Proteiinien lajittelu eritysreitillä on välttämätöntä solukompartmentalisaation ja homeostaasin ylläpitämiseksi. Kuorivälitteisen lajittelun lisäksi lipidien rooli kinesiinilajittelussa erityskuljetuksessa on pitkään ollut peruskysymys, johon ei ole vielä vastattu. Tässä tutkimuksessa suoritamme samanaikaista moniväristä korkean resoluution reaaliaikaista 3D-kuvantamista todistaaksemme in vivo, että äskettäin syntetisoidut glykosyylifosfatidyyli-inositoli-immobilisoidut proteiinit, joilla on erittäin pitkät keramidilipidiryhmät, ryppäävät ja luokitellaan erikoistuneisiin endoplasman verkon poistumiskohtiin, jotka eroavat transmembraanisten proteiinien käyttämästä poistumiskohdasta. Lisäksi osoitamme, että keramidin ketjun pituus endoplasmisessa retikulumkalvossa on kriittinen tälle lajittelun selektiivisyydelle. Tutkimuksemme tarjoaa ensimmäisen suoran in vivo -todisteen proteiinilastien luokittelemiseksi lipidiketjun pituuden perusteella valikoiviin vientikohtiin eritysreitillä.
Eukaryoottisoluissa endoplasmisessa retikulumissa (ER) syntetisoidut proteiinit lajitellaan kuljetuksen aikana eritysreittiä pitkin toimitettavaksi sopivaan solukohteeseensa (1). Pintavälitteisen lajittelun lisäksi on pitkään spekuloitu, että tietyt lipidit voivat toimia myös selektiivisinä poistumispisteinä rypistäytymällä spesifisiin kalvodomeeneihin, jotka spesifioivat proteiineja (2-5). Suoraa in vivo -näyttöä tästä mahdollisesta lipidipohjaisesta mekanismista ei kuitenkaan vielä ole. Tämän perusongelman ratkaisemiseksi tutkimme hiivassa, miten glykosyylifosfatidyyli-inositoli (GPI) -ankkuroidut proteiinit (GPI-AP:t) erittyvät ER:stä. GPI-AP:t ovat erilaisia ​​lipideihin kytkeytyneitä solun pintaproteiineja (6, 7). GPI-AP on erittyvä proteiini, joka on kiinnittynyt solukalvon ulompiin lehdyköihin glykolipidiosan (GPI-ankkurin) kautta. Ne hyväksyvät GPI-ankkurit konservatiivisina translaation jälkeisinä modifikaatioina ER-luumenissa (8). Kiinnittymisen jälkeen GPI-AP kulkeutuu Golgin laitteen (5, 9) läpi ER:stä solukalvolle. GPI-ankkureiden läsnäolo aiheuttaa GPI-AP:n kuljetuksen erillään transmembraanisista proteiineista (mukaan lukien muut solukalvon proteiinit) eritysreittiä pitkin (5, 9, 10). Hiivasoluissa GPI-AP:t erotetaan muista eritetyistä proteiineista endoplasmisessa retikulumissa ja sitten pakkautuvat ainutlaatuisiin vesikkeleihin, joita ympäröi kalvoproteiinikompleksi II (COPII) (6, 7). Tämän luokitteluprosessin määräävät tekijät ER-vientiprosessissa ovat epäselviä, mutta on arveltu, että tämä mekanismi saattaa vaatia lipidejä, erityisesti GPI-ankkurin lipidiosan rakenteellista uudelleenmuotoilua (5, 8). Hiivassa GPI-lipidien uudelleenmuotoilu alkaa heti GPI:n kiinnittymisen jälkeen, ja monissa tapauksissa se aiheuttaa keramidin sitoutumisen 26-hiiliseen pitkäketjuiseen tyydyttyneeseen rasvahappoon (C26:0) (11, 12). C26-keramidi on tähän mennessä hiivasolujen tärkein tuottama keramidi. Se syntetisoidaan ER:ssä ja suurin osa siitä viedään Golgin laitteeseen COPII-vesikkelien kautta (13). GPI-AP:n ER-vienti vaatii erityisesti jatkuvaa keramidisynteesiä (14, 15), ja puolestaan ​​keramidin muuntuminen inositolifosfaattikeramidiksi (IPC) Golgin laitteessa riippuu GPI-ankkurisynteesistä (16). Keinotekoisilla kalvoilla tehdyt biofysikaaliset tutkimukset ovat osoittaneet, että erittäin pitkän asyyliketjun keramidit voivat yhdistyä muodostaen järjestäytyneitä domeeneja, joilla on ainutlaatuiset fysikaaliset ominaisuudet (17, 18). Nämä tiedot johtavat hypoteesiin, että C26-keramidi ja C26-keramidin kanssa oleva GPI-AP käyttävät fysikaalisia ominaisuuksiaan yhdistyäkseen järjestäytyneiksi alueiksi tai alueiksi suhteellisen epäsiistissä ER-kalvon lipidiympäristössä. Se koostuu pääasiassa lyhyistä ja tyydyttymättömistä glyserolipideistä (C16:1 ja C18:1) (19, 20). Nämä alueet kohdennetaan valikoivasti tiettyihin ER-ulostumiskohtiin (ERES), joissa keramidi ja keramidipohjainen GPI-AP voidaan kuljettaa yhdessä Golgiin samassa erillisessä COPII-vesikkelissä (5).
Tässä tutkimuksessa testasimme tätä lipidipohjaista mekanismia suoraan käyttämällä superresoluution konfokaalista reaaliaikaista kuvantamiskokroskopiaa (SCLIM), joka on huippuluokan mikroskopiatekniikka, jolla voidaan samanaikaisesti havaita fluoresoivasti merkittyjä proteiineja. Kolmivärisillä ja kolmiulotteisilla (3D) kuvilla on erittäin korkea resoluutio ja nopeus elävissä soluissa (21, 22).
