Kiitos käynnistäsi nature.com-sivustolla. Käyttämäsi selainversio tukee CSS:ää rajoitetusti. Parhaan käyttökokemuksen saavuttamiseksi suosittelemme käyttämään uusinta selainversiota (tai poistamaan yhteensopivuustilan käytöstä Internet Explorerissa). Lisäksi jatkuvan tuen varmistamiseksi tämä sivusto ei sisällä tyylejä tai JavaScriptiä.
Rikkivedyllä (H2S) on useita fysiologisia ja patologisia vaikutuksia ihmiskehoon. Natriumvetysulfidia (NaHS) käytetään laajalti farmakologisena työkaluna H2S:n vaikutusten arvioimiseksi biologisissa kokeissa. Vaikka H2S:n poistuminen NaHS-liuoksista kestää vain muutaman minuutin, NaHS-liuoksia on käytetty H2S:n donoriyhdisteinä juomavedessä joissakin eläinkokeissa. Tässä tutkimuksessa selvitettiin, voiko rotta/hiiri-pulloissa valmistettu 30 μM NaHS-pitoisuus oleva juomavesi pysyä vakaana vähintään 12–24 tuntia, kuten jotkut kirjoittajat ovat ehdottaneet. Valmista NaHS-liuos (30 μM) juomaveteen ja kaada se välittömästi rotta/hiiri-vesipulloihin. Näytteet kerättiin vesipullon kärjestä ja sisältä 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 ja 24 tunnin kuluttua sulfidipitoisuuden mittaamiseksi metyleenisinimenetelmällä. Lisäksi uros- ja naarasrotille injektoitiin NaHS:ää (30 μM) kahden viikon ajan, ja seerumin sulfidipitoisuudet mitattiin joka toinen päivä ensimmäisen viikon aikana ja toisen viikon lopussa. Vesipullon kärjestä saadun näytteen NaHS-liuos oli epästabiili; se laski 72 % ja 75 % 12 ja 24 tunnin kuluttua. Vesipullojen sisältä otetuissa näytteissä NaHS:n lasku ei ollut merkitsevä kahden tunnin kuluessa; se kuitenkin laski 47 % ja 72 % 12 ja 24 tunnin kuluttua. NaHS-injektio ei vaikuttanut uros- ja naarasrottien seerumin sulfidipitoisuuteen. Yhteenvetona voidaan todeta, että juomavedestä valmistettuja NaHS-liuoksia ei tule käyttää H2S-donaatioon, koska liuos on epästabiili. Tämä antotapa altistaa eläimet epäsäännöllisille ja odotettua pienemmille NaHS-määrille.
Rikkivetyä (H2S) on käytetty toksiinina 1700-luvulta lähtien; Abe ja Kimura kuvasivat kuitenkin sen mahdollisen roolin endogeenisena biosignalointimolekyylinä vuonna 1996. Viimeisten kolmen vuosikymmenen aikana on selvitetty lukuisia H2S:n toimintoja erilaisissa ihmisen elimistöissä, mikä on johtanut ymmärrykseen siitä, että H2S-donorimolekyyleillä voi olla kliinisiä sovelluksia tiettyjen sairauksien hoidossa tai hallinnassa; katso Chirino ym. tuore katsaus.
Natriumvetysulfidia (NaHS) on käytetty laajalti farmakologisena työkaluna H2S:n vaikutusten arvioimiseksi monissa soluviljelmä- ja eläinkokeissa5,6,7,8. NaHS ei kuitenkaan ole ihanteellinen H2S-donori, koska se muuttuu liuoksessa nopeasti H2S/HS-:ksi, kontaminoituu helposti polysulfideilla ja hapettuu ja haihtuu helposti4,9. Monissa biologisissa kokeissa NaHS liuotetaan veteen, mikä johtaa passiiviseen haihtumiseen ja H2S:n häviämiseen10,11,12, H2S:n spontaaniin hapettumiseen11,12,13 ja fotolyysiin14. Alkuperäisessä liuoksessa oleva sulfidi häviää hyvin nopeasti H2S:n haihtumisen vuoksi. Avoimessa astiassa H2S:n puoliintumisaika (t1/2) on noin 5 minuuttia ja sen pitoisuus laskee noin 13 % minuutissa10. Vaikka rikkivedynpoisto NaHS-liuoksista kestää vain muutaman minuutin, joissakin eläinkokeissa NaHS-liuoksia on käytetty rikkivedynpoiston lähteenä juomavedessä 1–21 viikon ajan, jolloin NaHS:ää sisältävä liuos on korvattu 12–24 tunnin välein.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Tämä käytäntö ei ole tieteellisen tutkimuksen periaatteiden mukainen, koska lääkeannosten tulisi perustua niiden käyttöön muilla lajeilla, erityisesti ihmisillä.27
Biolääketieteen prekliininen tutkimus pyrkii parantamaan potilashoidon laatua tai hoitotuloksia. Useimpien eläinkokeiden tuloksia ei kuitenkaan ole vielä käännetty ihmisille28,29,30. Yksi syy tähän käännöksen epäonnistumiseen on eläinkokeiden metodologisen laadun laiminlyönti30. Siksi tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää, voisivatko rotta/hiiri-vesipulloihin valmistetut 30 μM NaHS-liuokset pysyä stabiileina juomavedessä 12–24 tuntia, kuten joissakin tutkimuksissa väitetään tai ehdotetaan.
