoosiin liittyvän CASP8:n ilmentymistasoa. Tuloksemme osoittivat, että IPA-hoidon jälkeen BAX:n ilmentyminen väheni ja TIMP1-perheen alayksiköiden, BCL-2:n ja NF-κB:n, mRNA:n ilmentyminen lisääntyi, mikä viittaa siihen, että IPA voisi stimuloida eloonjäämissignaaleja apoptoosia välttelevissä hematopoieettisissa kantasoluissa (HSC). Nämä molekyylit voivat toimia eloonjäämistä edistävinä signaaleina aktivoituneissa hematopoieettisissa kantasoluissa, mikä voi liittyä antiapoptoottisten proteiinien (kuten Bcl-2:n) lisääntyneeseen ilmentymiseen, proapoptoottisen BAX:n ilmentymisen vähenemiseen ja TIMP:n ja NF-κB:n väliseen monimutkaiseen vuorovaikutukseen [5, 7]. IPA vaikuttaa PXR:n kautta, ja havaitsimme, että yhdistelmähoito TGF-β1:llä ja IPA:lla lisäsi PXR mRNA:n ilmentymistasoja, mikä viittaa HSC-aktivaation heikkenemiseen. Aktivoituneen PXR-signaloinnin tiedetään estävän HSC-aktivaatiota sekä in vivo että in vitro [52, 53]. Tuloksemme osoittavat, että IPA voi osallistua aktivoituneiden HSC-solujen poistamiseen edistämällä apoptoosia, vähentämällä fibroosia ja mitokondrioiden aineenvaihduntaa sekä tehostamalla selviytymissignaaleja, jotka ovat tyypillisiä prosesseja, jotka muuttavat aktivoituneen HSC-fenotyypin inaktivoiduksi. Toinen mahdollinen selitys IPA:n mahdolliselle mekanismille ja roolille apoptoosissa on, että se sieppaa toimintahäiriöisiä mitokondrioita pääasiassa mitofagian (sisäinen reitti) ja ulkoisen TNF-signalointireitin kautta (taulukko 1), joka on suoraan yhteydessä NF-κB:n selviytymissignalointireittiin (lisäkuva 7). Mielenkiintoista on, että IPA:han liittyvät rikastetut geenit pystyvät indusoimaan proapoptoottisia ja prosurvival-signaaleja apoptoosireitillä [54], mikä viittaa siihen, että IPA voi indusoida apoptoosireitin tai selviytymisen vuorovaikuttamalla näiden geenien kanssa. Kuitenkin, miten IPA indusoi apoptoosia tai eloonjäämistä HSC-aktivaation aikana ja sen mekanistiset reitit ovat edelleen epäselviä.
IPA on mikrobien metaboliitti, joka muodostuu ravinnon tryptofaanista suoliston mikrobiston kautta. Tutkimukset ovat osoittaneet, että sillä on tulehdusta estäviä, antioksidanttisia ja epigeneettisiä säätelyominaisuuksia suolistoympäristössä.[55] Tutkimukset ovat osoittaneet, että IPA voi moduloida suoliston suojamuuria ja vähentää oksidatiivista stressiä, mikä voi osaltaan vaikuttaa sen paikallisiin fysiologisiin vaikutuksiin.[56] Itse asiassa IPA kulkeutuu kohde-elimiin verenkierron kautta, ja koska IPA:lla on samanlainen päämetaboliittirakenne tryptofaanin, serotoniinin ja indolijohdannaisten kanssa, IPA:lla on metabolisia vaikutuksia, jotka johtavat kilpaileviin metabolisiin kohtaloihin.[52] IPA voi kilpailla tryptofaanista peräisin olevien metaboliittien kanssa entsyymien tai reseptorien sitoutumiskohdista, mikä voi häiritä normaaleja aineenvaihduntareittejä. Tämä korostaa tarvetta lisätutkimuksille sen farmakokineettisestä ja farmakodynaamisesta toiminnasta, jotta sen terapeuttinen ikkuna ymmärretään paremmin.[57] Jää nähtäväksi, voiko tätä tapahtua myös hematopoieettisissa kantasoluissa (HSC).
Tiedostamme, että tutkimuksemme sisältää joitakin rajoituksia. Jotta voisimme erityisesti tutkia IPA:han liittyviä yhteyksiä, suljimme pois tyypin 2 diabetesta (T2DM) sairastavat potilaat. Tiedostamme, että tämä rajoittaa havaintojemme laajaa sovellettavuutta tyypin 2 diabetesta ja pitkälle edennyttä maksasairautta sairastaviin potilaisiin. Vaikka IPA:n fysiologinen pitoisuus ihmisen seerumissa on 1–10 μM [11, 20], 1 mM IPA-pitoisuus valittiin korkeimman myrkyttömän pitoisuuden [15] ja korkeimman apoptoosinopeuden perusteella, eikä nekroottisten solujen prosenttiosuudessa ollut eroa. Vaikka tässä tutkimuksessa käytettiin suprafysiologisia IPA-tasoja, IPA:n tehokkaasta annoksesta ei ole tällä hetkellä yksimielisyyttä [52]. Vaikka tuloksemme ovat merkittäviä, IPA:n laajempi metabolinen kohtalo on edelleen aktiivinen tutkimuskohde. Lisäksi havaintomme seerumin IPA-tasojen ja maksatranskriptien DNA-metylaation välisestä yhteydestä saatiin paitsi hematopoieettisista kantasoluista (HSC) myös maksakudoksista. Valitsimme ihmisen LX-2-solut aiempien transkriptomianalyysitulosten perusteella, joiden mukaan IPA liittyy hematopoieettisten kantasolujen (HSC) aktivaatioon [15], ja HSC:t ovat tärkeimmät maksafibroosin etenemiseen osallistuvat solut. Maksa koostuu useista solutyypeistä, joten muita solumalleja, kuten maksasolu-HSC-immuunisolu-yhteisviljelyjärjestelmää yhdistettynä kaspaasiaktivaatioon ja DNA:n fragmentointiin, sekä vaikutusmekanismia, mukaan lukien proteiinitaso, tulisi harkita IPA:n roolin ja sen vuorovaikutuksen muiden maksasolutyyppien kanssa tutkimiseksi.