Käytimme ensin SCLIM-teknologiaa määrittääksemme tarkemmin, miten normaali C26-keramidiryhmän sisältävä GPI-AP seulottiin transmembraanisesti erittyvistä proteiineista sen poistuttua ER:stä S. cerevisiae -bakteerissa. ER:n luokittelun tarkistamiseksi käytimme geneettistä järjestelmää, joka pystyy visualisoimaan suoraan ERESiin saapuvan uuden syntetisoidun lastin in vivo (7, 23). Lastiksi valitsimme C26-keramidipohjaisen GPI-AP Gas1:n, joka on merkitty vihreällä fluoresoivalla proteiinilla (GFP), ja transmembraanisesti erittyvän proteiinin Mid2:n, joka on merkitty lähi-infrapunafluoresoivalla proteiinilla (iRFP), jotka molemmat kohdistuvat solukalvoon (24–26). Lämpötilaherkässä sec31-1-mutantissa nämä kaksi lastia ilmentyvät galaktoosin indusoiman promoottorin ja konstitutiivisen ERES-markkerin alaisuudessa. Äärimmäisessä lämpötilassa (37 °C), koska sec31-1-mutaatio vaikuttaa COPII-kuorikomponentin Sec31 toimintaan COPII:n itämisen ja ER-viennin estämiseksi, uusi syntetisoitu lasti kertyy ER:ään (23). Jäähdytyksen jälkeen matalaan lämpötilaan (24 °C) sec31-1-mutanttisolut toipuivat eritysalueelta, ja kertynyt uusi synteettinen lasti alkoi poistua ER:stä. CLIM-visualisointi osoitti, että suurin osa äskettäin syntetisoiduista Gas1-GFP:stä ja Mid2-iRFP:stä kertyi edelleen sec31-1-mutanttisolujen ER:ään 37 °C:ssa inkuboinnin ja sitten 24 °C:ssa 5 minuutin ajan vapautumisen jälkeen (kuva 1). Koska Mid2-iRFP on jakautunut koko ER-kalvolle ja Gas1-GFP on tiivistynyt ja kerääntynyt epäjatkuvalle ER-kalvoalueelle, niiden jakautuminen on täysin erilainen (kuva 1, A–C ja video S1). Lisäksi, kuten kuvassa 1D on esitetty, Gas1-GFP-klusterissa ei ole Mid2-iRFP:tä. Nämä tulokset osoittavat, että GPI-AP ja transmembraaniproteiinit erotettiin eri ER-kalvoalueille varhaisessa vaiheessa. Gas1-GFP-klusteri on spesifisen mCherryn COPII-kuoriproteiini Sec13:lla leimatun ERES:n vieressä (kuva 1, E ja F, sekä video S1) (23).
sec31-1-solut ilmentävät galaktoosin indusoimia eritteitä, pitkän asyyliketjun (C26) keramidi GPI-AP Gas1-GFP:tä (GPI-AP, vihreä) ja transmembraaniproteiinia Mid2-iRFP:tä (TMP, sininen). Tätä konstruktiivista ERES-leimausta käyttävää Sec13-mCherryä (ERES, magenta) inkuboitiin 37 °C:ssa 30 minuuttia, siirrettiin 24 °C:seen ja kuvattiin SCLIM:llä 5 minuuttia myöhemmin. (A-C) esittää edustavan yhdistetyn tai yksittäisen 2D-kuvan tasosta (A), 10 z-leikkauksen 2D-projektiokuvan (B) tai 3D-solupallonpuoliskon kuvan lastista ja ERES-markkereista (C). Skaalapalkki 1 μm (A ja B). Skaalayksikkö on 0,551 μm (C). Gas1-GFP:tä havaittiin erillisissä ER-alueilla tai -klustereissa, kun taas Mid2-iRFP:tä havaittiin ja se jakautui koko ER-kalvolle (C). (D) Kaavio näyttää Gas1-GFP:n ja Mid2-iRFP:n suhteellisen fluoresenssin intensiteetin Gas1-GFP-klusterissa valkoista nuoliviivaa pitkin (vasen). AU, mielivaltainen yksikkö. (E ja F) edustavat 3D-kuvaa, joka yhdistää tavarat ja ERES-merkin. Gas1-GFP-klustereita havaittiin lähellä tiettyä ERES:iä. Skaalayksikkö on 0,551 μm. (F) Valkoinen yhtenäinen nuoli merkitsee ERES:iin liittyvää Gas1-GFP-klusteria. Keskimmäinen ja oikea paneeli näyttävät yhdistetyn suurennetun 3D-kuvan ja kierretyn näkymän valitusta Gas1-GFP-klusterista.
Gas1-GFP-klusterin ja tietyn ERES:n välinen läheinen spatiaalinen suhde osoittaa, että Gas1-GFP voi siirtyä selektiiviseen ERES:iin, mikä eroaa Mid2-iRFP:n käyttämästä selektiivisyydestä poistuakseen ER:stä. Tämän mahdollisuuden selvittämiseksi määritimme ERES-suhteen vain yhdelle tai kahdelle hyödykkeelle (kuva 2, A–C). Havaitsimme, että useimmat ERES:t (70 %) sisältävät vain yhden tyyppistä lastia. Kuvan 2C alin kuva näyttää kaksi tyypillistä esimerkkiä ERES:istä, joissa on vain Gas1-GFP (kuva 1) tai vain Mid2-iRFP (kuva 2). Sitä vastoin noin 20 % ERES:istä sisältää kaksi lastia, jotka ovat päällekkäisiä samalla alueella. Havaittiin, että jotkut ERES:t (10 %) sisälsivät kahden tyyppistä lastia, mutta ne eristivät itsensä selvästi eri alueille. Siksi tämä tilastollinen analyysi osoittaa, että ER:n viennin jälkeen GPI-AP Gas1-GFP ja transmembraaninen lasti Mid2-iRFP jakautuvat eri ERES:eihin (kuva 2D). Tämä lajittelutehokkuus on hyvin yhdenmukainen aiemman biokemiallisen analyysin (6) ja morfologisen määrityksen (7) kanssa. Voimme myös tarkkailla karanteenissa olevan lastin käyttäytymistä ERESissä (kuva 2E ja video S2). Kuva 2E osoittaa, että vain pieni osa Gas1-GFP:stä (paneeli 3) tai Mid2-iRFP:stä (paneeli 4) saapuu ERESiin yhdeltä puolelta ja on rajoittunut erilliselle alueelle. Kuvan 2E paneeli 5 osoittaa, että Gas1-GFP:tä ja Mid2-iRFP:tä löytyy joskus samasta ERESistä, mutta ne saapuvat eri puolilta ja ovat keskittyneet erillisille alueille, jotka saattavat edustaa eri COPII-vesikkeleitä. Vahvistimme myös, että havaittu C26-keramidipohjaisen GPI-AP Gas1:n erottuminen ja luokittelu selektiiviseksi ERESiksi on spesifistä, koska toinen transmembraaninen erityslasti, GFP-merkitty solukalvon proteiini Axl2 (27), käyttäytyy samalla tavalla kuin Mid2-iRFP. (kuva S1 ja video S3). Äskettäin syntetisoitu Axl2-GFP jakautuu ER-kalvon läpi kuten Mid2-iRFP (kuva S1, A ja B), ja se lokalisoituu yhdessä Mid2-iRFP:n kanssa useimmissa ERES-järjestelmissä (kuva S1, B–D). Kuvan 1 paneelit 1 ja 2. Kuva S1C näyttää kaksi tyypillistä esimerkkiä ERES:stä, jossa kaksi transmembraanista lastia limittyy. Näissä tapauksissa molemmat hyödykkeet saapuvat ERES:iin yhdessä (kuva S1E, paneeli 3 ja video S3).