Kaikki tässä tutkimuksessa tehdyt kokeet tehtiin Iranissa julkaistujen laboratorioeläinten hoitoa ja käyttöä koskevien ohjeiden mukaisesti31. Kaikissa tämän tutkimuksen kokeellisissa raporteissa noudatettiin myös ARRIVE-ohjeita32. Shahid Beheshtin lääketieteellisen yliopiston endokriinisten tieteiden laitoksen eettinen toimikunta hyväksyi kaikki tässä tutkimuksessa käytetyt kokeelliset menetelmät.
Sinkkiasetaattidihydraatti (CAS: 5970-45-6) ja vedetön rautakloridi (CAS: 7705-08-0) hankittiin Biochemiltä, ​​Chemopahrama (Cosne-sur-Loire, Ranska). Natriumvetysulfidihydraatti (CAS: 207683-19-0) ja N,N-dimetyyli-p-fenyleenidiamiini (DMPD) (CAS: 535-47-0) hankittiin Sigma-Aldrichilta (St. Louis, MO, USA). Isofluraani ostettiin Piramalilta (Bethlehem, PA, USA). Suolahappo (HCl) ostettiin Merckiltä (Darmstadt, Saksa).
Valmista NaHS-liuos (30 μM) juomaveteen ja kaada se välittömästi rotan/hiiren vesipulloihin. Tämä pitoisuus valittiin useiden julkaisujen perusteella, joissa NaHS:ää on käytetty H2S:n lähteenä; katso keskusteluosio. NaHS on hydratoitu molekyyli, joka voi sisältää vaihtelevia määriä hydraatiovettä (eli NaHS•xH2O); valmistajan mukaan tutkimuksessamme käytetyn NaHS:n prosenttiosuus oli 70,7 % (eli NaHS•1,3 H2O), ja otimme tämän arvon huomioon laskelmissamme, joissa käytimme molekyylipainoa 56,06 g/mol, joka on vedettömän NaHS:n molekyylipaino. Hydraatiovesi (jota kutsutaan myös kidevedeksi) on vesimolekyylejä, jotka muodostavat kiteisen rakenteen33. Hydraateilla on erilaiset fysikaaliset ja termodynaamiset ominaisuudet verrattuna anhydraatteihin34.
Ennen NaHS:n lisäämistä juomaveteen, mittaa liuottimen pH ja lämpötila. Kaada NaHS-liuos välittömästi rotan/hiiren vesipulloon eläinhäkissä. Näytteet kerättiin vesipullon kärjestä ja sisältä 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 ja 24 tunnin kohdalla sulfidipitoisuuden mittaamiseksi. Sulfidimittaukset tehtiin välittömästi jokaisen näytteenoton jälkeen. Otimme näytteitä putken kärjestä, koska jotkut tutkimukset ovat osoittaneet, että vesipullon pieni huokoskoko voi minimoida H2S:n haihtumista15,19. Tämä ongelma näyttää koskevan myös pullossa olevaa liuosta. Näin ei kuitenkaan ollut vesipullon kaulassa olevan liuoksen tapauksessa, sillä sillä oli suurempi haihtumisnopeus ja se hapettui itse; itse asiassa eläimet joivat tämän veden ensin.
Tutkimuksessa käytettiin uros- ja naaraspuolisia Wistar-rottia. Rotat pidettiin polypropeenihäkeissä (2–3 rottaa häkkiä kohden) standardiolosuhteissa (lämpötila 21–26 °C, kosteus 32–40 %) 12 tunnin valossa (klo 7–19) ja 12 tunnin pimeydessä (klo 19–7). Rotilla oli vapaa pääsy vesijohtoveteen ja ne ruokittiin standardirehulla (Khorak Dam Pars Company, Teheran, Iran). Ikäryhmittäin valitut (6 kuukautta) naaras- (n = 10, paino: 190–230 g) ja uros- (n = 10, paino: 320–370 g) Wistar-rotat jaettiin satunnaisesti kontrolli- ja NaHS:llä (30 μM) käsiteltyihin ryhmiin (n = 5 ryhmää kohden). Otoskoon määrittämiseksi käytimme KISS (Keep It Simple, Stupid) -lähestymistapaa, joka yhdistää aiemman kokemuksen ja tehoanalyysin35. Ensin teimme pilottitutkimuksen kolmella rotalla ja määritimme seerumin keskimääräisen kokonaissulfidipitoisuuden ja keskihajonnan (8,1 ± 0,81 μM). Sitten, käyttäen 80 %:n tehoa ja olettaen kaksipuolisen 5 %:n merkitsevyystason, määritimme alustavan otoskoon (n = 5 aiemman kirjallisuuden perusteella), joka vastasi standardoitua vaikutuskokoa 2,02 Festingin ehdottamalla ennalta määritellyllä arvolla koe-eläinten otoskoon laskemiseksi35. Kun tämä arvo kerrottiin keskihajonnalla (2,02 × 0,81), ennustettu havaittava vaikutuskoko (1,6 μM) oli 20 %, mikä on hyväksyttävä. Tämä tarkoittaa, että n = 5/ryhmä riittää havaitsemaan 20 %:n keskimääräisen muutoksen ryhmien välillä. Rotat jaettiin satunnaisesti kontrolli- ja NaSH-käsiteltyihin ryhmiin käyttämällä Excel-ohjelmiston satunnaisfunktiota36 (lisäkuva 1). Sokkoutus suoritettiin tulostasolla, eivätkä biokemiallisia mittauksia suorittaneet tutkijat olleet tietoisia ryhmäjaoista.