Galaktoosin indusoimia eritteitä ilmentävät sec31-1-solut, Gas1-GFP (GPI-AP, vihreä) ja Mid2-iRFP (TMP, sininen) sekä konstitutiivinen ERES-merkintä Sec13-mCherry (ERES, magenta). 30 minuutin inkuboinnin jälkeen °C:ssa ne siirrettiin 24 °C:seen eritysblokin vapauttamiseksi ja kuvattiin SCLIM:llä 20 minuutin kuluttua. (A–C) Edustavat 2D-projektiokuvat (A; skaalapalkki, 1 μm) tai 3D-solujen puolipallokuvat (B ja C; skaalayksikkö, 0,456 μm) lastista ja 10 z-leikkauksesta, jotka on merkitty ERES:llä. Alempi paneeli (B)-kuvassa ja paneeli (C)-kuvassa näyttävät käsiteltyjä kuvia, jotka näyttävät vain ERES:ssä olevat tavarat (magenta) [Gas1-GFP (harmaa) ja Mid2-iRFP (vaaleansininen)]. (C) Avoin nuoli: ERES kuljettaa vain yhtä lastia (1–4). Harmaa nuoli: ERES sisältää erillistä lastia (5). Valkoinen yhtenäinen nuoli: ERES sisältää samassa paikassa olevaa lastia. Alla: Valittu yksittäinen ERES sisältää vain Gas1-GFP:tä (1) tai Mid2-iRFP:tä (2). Skaalapalkki, 100 nm. (D) Kohdassa (C) kuvatun mikrovalokuvan kvantifiointi. Keskimääräinen prosenttiosuus ERES:stä, joka sisältää vain yhtä lastia (Gas1-GFP tai Mid2-iRFP), erillistä lastia ja päällekkäistä lastia. Kolmessa riippumattomassa kokeessa n = 432 54 solussa. Virhepalkki = keskihajonta. Kaksisuuntainen parittamaton t-testi. *** P = 0,0002. (E) 3D-kuva valitusta karanteenissa olevasta lastista, joka on merkitty (C):llä. Gas1-GFP (vihreä) (3) tai Mid2-iRFP (sininen) (4) saapuu ERES:iin (magenta) yhdeltä puolelta ja rajoittuu pienelle alueelle ERES:n sisällä. Joskus molemmat lastityypit saapuvat samaan ERES:iin (5) samalta puolelta ja rajoittuvat erilliselle alueelle ERES:n sisällä. Skaalapalkki, 100 nm.
Seuraavaksi testasimme hypoteesia, jonka mukaan ER-kalvossa oleva pitkän asyyliketjun keramidi (C26) ohjaa Gas1:n spesifistä klusteroitumista ja lajittelua selektiivisiksi ERES-substituoituiksi soluiksi. Tätä varten käytimme muunneltua hiivakantaa GhLag1, jossa kaksi endogeenistä keramidisyntaasia Lag1 ja Lac1 oli korvattu GhLag1:llä (puuvillan Lag1-homologi), jolloin saatiin hiivakanta, jonka solukalvon keramidikanta oli lyhyempi kuin villityypin kanta (kuva 3A) (28). Massaspektrometria (MS) -analyysi osoitti, että villityypin kannoissa 95 % keramidin kokonaismäärästä on erittäin pitkäketjuista (C26) keramidia, kun taas GhLag1:ssä 85 % keramidista on erittäin pitkäketjuista (C18 ja C16). Vain 2 % keramidista on erittäin pitkäketjuista (C26) keramidia. Vaikka C18- ja C16-keramidit ovat tähän mennessä GhLag1-kalvossa havaitut tärkeimmät keramidit, MS-analyysi vahvisti myös, että GhLag1-kannassa ilmentyvän Gas1-GFP:n GPI-ankkuri sisältää C26-keramidia, joka on verrattavissa villityypin lipideihin. Laatu on sama (kuva 3A) (26). Tämä tarkoittaa siis, että keramidin uudelleenmuokkausentsyymi Cwh43 on erittäin selektiivinen C26-keramidille, kuten kuvassa 26 on esitetty, ja se sisällyttää ensisijaisesti GPI-ankkurin pienestä määrästä C26-keramidia GhLag1-kannassa. S2 (29). GhLag1-solukalvo sisältää kuitenkin pohjimmiltaan vain C18-C16-keramidia, kun taas Gas1-GFP:ssä on edelleen C26-keramidia. Tämä tekee tästä kannasta ihanteellisen työkalun ratkaisemaan erityisesti kalvokeramidin asyyliketjun pituuteen liittyvää ongelmaa ER:ssä. Luokan ja lajittelun hypoteettinen rooli. Seuraavaksi tutkimme ensin C26 Gas1-GFP:n kykyä kerääntyä klustereihin GhLag1-soluissa, joissa on lämpötilaherkkä sec31-1-mutanttialleeli, tavanomaisen fluoresenssimikroskopian avulla, jossa vain pitkä (C18-C16) ketju esiintyy ER-kalvon keramidissa (kuva 3). Havaitsimme, että sec31-1:ssä suurin osa Gas1-GFP:stä oli keskittynyt klustereihin, kun taas pitkän (C18-C16) keramidipitoisen ER-kalvon sec31-1 GhLag1:n Gas1-GFP ei ollut pääosin klusteroitunut ja jakautunut koko ER-kalvoon. Tarkemmin sanottuna, koska C26-keramidipohjainen klusteroituminen liittyy läheisesti spesifiseen ERES:iin (kuva 1), tutkimme seuraavaksi, voiko tähän prosessiin liittyä myös ER-vientiproteiinimekanismin toiminta. GPI-AP käyttää erityistä COPII-järjestelmää ER-vientiin, jota Ted1:n GPI-ankkurin glykaaniosan rakenteellinen uudelleenmuokkaus säätelee aktiivisesti (30, 31). Transmembraaninen lastireseptori p24-kompleksi tunnistaa rekombinantin GPI-glykaanin, joka puolestaan ​​rekrytoi selektiivisesti Lst1:n, joka on COPII:n tärkeimmän lastia sitovan alayksikön Sec24 spesifinen isoformi, muodostaen GPI-AP-rikkaan COPII-vesikkelin (31-33). Siksi rakensimme kaksoismutantin, joka yhdisti näiden yksittäisten proteiinien (p24-kompleksin komponentti Emp24, GPI-glykaanin uudelleenmuokkausentsyymi Ted1 ja spesifinen COPII-alayksikkö Lst1) deleetion sec31-1-mutanttikannan kanssa ja tutkimme, onko mahdollista muodostaa Gas1-klusteri GFP (kuva 3). Havaitsimme, että sec31-1emp24Δ:ssä ja sec31-1ted1Δ:ssä Gas1-GFP on pääasiassa klusteroimaton ja jakautunut koko ER-kalvolle, kuten aiemmin havaittiin sec31-1 GhLag1:ssä, kun taas sec31-1lst1Δ:ssä Gas1-GFP on samanlainen kuin sec31-1. Nämä tulokset osoittavat, että C26-keramidin läsnäolon lisäksi ER-kalvossa Gas1-GFP:n klusteroituminen edellyttää myös sitoutumista p24-kompleksiin, eikä se vaadi spesifistä Lst1:n rekrytointia. Seuraavaksi tutkimme mahdollisuutta, että keramidin ketjun pituus ER-kalvossa voi säädellä Gas1-GFP:n sitoutumista p24:ään. Havaitsimme kuitenkin, että C18-C16-keramidin läsnäolo kalvossa ei vaikuta p24-kompleksin rekonstruoimiin GPI-glykaaneihin (kuvat S3 ja S4, A ja B) tai sitoutumiseen GPI-AP:hen ja GPI-AP:n vientikykyyn. COPII-alatyypin Lst1 rekrytointi (kuva S4C). Siksi C26-keramidista riippuva klusteroituminen ei vaadi proteiinien vuorovaikutusta eri ER-vientiproteiinimekanismien kanssa, vaan tukee vaihtoehtoista lajittelumekanismia, jota ohjaa lipidien pituus. Seuraavaksi analysoimme, onko keramidin asyyliketjun pituus ER-kalvossa tärkeä Gas1-GFP:n tehokkaalle luokittelemiselle selektiiviseksi ERES:ksi. Koska lyhytketjuista keramidia sisältävän GhLag1-kannan Gas1 poistuu ER:stä ja siirtyy solukalvolle (kuva S5), uskomme, että jos lajittelua ohjaa keramidin asyyliketjun pituus, GhLag1-kannan Gas1 voidaan uudelleenohjata ja ylittää. ERES-tuotteet, joilla on sama kalvo.