Molempien sukupuolten NaHS-ryhmiä käsiteltiin 30 μM:n juomaveteen sekoitetulla NaHS-liuoksella kahden viikon ajan; Tuoretta liuosta annettiin 24 tunnin välein, jonka aikana ruumiinpaino mitattiin. Verinäytteet kerättiin kaikkien isofluraanianestesiassa olevien rottien hännänpäistä joka toinen päivä ensimmäisen ja toisen viikon lopussa. Verinäytteet sentrifugoitiin 3000 g:n voimalla 10 minuutin ajan, seerumi eroteltiin ja säilytettiin –80 °C:ssa seerumin urean, kreatiniinin (Cr) ja kokonaissulfidin myöhempää mittausta varten. Seerumin urea määritettiin entsymaattisella ureaasimenetelmällä ja seerumin kreatiniini fotometrisellä Jaffe-menetelmällä käyttäen kaupallisesti saatavilla olevia määrityspakkauksia (Man Company, Teheran, Iran) ja automaattista analysaattoria (Selectra E, sarjanumero 0-2124, Alankomaat). Urean ja Cr:n sisäinen ja määritysten välinen variaatiokerroin oli alle 2,5 %.
Metyleenisinimenetelmää (MB) käytetään kokonaissulfidin mittaamiseen juomavedessä ja NaHS:ia sisältävässä seerumissa; MB on yleisimmin käytetty menetelmä sulfidin mittaamiseen irtoliuoksissa ja biologisissa näytteissä11,37. MB-menetelmää voidaan käyttää kokonaissulfidipoolin arvioimiseen38 ja epäorgaanisten sulfidien mittaamiseen H2S:n, HS-:n ja S2:n muodossa vesifaasissa39. Tässä menetelmässä rikki saostetaan sinkkisulfidina (ZnS) sinkkiasetaatin läsnä ollessa11,38. Sinkkiasetaatin saostus on yleisimmin käytetty menetelmä sulfidien erottamiseen muista kromoforeista11. ZnS liuotettiin uudelleen käyttämällä HCl:a11 voimakkaasti happamissa olosuhteissa. Sulfidi reagoi DMPD:n kanssa stoikiometrisessä suhteessa 1:2 rautakloridin katalysoimassa reaktiossa (Fe3+ toimii hapettimena) muodostaen väriaineen MB, joka havaitaan spektrofotometrisesti 670 nm:ssä40,41. MB-menetelmän havaitsemisraja on noin 1 μM11.
Tässä tutkimuksessa 100 μL kutakin näytettä (liuosta tai seerumia) lisättiin putkeen; sitten lisättiin 200 μL sinkkiasetaattia (1 % w/v tislatussa vedessä), 100 μL DMPD:tä (20 mM 7,2 M HCl:ssa) ja 133 μL FeCl3:a (30 mM 1,2 M HCl:ssa). Seosta inkuboitiin 37 °C:ssa pimeässä 30 minuuttia. Liuos sentrifugoitiin 10 000 g:ssä 10 minuutin ajan, ja supernatantin absorbanssi luettiin 670 nm:ssä käyttäen mikrolevylukijaa (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, USA). Sulfidipitoisuudet määritettiin käyttämällä NaHS:n (0–100 μM) kalibrointikäyrää ddH2O:ssa (lisäkuva 2). Kaikki mittauksissa käytetyt liuokset valmistettiin tuoreeltaan. Sulfidimittausten sisäinen ja määritysten välinen variaatiokerroin oli vastaavasti 2,8 % ja 3,4 %. Määritimme myös natriumtiosulfaattia sisältävistä juomavesi- ja seeruminäytteistä talteen otetun sulfidin kokonaismäärän käyttämällä väkevöityjen näytteiden menetelmää42. Natriumtiosulfaattia sisältävien juomavesi- ja seeruminäytteiden talteenotot olivat 91 ± 1,1 % (n = 6) ja 93 ± 2,4 % (n = 6).
Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä GraphPad Prism -ohjelmiston Windows-versiota 8.0.2 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA, www.graphpad.com). Juomaveden lämpötilaa ja pH:ta verrattiin paritettua t-testiä ennen NaHS:n lisäystä ja sen jälkeen. H2S:n hävikki NaHS:ää sisältävässä liuoksessa laskettiin prosentuaalisena laskuna lähtötilanteen kertymisestä, ja hävikin tilastollisen merkitsevyyden arvioimiseksi suoritimme yksisuuntaisen toistuvan ANOVA:n, jota seurasi Dunnettin monivertailutesti. Painoa, seerumin ureaa, seerumin kreatiniinia ja seerumin kokonaissulfidia verrattiin ajan kuluessa kontrolli- ja NaHS:lla käsiteltyjen eri sukupuolten rottien välillä käyttämällä kaksisuuntaista seka-ANOVAa (välillä ja sisällä) ja Bonferroni post hoc -testiä. Kaksisuuntaisia ​​P-arvoja < 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevinä.
Juomaveden pH oli 7,60 ± 0,01 ennen NaHS:n lisäystä ja 7,71 ± 0,03 NaHS:n lisäyksen jälkeen (n = 13, p = 0,0029). Juomaveden lämpötila oli 26,5 ± 0,2 ja laski arvoon 26,2 ± 0,2 NaHS:n lisäyksen jälkeen (n = 13, p = 0,0128). Valmista 30 μM NaHS-liuos juomaveteen ja säilytä sitä vesipullossa. NaHS-liuos on epästabiili ja sen pitoisuus laskee ajan myötä. Vesipullon kaulasta otetun näytteen havaittiin merkittävä lasku (68,0 %) ensimmäisen tunnin aikana, ja liuoksen NaHS-pitoisuus laski 72 % ja 75 % 12 ja 24 tunnin kuluttua. Vesipulloista otetuissa näytteissä NaHS:n lasku ei ollut merkittävä kahteen tuntiin asti, mutta 12 ja 24 tunnin kuluttua se oli laskenut 47 % ja 72 %. Nämä tiedot osoittavat, että NaHS:n prosenttiosuus juomaveteen sekoitetussa 30 μM:n liuoksessa oli laskenut noin neljännekseen alkuperäisestä arvosta 24 tunnin kuluttua näytteenottopaikasta riippumatta (kuva 1).
NaHS-liuoksen (30 μM) stabiilius juomavedessä rotta/hiiri-pulloissa. Liuoksen valmistamisen jälkeen näytteet otettiin vesipullon kärjestä ja sisältä. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta (n = 6/ryhmä). * ja #, P < 0,05 verrattuna aikaan 0. Vesipullon valokuvassa näkyvät kärki (aukoineen) ja pullon runko. Kärjen tilavuus on noin 740 μL.
NaHS:n pitoisuus tuoreessa 30 μM liuoksessa oli 30,3 ± 0,4 μM (vaihteluväli: 28,7–31,9 μM, n = 12). 24 tunnin kuluttua NaHS:n pitoisuus kuitenkin laski alempaan arvoon (keskiarvo: 3,0 ± 0,6 μM). Kuten kuvassa 2 on esitetty, rottien altistuneet NaHS:n pitoisuudet eivät olleet vakioita tutkimusjakson aikana.
Naarasrottien paino nousi merkittävästi ajan myötä (kontrolliryhmässä 205,2 ± 5,2 grammasta 213,8 ​​± 7,0 grammaan ja NaHS-käsitellyssä ryhmässä 204,0 ± 8,6 grammasta 211,8 ± 7,5 grammaan); NaHS-käsittelyllä ei kuitenkaan ollut vaikutusta painoon (kuva 3). Urosrottien paino nousi merkittävästi ajan myötä (kontrolliryhmässä 338,6 ± 8,3 grammasta 352,4 ± 6,0 grammaan ja NaHS-käsitellyssä ryhmässä 352,4 ± 5,9 grammasta 363,2 ± 4,3 grammaan); NaHS-käsittelyllä ei kuitenkaan ollut vaikutusta painoon (kuva 3).
Naaras- ja urosrottien painonmuutokset NaHS:n (30 μM) annon jälkeen. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM ja niitä verrattiin käyttämällä kaksisuuntaista sekavarianssianalyysia (within-between) Bonferroni post hoc -testillä. n = 5 kummastakin sukupuolesta kussakin ryhmässä.
Seerumin urea- ja kreatiinifosfaattipitoisuudet olivat vertailukelpoisia kontrolli- ja NaSH-käsitellyillä rotilla koko tutkimuksen ajan. Lisäksi NaSH-käsittely ei vaikuttanut seerumin urea- ja kreatiinikromipitoisuuksiin (taulukko 1).
Lähtötilanteen seerumin kokonaissulfidipitoisuudet olivat vertailukelpoisia kontrolli- ja NaHS-käsiteltyjen urosrottien (8,1 ± 0,5 μM vs. 9,3 ± 0,2 μM) ja naarasrottien (9,1 ± 1,0 μM vs. 6,1 ± 1,1 μM) välillä. NaHS:n anto 14 päivän ajan ei vaikuttanut seerumin kokonaissulfidipitoisuuksiin uros- tai naarasrotilla (kuva 4).
Seerumin kokonaissulfidipitoisuuksien muutokset uros- ja naarasrotilla NaHS:n (30 μM) annon jälkeen. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM ja niitä verrattiin käyttämällä kaksisuuntaista sekavarianssianalyysia (within-within) Bonferroni post hoc -testillä. Kumpikin sukupuoli, n = 5/ryhmä.
Tämän tutkimuksen päätelmä on, että NaHS:ia sisältävä juomavesi on epästabiilia: vain noin neljännes alkuperäisestä kokonaissulfidipitoisuudesta voidaan havaita 24 tunnin kuluttua näytteenotosta rotan/hiiren vesipullojen kärjestä ja sisältä. Lisäksi rotat altistettiin epästabiileille NaHS-pitoisuuksille NaHS-liuoksen H2S-hävikin vuoksi, eikä NaHS:n lisääminen juomaveteen vaikuttanut ruumiinpainoon, seerumin urea- ja kreatiinikromipitoisuuksiin eikä seerumin kokonaissulfidipitoisuuteen.