(A) GhLag1-solukalvo sisältää pääasiassa lyhyempiä C18-C16-keramideja, kun taas Gas1-GFP:n GPI-ankkurissa on edelleen sama C26 IPC kuin villityypin soluissa. Yllä: keramidin asyyliketjun pituusanalyysi villityypin (Wt) ja GhLag1p-kantojen solukalvossa massaspektrometrialla (MS). Data edustaa kokonaiskeramidin prosenttiosuutta. Kolmen riippumattoman kokeen keskiarvo. Virhepalkki = keskihajonta. Kaksisuuntainen pariton t-testi. **** P <0,0001. Alapaneeli: MS-analyysi Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI-ankkurissa olevan IPC:n asyyliketjun pituudesta villityypin ja GhLag1p-kannoissa. Data edustaa kokonaisIPC-signaalin prosenttiosuutta. Viiden riippumattoman kokeen keskiarvo. Virhepalkki = keskihajonta. Kaksisuuntainen pariton t-testi. ns, ei tärkeä. P = 0,9134. (B) Galaktoosi-indusoitua Gas1-GFP:tä ilmentävien sec31-1-, sec31-1 GhLag1-, sec31-1emp24Δ-, sec31-1ted1Δ- ja sec31-1lst1Δ-solujen fluoresenssimikroskooppikuvat inkuboitiin 37 °C:ssa 30 minuuttia ja siirrettiin rutiininomaiseen fluoresenssimikroskopiaan 24 °C:n jälkeen. Valkoinen nuoli: ER Gas1-GFP -klusteri. Avoin nuoli: Klusteriton Gas1-GFP on jakautunut koko ER-kalvolle, mikä osoittaa ER:lle tyypillistä tumarengasvärjäytymistä. Skaalapalkki, 5 μm. (C) Kohdassa (B) kuvatun mikrovalokuvan kvantifiointi. Keskimääräinen prosenttiosuus soluista, joilla on täplikäs Gas1-GFP-rakenne. Kolmessa riippumattomassa kokeessa n≥300 solua. Virhepalkki = keskihajonta. Kaksisuuntainen parittamaton t-testi. **** P <0,0001.
Ratkaistaksemme tämän ongelman suoraan suoritimme Gas1-GFP:n ja Mid2-iRFP:n SCLIM-visualisoinnin GhLag1:ssä, jossa on lämpötilaherkkä sec31-1-mutanttialleeli (kuva 4 ja video S4). Kun ER:ää pidettiin 37 °C:ssa ja myöhemmin vapautettiin 24 °C:ssa, suurin osa äskettäin syntetisoidusta Gas1-GFP:stä ei ollut kasaantunut eikä jakautunut ER-kalvolle, kuten perinteisillä mikroskoopeilla havaittiin (kuva 4, A ja B). Lisäksi suuri osa ERES:stä (67 %) sisältää kahden tyyppistä lastia samassa paikassa (kuva 4D). Kuvan 4C paneelit 1 ja 2 esittävät kaksi tyypillistä esimerkkiä ERES:stä, jossa Gas1-GFP ja Mid2-GFP ovat päällekkäisiä. Lisäksi molemmat hyödykkeet rekrytoitiin samaan ERES:iin (kuva 4E, paneeli 3 ja video S4). Tuloksemme osoittavat siis, että keramidiasyyliketjun pituus ER-kalvossa on tärkeä tekijä ER-proteiinien aggregaatiossa ja luokittelussa.
Galaktoosin indusoimia eritteitä ilmentävät Sec31-1 GhLag1 -solut, Gas1-GFP (GPI-AP, vihreä) ja Mid2-iRFP (TMP, sininen) sekä konstitutiivinen ERES-leimattu Sec13-mCherry (ERES, magenta). Inkuboidaan 37 °C:ssa. Jatka 30 minuuttia, laske lämpötila 24 °C:seen eritteiden vapauttamiseksi ja kuvaa SCLIM:llä 20 minuutin kuluttua. (A–C) Edustavat 2D-projektiokuvat (A; skaalapalkki, 1 μm) tai 3D-solujen puolipallokuvat (B ja C; skaalayksikkö, 0,45 μm) 10 z-leikkauksesta, jotka on merkitty lastilla ja ERES:llä. Alempi paneeli (B)-kuvassa ja paneeli (C)-kuvassa näyttävät käsiteltyjä kuvia, jotka näyttävät vain ERES:ssä olevat tuotteet (magenta) [Gas1-GFP (harmaa) ja Mid2-iRFP (vaaleansininen)]. (C) Valkoinen nuoli: ERES, tuotteet päällekkäin. Tyhjä nuoli: ERES sisältää vain yhden tuotteen. Alempi paneeli: Valitulla ERES:llä on päällekkäisiä hyödykkeitä (1 ja 2), jotka on merkitty (C):llä. Skaalapalkki, 100 nm. (D) Kohdassa (C) kuvatun mikrovalokuvan kvantifiointi. sec31-1- ja sec31-1 GhLag1 -yksiköissä on mukana vain yksi lasti (Gas1-GFP tai Mid2-iRFP), ja ERES:n keskimääräinen prosenttiosuus yksittäiselle ja päällekkäiselle lastille. Kolmessa riippumattomassa kokeessa n = 432 54 solussa (sec31-1) ja n = 430 47 solussa (sec31-1 GhLag1). Virhepalkki = keskihajonta. Kaksisuuntainen parittamaton t-testi. *** P = 0,0002 (sec31-1) ja ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Valitun ERES:n 3D-kuva, jossa päällekkäinen lasti (3) on merkitty (C):llä. Gas1-GFP (vihreä) ja Mid2-iRFP (sininen) lähestyvät ERESiä (magenta) samalta puolelta ja pysyvät samalla ERES:n rajoitetulla alueella. Skaalapalkki, 100 nm.
Tämä tutkimus tarjoaa suoraa in vivo -todisteita siitä, että lipidipohjaiset proteiinilastut luokitellaan valikoiviin vientikohtiin eritysreitillä, ja paljastaa asyyliketjun pituuden merkityksen luokittelun selektiivisyydelle. Käyttämällä tehokasta ja huippuluokan mikroskopiatekniikkaa nimeltä SCLIM, osoitimme hiljattain syntetisoidun Gas1-GFP:n (solukalvon tärkeä GPI-AP, jolla on erittäin pitkä asyyliketjun (C26) keramidilipidiosa) hiivassa. Erillisiksi ER-alueiksi ryhmittyneet alueet liittyvät spesifisiin ERES-alueisiin, kun taas transmembraanisesti erittyvät proteiinit ovat jakautuneet koko ER-kalvolle (kuva 1). Lisäksi nämä kaksi hyödyketyyppiä pääsevät selektiivisesti eri ERES-alueisiin (kuva 2). Solurakenteen asyyliketjun pituus kalvossa lyhenee C26:sta C18-C16:een, Gas1-GFP-klusteri hajaantuu erilliseksi ER-alueeksi ja Gas1-GFP reititetään uudelleen poistumaan ER:stä transmembraaniproteiinin kanssa saman ERES-alueen kautta (kuva 3 ja kuva 34).
Vaikka GPI-AP käyttää erikoistunutta proteiinimekanismia ER:stä poistumiseen, havaitsimme, että C26-keramidista riippuvainen erottelu ei perustu erilaisiin proteiinivuorovaikutuksiin, jotka voisivat johtaa ERES:n erikoistumiseen (kuvat S4 ja S5). Sen sijaan tuloksemme tukevat vaihtoehtoista luokittelumekanismia, jota ohjaa lipidipohjainen proteiiniklusteroituminen ja sitä seuraava muiden lastien poissulkeminen. Havaintomme osoittavat, että tiettyyn ERES:iin liittyvältä Gas1-GFP-alueelta tai -klusterilta puuttuu transmembraanisesti erittyvä proteiini Mid2-iRFP, mikä osoittaa, että C26-keramidista riippuva GPI-AP-klusteri helpottaa niiden pääsyä asiaankuuluvaan ERES:iin ja samalla sulkee pois transmembraanisesti erittyvät proteiinit. Eritteet pääsevät tähän tiettyyn ERES:iin (kuvat 1 ja 2). Sitä vastoin C18-C16-keramidien läsnäolo ER-kalvossa ei aiheuta GPI-AP:n alueiden tai klustereiden muodostumista, joten ne eivät sulje pois tai korvaa transmembraanisesti erittyviä proteiineja samassa ERES:issä (kuvat 3 ja 4). Siksi ehdotamme, että C26-keramidi edistää erottelua ja luokittelua helpottamalla spesifiseen ERES:iin liittyvien proteiinien klusteroitumista.
Kuinka tämä C26-keramidista riippuvainen klusteroituminen tiettyyn ER-alueeseen saavutetaan? Kalvokeramidin taipumus erottua sivusuunnassa voi aiheuttaa sen, että GPI-AP ja C26-keramidi muodostavat pieniä ja välittömästi järjestäytyneitä lipidejä ER-kalvon epäsäännöllisemmässä lipidiympäristössä, joka sisältää lyhyempiä ja tyydyttymättömiä glyserolipidejä. Laadukkaat klusterit (17, 18). Nämä pienet väliaikaiset klusterit voidaan fuusioida edelleen suuremmiksi, vakaammiksi klustereiksi sitoutumisen jälkeen p24-kompleksiin (34). Tämän mukaisesti osoitimme, että C26 Gas1-GFP:n on oltava vuorovaikutuksessa p24-kompleksin kanssa muodostaakseen suurempia näkyviä klustereita (kuva 3). p24-kompleksi on heterotsygoottinen oligomeeri, joka koostuu neljästä eri p24-transmembraaniproteiinista hiivassa (35), mikä tarjoaa moniarvoisen sitoutumisen, mikä voi johtaa pienten GPI-AP-klusterien ristisidoksiin, jolloin muodostuu suurempi stabiili klusteri (34). GPI-AP-proteiinien ektodomeenien välinen vuorovaikutus voi myös edistää niiden aggregaatiota, kuten on osoitettu niiden Golgin kuljetuksen aikana nisäkkäiden polarisoiduissa epiteelisoluissa (36). Kuitenkin, kun ER-kalvossa on C18-C16-keramidia, kun p24-kompleksi sitoutuu Gas1-GFP:hen, suuria erillisiä klustereita ei muodostu. Taustalla oleva mekanismi voi riippua pitkän asyyliketjun keramidin erityisistä fysikaalisista ja kemiallisista ominaisuuksista. Keinotekoisten kalvojen biofysikaaliset tutkimukset osoittavat, että vaikka sekä pitkät (C24) että lyhyet (C18-C16) asyyliketjun keramidit voivat aiheuttaa faasierottumisen, vain pitkän asyyliketjun keramidit (C24) voivat edistää voimakasta kaarevuutta ja kalvon taipumista kalvon muodon muuttamiseksi. Keskinäisen viittauksen kautta (17, 37, 38). On osoitettu, että TMED2:n, Emp24:n ihmishomologin, transmembraaninen kierre on selektiivisesti vuorovaikutuksessa C18-keramidipohjaisen sfingomyeliinin kanssa sytoplasmisissa lohkoissa (39). Molekyylidynamiikan (MD) simulaatioiden avulla havaitsimme, että sekä C18- että C26-keramidit kerääntyvät Emp24:n transmembraanisen kierteen sytoplasmisten lohkojen ympärille, ja niillä on samanlaiset mieltymykset (kuva S6). On syytä huomata, että tämä viittaa siihen, että Emp24:n transmembraaninen kierre voi johtaa lipidien epäsymmetriseen jakautumiseen kalvossa. Tämä on tuore nisäkässoluihin perustuva tulos. Samankaltaiset MD-simulaatiot osoittavat myös eetterilipidien läsnäolon (40). Siksi oletamme, että C26-keramidi rikastuu paikallisesti ER26:n ​​kahdessa lohkossa. Kun GPI-AP sitoutuu suoraan moniarvoiseen p24:ään ja C26-keramidi kertyy p24:n ympärille sytoplasmisiin lohkoihin, se voi edistää siihen liittyvää proteiinien aggregaatiota ja kalvon kaarevuutta sormien kautta (41), mikä aiheuttaa GPI-AP:n erottumisen erillisiksi alueiksi ERES:n viereen, mikä myös suosii ER-kalvon voimakkaasti kaarevia alueita (42). Aiemmat raportit tukivat ehdotettua mekanismia (43, 44). Oligolektiinien, patogeenien tai vasta-aineiden moniarvoinen sitoutuminen keramidipohjaisiin glykosfingolipideihin (GSL) solukalvolla laukaisee suuren GSL:n aggregaation, tehostaa faasien erottumista ja aiheuttaa kalvon muodonmuutosta ja internalisaatiota (44). Iwabuchi ym. (43) Havaittiin, että pitkien (C24), mutta ei lyhyiden (C16) asyyliketjujen läsnä ollessa GSL-laktosyyliseramidiin sitoutunut moniarvoinen ligandi indusoi suurten klustereiden muodostumista ja kalvon invaginaatiota, ja sytoplasman Lyn-välitteinen signaalitransduktio läppälevyillä on lomittunut asyyliketjujen avulla kytketyissä neutrofiileissä.