Tässä tutkimuksessa H2S:n hävikki 30 μM NaHS-liuoksista, jotka oli valmistettu juomaveteen, oli noin 3 % tunnissa. Puskuroidussa liuoksessa (100 μM natriumsulfidia 10 mM PBS:ssä, pH 7,4) sulfidipitoisuuden raportoitiin laskevan 7 % ajan kuluessa 8 tunnin aikana11. Olemme aiemmin puolustaneet NaHS:n vatsaontelonsisäistä antoa raportoimalla, että sulfidin hävikki 54 μM NaHS-liuoksesta juomaveteen oli noin 2,3 % tunnissa (4 %/tunti ensimmäisten 12 tunnin aikana ja 1,4 %/tunti viimeisten 12 tunnin aikana valmistuksen jälkeen)8. Aiemmissa tutkimuksissa43 havaittiin H2S:n jatkuva hävikki NaHS-liuoksista, pääasiassa haihtumisen ja hapettumisen vuoksi. Vaikka kuplia ei lisättäisikään, sulfidi kantaliuoksesta häviää nopeasti H2S:n haihtumisen vuoksi11. Tutkimukset ovat osoittaneet, että laimennusprosessin aikana, joka kestää noin 30–60 sekuntia, noin 5–10 % H2S:stä häviää haihtumisen vuoksi6. Estääkseen H2S:n haihtumisen liuoksesta tutkijat ovat ryhtyneet useisiin toimenpiteisiin, mukaan lukien liuoksen varovainen sekoittaminen12, kantaliuoksen peittäminen muovikalvolla6 ja liuoksen altistumisen minimointi ilmalle, koska H2S:n haihtumisnopeus riippuu ilman ja nesteen rajapinnasta.13 H2S:n spontaani hapettuminen tapahtuu pääasiassa siirtymämetalli-ionien, erityisesti rauta(III)-ionien, vaikutuksesta, jotka ovat veden epäpuhtauksia.13 H2S:n hapettuminen johtaa polysulfidien (rikkiatomien, jotka ovat liittyneet kovalenttisilla sidoksilla)11 muodostumiseen. Hapettumisen välttämiseksi H2S:ää sisältävät liuokset valmistetaan hapettomiin liuottimiin44,45 ja huuhdellaan sitten argonilla tai typellä 20–30 minuutin ajan hapettumisen varmistamiseksi.11,12,37,44,45,46 Dietyleenitriamiinipentaetikkahappo (DTPA) on metallikelaattori (10–4 M), joka estää HS:n autohapettumisen aerobisissa liuoksissa. Ilman DTPA:ta HS-:n autohapettumisnopeus on noin 50 % noin 3 tunnin aikana 25 °C:ssa37,47. Lisäksi, koska 1e-sulfidin hapettumista katalysoi ultraviolettivalo, liuos tulisi säilyttää jäissä ja suojata valolta11.
Kuten kuvassa 5 on esitetty, NaHS dissosioituu veteen liuotettuna Na+- ja HS-6-ioneiksi; tämä dissosiaatio määräytyy reaktion pK1-arvon perusteella, joka on lämpötilasta riippuvainen: pK1 = 3,122 + 1132/T, jossa T vaihtelee välillä 5–30 °C ja mitataan kelvin-asteina (K), K = °C + 273,1548. HS-:lla on korkea pK2-arvo (pK2 = 19), joten pH-arvossa < 96,49 S2-:ta ei muodostu tai sitä muodostuu hyvin pieniä määriä. Sitä vastoin HS- toimii emäksenä ja hyväksyy H+-ioneja H2O-molekyylistä, ja H2O toimii happona ja muuttuu H2S:ksi ja OH-:ksi.
Liuenneen H2S-kaasun muodostuminen NaHS-liuokseen (30 µM). aq, vesiliuos; g, kaasu; l, neste. Kaikissa laskelmissa oletetaan, että veden pH = 7,0 ja veden lämpötila = 20 °C. Luotu BioRender.comilla.
Vaikka on näyttöä siitä, että NaHS-liuokset ovat epästabiileja, useissa eläinkokeissa on käytetty NaHS-liuoksia juomavedessä H2S-donoriyhdisteenä15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 interventioiden kestojen vaihdellessa 1–21 viikon välillä (taulukko 2). Näiden tutkimusten aikana NaHS-liuos uusittiin 12 tunnin, 15, 17, 18, 24, 25 tunnin tai 24 tunnin, 19, 20, 21, 22, 23 tunnin välein. Tuloksemme osoittivat, että rotat altistuivat epävakaille lääkeainepitoisuuksille H2S:n häviämisen vuoksi NaHS-liuoksesta, ja rottien juomaveden NaHS-pitoisuus vaihteli merkittävästi 12 tai 24 tunnin aikana (katso kuva 2). Kahdessa näistä tutkimuksista raportoitiin, että veden H2S-pitoisuudet pysyivät vakaina 24 tunnin aikana22 tai että 12 tunnin aikana havaittiin vain 2–3 %:n H2S-häviöitä15, mutta ne eivät toimittaneet tukevia tietoja tai mittaustietoja. Kaksi tutkimusta on osoittanut, että vesipullojen pieni halkaisija voi minimoida H2S:n haihtumisen15,19. Tuloksemme kuitenkin osoittivat, että tämä saattaa viivästyttää H2S:n hävikkiä vesipullosta vain kahdella tunnilla 12–24 tunnin sijaan. Molemmissa tutkimuksissa oletetaan, että juomaveden NaHS-pitoisuuden ei ole havaittu muuttuneen, koska emme havainneet veden värinmuutosta; siksi H2S:n hapettuminen ilman vaikutuksesta ei ollut merkittävää19,20. Yllättäen tämä subjektiivinen menetelmä arvioi NaHS:n stabiilisuutta vedessä sen sijaan, että mittaisi sen pitoisuuden muutosta ajan kuluessa.
H2S:n hävikki NaHS-liuoksessa liittyy pH-arvoon ja lämpötilaan. Kuten tutkimuksessamme todettiin, NaHS:n liuottaminen veteen johtaa emäksisen liuoksen muodostumiseen50. Kun NaHS liuotetaan veteen, liuenneen H2S-kaasun muodostuminen riippuu pH-arvosta6. Mitä alhaisempi liuoksen pH on, sitä suurempi on NaHS:n osuus H2S-kaasumolekyyleinä ja sitä enemmän sulfidia häviää vesiliuoksesta11. Yhdessäkään näistä tutkimuksista ei raportoitu NaHS:n liuottimena käytetyn juomaveden pH-arvoa. WHO:n suositusten mukaan, joita useimmat maat noudattavat, juomaveden pH:n tulisi olla välillä 6,5–8,551. Tällä pH-alueella H2S:n spontaanin hapettumisen nopeus kasvaa noin kymmenkertaiseksi13. NaHS:n liuottaminen veteen tällä pH-alueella johtaa liuenneen H2S-kaasun pitoisuuteen 1–22,5 μM, mikä korostaa veden pH:n seurannan tärkeyttä ennen NaHS:n liuottamista. Lisäksi edellä mainitussa tutkimuksessa raportoitu lämpötila-alue (18–26 °C) johtaisi noin 10 %:n muutokseen liuenneen H2S-kaasun pitoisuudessa liuoksessa, koska lämpötilan muutokset muuttavat pK1-arvoa, ja pienillä pK1-arvon muutoksilla voi olla merkittävä vaikutus liuenneen H2S-kaasun pitoisuuteen48. Lisäksi joidenkin tutkimusten pitkä kesto (5 kuukautta)22, jonka aikana odotetaan suurta lämpötilan vaihtelua, pahentaa tätä ongelmaa.
Kaikissa tutkimuksissa yhtä lukuun ottamatta21 käytettiin 30 μM NaHS-liuosta juomavedessä. Käytetyn annoksen (eli 30 μM) selittämiseksi jotkut kirjoittajat huomauttivat, että NaHS vesifaasissa tuottaa täsmälleen saman H2S-kaasupitoisuuden ja että H2S:n fysiologinen alue on 10–100 μM, joten tämä annos on fysiologisella alueella15,16. Toiset selittivät, että 30 μM NaHS voi pitää plasman H2S-pitoisuuden fysiologisella alueella eli 5–300 μM19,20. Tarkastelemme veden NaHS-pitoisuutta 30 μM (pH = 7,0, T = 20 °C), jota käytettiin joissakin tutkimuksissa H2S:n vaikutusten tutkimiseen. Voimme laskea, että liuenneen H2S-kaasun pitoisuus on 14,7 μM, mikä on noin 50 % alkuperäisestä NaHS-pitoisuudesta. Tämä arvo on samanlainen kuin muiden kirjoittajien samoissa olosuhteissa laskema arvo13,48.
Tutkimuksessamme NaHS:n anto ei muuttanut painoa; tämä tulos on yhdenmukainen muiden uroshiirillä22,23 ja urosrotilla18 tehtyjen tutkimusten tulosten kanssa. Kahdessa tutkimuksessa kuitenkin raportoitiin, että NaSH palautti alentuneen painon nefrektomiarotilla24,26, kun taas muissa tutkimuksissa ei raportoitu NaSH:n antamisen vaikutusta painoon15,16,17,19,20,21,25. Lisäksi tutkimuksessamme NaSH:n anto ei vaikuttanut seerumin urea- ja kreatiinikromitasoihin, mikä on yhdenmukaista toisen raportin25 tulosten kanssa.
Tutkimuksessa havaittiin, että NaHS:n lisääminen juomaveteen kahden viikon ajan ei vaikuttanut seerumin kokonaissulfidipitoisuuksiin uros- ja naarasrotilla. Tämä havainto on yhdenmukainen Senin ym. (16) tulosten kanssa: 8 viikon hoito 30 μM NaHS:lla juomavedessä ei vaikuttanut plasman sulfiditasoihin kontrollirotilla; he kuitenkin raportoivat, että tämä interventio palautti alentuneet H2S-pitoisuudet munuaisettoman hiiren plasmassa. Li ym. (22) raportoivat myös, että hoito 30 μM NaHS:lla juomavedessä viiden kuukauden ajan lisäsi plasman vapaan sulfidin pitoisuuksia ikääntyneillä hiirillä noin 26 %. Muissa tutkimuksissa ei ole raportoitu muutoksia verenkierrossa olevassa sulfidissa NaHS:n lisäämisen jälkeen juomaveteen.