Nisäkkäiden polarisoiduissa epiteelisoluissa anti-Golgin verkoston (TGN) pitoisuus apikaalisen solukalvon tasolla kontrolloi GPI-AP:n erottumista ja lajittelua (10, 45). Tätä aggregaatiota ohjaa GPI-AP:n oligomerisaatio (36), mutta se voi riippua myös hiivassa havaittavasta keramidiketjun pituudesta. Vaikka nisäkkäiden GPI-AP:llä on eetterilipidipohjainen ankkuri ja sen kemiallinen rakenne on hyvin erilainen kuin hyvin pitkän asyyliketjuisen keramidin, tuoreessa tutkimuksessa havaittiin, että molemmilla lipideillä on evolutiivisesti samanlaiset fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet ja toiminta (40). Siksi nisäkässolujen eetterilipidiosa voi olla samanlainen kuin hiivan C26-keramidi, ja sen tehtävänä on liittyä kalvon pitkäketjuiseen keramidiin edistääkseen GPI-AP:n aggregaatiota ja lajittelua. Vaikka tätä mahdollisuutta on vielä testattava suoraan, aiemmat havainnot tukevat sitä, että pitkän asyyliketjuisen keramidin kuljetusta Golgin kappaleeseen eivät suorita sytoplasmiset siirtoproteiinit, vaan se riippuu GPI-ankkureiden synteesistä kuten hiiva. Siksi evolutiivinen konservatiivinen mekanismi näyttää kykenevän selektiivisesti kuljettamaan hyvin pitkän asyyliketjun omaavaa keramidia ja GPI-AP:tä (13, 16, 20, 46, 47) samassa kuljetusvesikkelissä.
Hiivassa ja nisäkkäiden polarisoiduissa epiteelisoluissa GPI-AP:n aggregaatio ja erottuminen muista solukalvon proteiineista tapahtuu kaikki ennen solun pinnan saavuttamista. Paladino ym. (48) havaitsivat, että nisäkkäiden polarisoitujen epiteelisolujen TGN:ssä GPI-AP:n klusteroituminen ei ole välttämätöntä ainoastaan ​​GPI-AP:iden selektiiviselle luokittelemiselle apikaaliselle solukalvolle, vaan se myös säätelee GPI-AP:iden klusteroitumisorganisaatiota ja niiden biologista aktiivisuutta. Solun pinta. Hiivassa tämä tutkimus osoitti, että C26-keramidista riippuva GPI-AP-klusteri ER:ssä voi säädellä GPI-AP:n klusteroitumista ja toiminnallista aktiivisuutta solukalvolla (24, 49). Tämän mallin mukaisesti GhLag1-solut ovat allergisia GPI-estäjille tai lääkkeille, jotka vaikuttavat soluseinän eheyteen (28), ja kärkikeramidin toiminnallisten Gas1-GFP-klustereiden (49) tarve hiivasolujen pariutumisessa viittaa hLag1-solujen mahdollisiin fysiologisiin seurauksiin. GPI-AP-virhe. Tulevan tutkimuksemme kohteena on kuitenkin jatkotutkimus siitä, onko solun pinnan toiminnallinen organisaatio ohjelmoitu ER:stä lipidien pituuteen perustuvalla lajittelumenetelmällä.
Tässä työssä käytetyt Saccharomyces cerevisiae -kannat on lueteltu taulukossa S1. Elävien solujen kuvantamiseen tarkoitetut SCLIM-kannat MMY1583 ja MMY1635 konstruoitiin W303-geenin taustalla. Nämä fluoresoivalla proteiinimerkillä varustetun Sec13-mCherryä ilmentävät kannat konstruoitiin polymeraasiketjureaktioon (PCR) perustuvalla menetelmällä käyttäen pFA6a-plasmidia templaattina (23). Fluoresoivalla proteiinilla leimattua Mid2-iRFP:tä GAL1-promoottorin säätelemänä ilmentävä kanta konstruoitiin seuraavasti. iRFP-KanMx-sekvenssin PCR-monistus pKTiRFP-KAN-vektorista (E. O'Shean lahja, Addgene-plasmidi numero 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; tutkimusresurssin tunniste (RRID): Addgene_64687) ja insertointi endogeenisen Mid2:n C-terminaaliin. Kun Mid2-iRFP-genomisekvenssi oli monistettu ja kloonattu GAL1-promoottoriin, se integroitiin integraatioplasmidin pRS306 Not I-Sac I -kohtaan. Tuloksena oleva plasmidi pRGS7 linearisoitiin Pst I:llä sen integroimiseksi URA3-lokukseen.
Gas1-GFP-fuusiogeeni ilmentyy GAL1-promoottorin säätelemänä sentromeeriplasmidissa (CEN), joka konstruoidaan seuraavasti. Gas1-GFP-sekvenssi monistettiin PCR:llä pRS416-GAS1-GFP-plasmidista (24) (lahja L. Popololta) ja kloonattiin CEN-plasmidin pBEVY-GL LEU2 (lahja C:ltä) Xma I–Xho I -kohtaan. Miller; Addgene-plasmidi numero 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Tuloksena oleva plasmidi nimettiin pRGS6:ksi. Axl2-GFP-fuusiogeeni ilmentyy myös pBEVY-GL LEU2 -vektorin GAL1-promoottorin säätelemänä, ja sen konstruointi on seuraava. Axl2-GFP-sekvenssi monistettiin PCR:llä pRS304-p2HSE-Axl2-GFP-plasmidista (23) ja kloonattiin pBEVY-GL LEU2 -vektorin BamHI-PstI-kohtaan. Tuloksena oleva plasmidi nimettiin pRGS12:ksi. Tässä tutkimuksessa käytettyjen oligonukleotidien sekvenssi on lueteltu taulukossa S2.
Kantaan lisättiin hiilenlähteeksi 0,2 % adeniinia ja 2 % glukoosia [YP-dekstroosia (YPD)], 2 % raffinoosipitoista [YP-raffinoosi] hiivauuteproteiini-p:tä (YP) (1 % hiivauutetta ja 2 % proteiinia (YPR)) tai 2 % galaktoosia [YP-galaktoosia (YPG)], tai synteettistä minimialustaa (0,15 % hiivatyppiemästä ja 0,5 % ammoniumsulfaattia) ravinnonsaannin edellyttämien sopivien aminohappojen ja emästen täydentämiseksi. Ja hiilenlähteeksi lisättiin 2 % glukoosia (synteettinen glukoosiminimialusta) tai 2 % galaktoosia (synteettinen galaktoosiminimialusta).