Seitsemässä tutkimuksessa käytettiin Sigma NaHS:ää15,16,19,20,21,22,23, mutta niissä ei annettu lisätietoja hydraatiovedestä, ja viidessä tutkimuksessa ei mainittu valmistusmenetelmissään käytetyn NaHS:n lähdettä17,18,24,25,26. NaHS on hydratoitu molekyyli, ja sen hydraatiovesipitoisuus voi vaihdella, mikä vaikuttaa tietyn molaarisuuden omaavan liuoksen valmistamiseksi tarvittavan NaHS:n määrään. Esimerkiksi meidän tutkimuksessamme NaHS-pitoisuus oli NaHS•1.3 H2O. Siten näiden tutkimusten todelliset NaHS-pitoisuudet voivat olla raportoituja alhaisempia.
”Kuinka niin lyhytikäisellä yhdisteellä voi olla niin pitkäaikainen vaikutus?” Pozgay ym.21 esittivät tämän kysymyksen arvioidessaan NaHS:n vaikutuksia hiirten paksusuolentulehdukseen. He toivovat, että tulevat tutkimukset pystyvät vastaamaan tähän kysymykseen ja spekuloimaan, että NaHS-liuokset saattavat sisältää stabiilimpia polysulfideja NaHS:n vaikutusta välittävien H2S:n ja disulfidien lisäksi21. Toinen mahdollisuus on, että myös hyvin pienillä liuokseen jäävillä NaHS-pitoisuuksilla voi olla hyödyllinen vaikutus. Itse asiassa Olson ym. esittivät näyttöä siitä, että veren mikromolaariset H2S-pitoisuudet eivät ole fysiologisia ja niiden pitäisi olla nanomolaarisella alueella tai puuttua kokonaan13. H2S voi toimia proteiinisulfaation kautta, joka on palautuva translaation jälkeinen modifikaatio, joka vaikuttaa monien proteiinien toimintaan, stabiilisuuteen ja lokalisaatioon52,53,54. Itse asiassa fysiologisissa olosuhteissa noin 10–25 % monista maksaproteiineista on sulfyloituneita53. Molemmat tutkimukset tunnustavat NaHS:n nopean hajoamisen19,23, mutta yllättäen toteavat, että ”hallitsimme NaHS:n pitoisuutta juomavedessä korvaamalla sitä päivittäin”.23 Eräässä tutkimuksessa todettiin vahingossa, että ”NaHS on standardi H2S-donori ja sitä käytetään yleisesti kliinisessä käytännössä korvaamaan itse H2S:ää.”18
Yllä oleva keskustelu osoittaa, että NaHS:ää häviää liuoksesta haihtumisen, hapettumisen ja fotolyysin kautta, ja siksi esitetään joitakin ehdotuksia H2S:n häviön vähentämiseksi liuoksesta. Ensinnäkin H2S:n haihtuminen riippuu kaasu-neste-rajapinnasta13 ja liuoksen pH:sta11. Siksi haihtumishäviön minimoimiseksi vesipullon kaula voidaan tehdä mahdollisimman pieneksi aiemmin kuvatulla tavalla15,19, ja veden pH voidaan säätää hyväksyttävään ylärajaan (eli 6,5–8,551) haihtumishäviön minimoimiseksi11. Toiseksi H2S:n spontaani hapettuminen tapahtuu hapen vaikutuksesta ja siirtymämetalli-ionien läsnäolosta juomavedessä13, joten juomaveden hapettuminen argonilla tai typellä44,45 ja metallikelaattoreiden37,47 käyttö voivat vähentää sulfidien hapettumista. Kolmanneksi H2S:n fotohajoamisen estämiseksi vesipullot voidaan kääriä alumiinifolioon. Tämä käytäntö koskee myös valoherkkiä materiaaleja, kuten streptotsotosiinia55. Lopuksi, epäorgaanisia sulfidisuoloja (NaHS, Na2S ja CaS) voidaan antaa letkuruokintana juomaveteen liuottamisen sijaan, kuten aiemmin on raportoitu56,57,58; tutkimukset ovat osoittaneet, että rotille letkuruokintana annettu radioaktiivinen natriumsulfidi imeytyy hyvin ja jakautuu käytännössä kaikkiin kudoksiin59. Tähän mennessä useimmissa tutkimuksissa epäorgaanisia sulfidisuoloja on annettu vatsaontelonsisäisesti; tätä antoreittiä käytetään kuitenkin harvoin kliinisissä olosuhteissa60. Toisaalta suun kautta tapahtuva antoreitti on yleisin ja suositeltavin ihmisillä61. Siksi suosittelemme H2S-donorien vaikutusten arviointia jyrsijöillä suun kautta annettavan letkuruokinnan avulla.