Reaaliaikaista kuvantamista varten lämpötilaherkkiä sec31-1-mutanttisoluja, jotka ilmensivät konstruktia GAL1-promoottorin alaisuudessa, kasvatettiin YPR-elatusaineessa 24 °C:ssa yön yli log-vaiheen puoliväliin. YPG:ssä 24 °C:ssa yhden tunnin induktion jälkeen soluja inkuboitiin SG:ssä 37 °C:ssa 30 minuuttia ja siirrettiin sitten 24 °C:seen eritysblokista vapautumiseksi. Konkanavaliini A:ta käytettiin solujen kiinnittämiseen lasilevylle ja kuvantamiseen SCLIM-laitteella. SCLIM on yhdistelmä Olympus IX-71 käänteistä fluoresenssimikroskoopista ja UPlanSApo 100×1.4 numeerisen apertuurin öljylinssistä (Olympus), nopeasta ja korkean signaali-kohinasuhteen omaavasta pyörivästä konfokaalilevyskannerista (Yokogawa Electric), mukautetusta spektrometristä ja mukautetusta jäähdytyksestä. Järjestelmän kuvanvahvistin (Hamamatsu Photonics) voi tarjota suurennuslinssijärjestelmän, jonka lopullinen suurennus on ×266,7, ja varauskytketyn laitteen, joka moninkertaistaa elektroneja (Hamamatsu Photonics) (21). Kuvanotto suoritetaan räätälöidyllä ohjelmistolla (Yokogawa Electric). 3D-kuvien ottamiseen käytimme räätälöityä pietsosähköistä toimilaitetta objektiivin pystysuuntaiseen värähtelyyn ja keräsimme optiset osat 100 nm:n etäisyydellä toisistaan ​​pinoksi. Z-pinokuva muunnetaan 3D-vokselidataksi, ja pyörivän kiekon konfokaalimikroskoopissa käytettyä teoreettista pistehajontafunktiota käytetään dekonvoluutiokäsittelyyn Volocity-ohjelmistolla (PerkinElmer). Käyttämällä Volocity-ohjelmistoa kolokaatioanalyysin automaattiseen kynnysarvojen asettamiseen, ERES, mukaan lukien lasti, mitattiin. Viivaskannausanalyysi suoritettiin MetaMorph-ohjelmistolla (Molecular Devices).
Tilastollisen merkitsevyyden määrittämiseen käytetään GraphPad Prism -ohjelmistoa. Kaksisuuntaisessa Studentin t-testissä ja tavallisessa yksisuuntaisessa varianssianalyysissä (ANOVA) ryhmien välisten erojen katsotaan vaikuttavan merkittävästi P < 0,05 (*).
Gas1-GFP:n fluoresenssimikroskopiaa varten log-faasisoluja kasvatettiin yön yli YPD:ssä ja kerättiin sentrifugoimalla, pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella ja inkuboitiin jäillä vähintään 15 minuuttia, minkä jälkeen niitä tutkittiin mikroskoopilla aiemmin kuvatulla tavalla (24). Kuvaamiseen käytettiin Leica DMi8 -mikroskooppia (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS), joka oli varustettu objektiivilla, L5 (GFP) -suodattimella, Hamamatsu-kameralla ja Application Suite X (LAS X) -ohjelmistolla.
Näytteet denaturoitiin SDS-näytepuskurilla 65 °C:ssa 10 minuutin ajan ja erotettiin sitten SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (PAGE). Immunoblot-analyysiä varten ladattiin 10 μl näytettä kaistaa kohden. Primaarinen vasta-aine: Käytä kaniinin polyklonaalista anti-Gas1-vasta-ainetta laimennettuna suhteessa 1:3000, kaniinin polyklonaalista anti-Emp24-vasta-ainetta laimennettuna suhteessa 1:500 ja kaniinin polyklonaalista anti-GFP-vasta-ainetta (lahja H. Riezmanilta) laimennettuna suhteessa 1:3000. Hiiren monoklonaalista anti-Pgk1-vasta-ainetta käytettiin laimennettuna suhteessa 1:5000 (lahja J. de la Cruzilta). Sekundäärinen vasta-aine: Piparjuuriperoksidaasiin (HRP) konjugoitua vuohen anti-kaniini-immunoglobuliini G:tä (IgG) käytettiin laimennettuna suhteessa 1:3000 (Pierce). HRP-konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG:tä käytettiin laimennettuna suhteessa 1:3000 (Pierce). Immuunivastevyöhyke havaittiin SuperSignal West Pico -reagenssin (Thermo Fisher Scientific) kemiluminesenssimenetelmällä.
Kuten julkaisussa (31) on kuvattu, rikastetulle ER-fraktiolle suoritettiin luonnollinen immunosaostuskoe. Lyhyesti sanottuna hiivasolut pestiin TNE-puskurilla [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridi ja proteaasi-inhibiittoriseos) 600 nm:ssä (OD600) optisella tiheydellä 100 kahdesti. Se rikottiin lasihelmillä, ja sitten solujätteet ja lasihelmet poistettiin sentrifugoimalla. Supernatantti sentrifugoitiin sitten 17 000 g:n voimalla 15 minuuttia 4 °C:ssa. Pelletti suspendoitiin uudelleen TNE:hen ja digitalis saponiinia lisättiin lopulliseen 1 %:n pitoisuuteen. Suspensiota inkuboitiin 1 tunti pyörittäen 4 °C:ssa, ja sitten liukenemattomat komponentit poistettiin sentrifugoimalla 13 000 g:n voimalla 4 °C:ssa 60 minuuttia. Gas1-GFP-immunosaostusta varten näyte esi-inkuboidaan tyhjien agaroosihelmien (ChromoTek) kanssa 4 °C:ssa 1 tunnin ajan ja inkuboidaan sitten GFP-Trap_A:n (ChromoTek) kanssa 4 °C:ssa 3 tunnin ajan. Immunosaostetut helmet pestiin viisi kertaa TNE:llä, joka sisälsi 0,2 % digoksigeniiniä, eluoitiin SDS-näytepuskurilla, erotettiin SDS-PAGE:lla ja analysoitiin immunoblot-menetelmällä.
Kuten julkaisussa (31) on kuvattu, ristisilloitusmääritys suoritettiin rikastetulle ER-fraktiolle. Lyhyesti sanottuna rikastettua ER-fraktiota inkuboitiin 0,5 mM ditiobis(sukkinimidyylipropionaatin) kanssa (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20 °C, 20 min). Ristisilloitusreaktio sammutettiin lisäämällä glysiiniä (loppupitoisuus 50 mM, 5 minuuttia, 20 °C).