Rajoituksena on, että mittasimme sulfidia vesiliuoksessa ja seerumissa MB-menetelmällä. Sulfidin mittausmenetelmiin kuuluvat jodititraus, spektrofotometria, sähkökemiallinen menetelmä (potentiometria, amperometria, coulometrinen menetelmä ja amperometrinen menetelmä) ja kromatografia (kaasukromatografia ja korkean suorituskyvyn nestekromatografia), joista yleisimmin käytetty menetelmä on MB-spektrofotometrinen menetelmä62. MB-menetelmän rajoituksena biologisten näytteiden H2S-mittauksessa on, että se mittaa kaikkia rikkiä sisältäviä yhdisteitä eikä vapaata H2S:ää63, koska se suoritetaan happamissa olosuhteissa, mikä johtaa rikin uuttamiseen biologisesta lähteestä64. American Public Health Associationin mukaan MB on kuitenkin standardimenetelmä sulfidin mittaamiseen vedessä65. Siksi tämä rajoitus ei vaikuta päätuloksiin NaHS:ia sisältävien liuosten epävakaudesta. Lisäksi tutkimuksessamme sulfidin talteenotto vesi- ja seeruminäytteissä, jotka sisälsivät NaHS:ia, oli vastaavasti 91 % ja 93 %. Nämä arvot ovat linjassa aiemmin raportoitujen vaihteluvälien (77–92)66 kanssa, mikä osoittaa hyväksyttävän analyyttisen tarkkuuden42. On syytä huomata, että käytimme sekä uros- että naarasrottia Yhdysvaltain kansallisten terveyslaitosten (NIH) ohjeiden mukaisesti välttääksemme liiallista turvautumista pelkästään uroseläimillä tehtyihin prekliinisiin tutkimuksiin67 ja ottaaksemme mukaan sekä uros- että naarasrottia aina kun mahdollista68. Tätä seikkaa ovat korostaneet myös muut69,70,71.
Yhteenvetona voidaan todeta, että tämän tutkimuksen tulokset osoittavat, että juomavedestä valmistettuja NaHS-liuoksia ei voida käyttää H2S:n tuottamiseen niiden epästabiilisuuden vuoksi. Tämä antoreitti altistaisi eläimet epävakaille ja odotettua alhaisemmille NaHS-pitoisuuksille, joten löydökset eivät välttämättä sovellu ihmisiin.
Tässä tutkimuksessa käytetyt ja/tai analysoidut aineistot ovat saatavilla vastaavalta kirjoittajalta kohtuullisesta pyynnöstä.
Szabo, K. Vetysulfidin (H2S) tutkimuksen aikajana: ympäristömyrkystä biologiseksi välittäjäksi. Biochemistry and Pharmacology 149, 5–19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
Abe, K. ja Kimura, H. Rikkivedyllä voi olla rooli endogeenisena neuromodulaattorina. Journal of Neuroscience, 16, 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
Chirino, G., Szabo, C. ja Papapetropoulos, A. Rikkivedyllä on fysiologinen rooli nisäkässoluissa, -kudoksissa ja -elimissä. Reviews in Physiology and Molecular Biology 103, 31–276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
Dillon, KM, Carrazzone, RJ, Matson, JB, ja Kashfi, K. Typpioksidin ja rikkivedylle tarkoitettujen soluvälitteisten annostelujärjestelmien kehittyvä lupaus: yksilöllisen lääketieteen uusi aikakausi. Biochemistry and Pharmacology 176, 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
Sun, X., ym. Pitkäaikainen hitaasti vapautuvan rikkivetydonorin anto voi estää sydänlihaksen iskemiaa/reperfuusiovauriota. Scientific reports 7, 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
Sitdikova, GF, Fuchs, R., Kainz, W., Weiger, TM ja Hermann, A. BK-kanavan fosforylaatio säätelee rikkivety (H2S) -herkkyyttä. Frontiers in Physiology 5, 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Sitdikova, GF, Weiger, TM ja Hermann, A. Rikkivety tehostaa kalsiumaktivoitujen kaliumkanavien (BK) aktiivisuutta rotan aivolisäkkeen kasvainsoluissa. Archit. Pfluegers. 459, 389–397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
Jeddy, S., ym. Rikkivety tehostaa nitriitin suojaavaa vaikutusta sydänlihaksen iskemia-reperfuusiovauriota vastaan ​​tyypin 2 diabeetikoilla rotilla. Typpioksidi 124, 15–23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
Corvino, A., ym. H2S-donorikemian trendit ja sen vaikutus sydän- ja verisuonitauteihin. Antioksidantit 10, 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
DeLeon, ER, Stoy, GF, ja Olson, KR (2012). Rikkivedylle ominaiset passiiviset häviöt biologisissa kokeissa. Analytical Biochemistry 421, 203–207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
Nagy, P., ym. Fysiologisten näytteiden rikkivetymittausten kemialliset näkökohdat. Biochimica et Biophysical Acta 1840, 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
Kline, LL.D. Luonnonvesien rikkivedylle spektrofotometrinen määritys. Limnol. Oceanogr. 14, 454–458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
Olson, KR (2012). Käytännön harjoittelua rikkivedylle ominaisen kemian ja biologian alalla. ”Antioksidantit.” Redox Signaling. 17, 32–44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).