Kuten aiemmin on kuvattu (50), villityypin ja GhLag1-kantojen keramidin MS-analyysi suoritettiin. Lyhyesti sanottuna soluja kasvatettiin eksponentiaaliseen vaiheeseen (3–4 OD600-yksikköä/ml) YPD:ssä 30 °C:ssa, ja 25 × 107 solua kerättiin. Niiden metabolia pysäytettiin trikloorietikkahapolla. Käytä uuttoliuotinta [etanoli, vesi, eetteri, pyridiini ja 4,2 N ammoniumhydroksidi (15:15:5:1:0,018 v/v)] ja 1,2 nmol sisäistä standardia C17-keramidia (860517, Avanti-polaarinen lipidi) laatua). Käytä monometyyliamiinireagenssia [metanoli, vesi, n-butanoli ja metyyliamiiniliuos (4:3:1:5 v/v)] uutteen lievän emäksisen hydrolyysin suorittamiseksi ja käytä sitten vedellä kyllästettyä n-butanolia suolan poistamiseksi. Lopuksi uute suspendoitiin uudelleen positiivisen tilan liuottimeen [kloroformi/metanoli/vesi (2:7:1) + 5 mM ammoniumasetaatti] ja injektoitiin massaspektrometriin. Monireaktioseurantaa (MRM) suoritettiin sfingolipidimolekyylien tunnistamiseksi ja kvantifioimiseksi. TSQ Vantage -tertiäärinen kvadrupolimassaspektrometri (Thermo Fisher Scientific) on varustettu robottikäyttöisellä nanovirtausionilähteellä Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) lipidianalyysiä varten. Törmäysenergia on optimoitu kullekin keramidikategorialle. MS-tiedot saatiin positiivisessa tilassa. Jokaiselle biologiselle toistolle lipidisignaali on kolmen riippumattoman mittauksen mediaani.
Kuten julkaisussa (31) on kuvattu, Gas1-GFP:tä ilmentävät solut (800×107) altistettiin luonnolliselle immunosaostukselle. Puhdistettu Gas1-GFP erotettiin SDS-PAGE:lla ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi (PVDF) -kalvolle. Proteiini visualisoitiin värjäämällä PVDF amidimustalla. Gas1-GFP-juova leikattiin PVDF:stä ja pestiin viisi kertaa metanolilla ja kerran nestekromatografia-MS (LC-MS) -laatuisella vedellä. Inkuboimalla kalvoliuskaa 500 μl:n 0,3 M NaOAc:n (pH 4,0), puskurin ja 500 μl:n vastaliuotetun 1 M natriumnitriittiseoksen kanssa 37 °C:ssa kolmen tunnin ajan, lipidifraktio vapautui Gas1-GFP:stä ja lysoitui. Inosiinifosfaattikeramidin vapautuminen glukosamiinin ja inositolin välillä (51). Tämän jälkeen kalvoliuska pestiin neljä kertaa LC-MS-laatuisella vedellä, kuivattiin huoneenlämmössä ja säilytettiin typpiatmosfäärissä -80 °C:ssa analyysiin asti. Kontrollina käytettiin jokaisessa kokeessa PVDF-kalvosta tehtyä nollanäytettä. Gas1-GFP:stä uutettu lipidi analysoitiin sitten MS:llä aiemmin kuvatulla tavalla (50). Lyhyesti sanottuna GPI-lipidiä sisältävät PVDF-liuskat suspendoitiin uudelleen 75 μl:aan negatiivista muottiliuotinta [kloroformi/metanoli (1:2) + 5 mM ammoniumasetaatti] ja niille tehtiin sähkösuihkutusion (ESI) - sfingolipidilajien MRM/MS-analyysi (TSQ Vantage). Tässä tapauksessa MS-tiedot saatiin negatiivisen ionin tilassa.
Kuten aiemmin mainittiin, GPI-ankkurin lipidiosa erotettiin [3H]-inositolilla leimatusta GPI-AP:stä (16). Lipidit erotettiin ohutkerroskromatografialla käyttäen liuotinjärjestelmää (55:45:10 kloroformi-metanoli-0,25 % KCl) ja visualisoitiin FLA-7000-liuoksella (Fujifilm).
Gas1-GFP:tä (600×107) ilmentävät solut pestiin kahdesti TNE-puskurilla, jossa oli TNE-puskuria, rikottiin lasihelmillä ja sentrifugoitiin sitten solujätteiden ja lasihelmien poistamiseksi. Supernatantti sentrifugoitiin sitten 17 000 g:llä 1 tunnin ajan 4 °C:ssa. Pelletti pestiin TNE:llä ja inkuboitiin 1 U PI-PLC:n (Invitrogen) kanssa TNE:ssä, joka sisälsi 0,2 % digitalis saponiinia, 1 tunnin ajan 37 °C:ssa. Entsyymikäsittelyn jälkeen kalvo poistettiin sentrifugoimalla 17 000 g:llä 4 °C:ssa 1 tunnin ajan. Gas1-GFP:n immunosaostamiseksi supernatanttia inkuboitiin GFP-Trap_A:n (ChromoTek) kanssa 4 °C:ssa yön yli. SDS-PAGE:lla erotettu puhdistettu Gas1-GFP värjättiin Coomassie Brilliant Blue -värillä. Gas1-GFP-värjäytymisvyöhyke leikattiin irti akveduktia ympäröivästä harmaasta alueesta, ja sitten jodiasetamidilla alkyloinnin ja ditiotreitolilla pelkistyksen jälkeen suoritettiin geelissä tapahtuva trypsiinin käyttö digestiossa. Tryptiset peptidit ja peptidit uutettiin ja kuivattiin GPI-glykaaneilla. Kuivattu peptidi liuotettiin 20 μl:aan vettä. Injektoitiin osa (8 μl) nestekromatografiaan (LC). Peptidien erottamiseen käytettiin oktadekyylisilaanikolonnia (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; sisähalkaisija 150 mm × 1,0 mm; Nomura Chemical, Aichin prefektuuri, Japani). Liikkuva faasi oli liuotin A (0,08 % muurahaishappoa) ja liuotin B (0,15 % muurahaishappoa 80 % asetonitriilissä). Kolonni eluoitiin liuottimella A Accela HPLC -järjestelmällä (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) 55 minuutin kuluessa 50 μl min-1 virtausnopeudella 5 minuutin ajan, minkä jälkeen liuottimen B pitoisuus nostettiin 40 %:iin (Yhdysvallat). Eluaattia johdettiin jatkuvasti ESI-ionilähteeseen, ja tryptiset peptidit ja GPI-glykaaneja sisältävät peptidit analysoitiin LTQ Orbitrap XL -laitteella (hybridi lineaarinen ioniloukku-orbitrap-massaspektrometri; Thermo Fisher Scientific). MS-laitteistossa kapillaarilähteen jännite asetettiin 4,5 kV:iin ja siirtokapillaarin lämpötila pidettiin 300 °C:ssa. Kapillaarijännite ja putkilinssin jännite asetettiin vastaavasti 15 V:iin ja 50 V:iin. MS-tiedot saatiin positiivisen ionimoodissa (resoluutio 60 000; massatarkkuus 10 miljoonasosaa) massa-alueella 300/m/z, massa/varaussuhde (m/z) 3000. MS/MS-tiedot saatiin LTQ Orbitrap XL:n ioniloukun kautta [kolme ensimmäistä numeroa, joista tiedot riippuvat, törmäyksen aiheuttama dissosiaatio (CID)].
MD-simulaatiot suoritettiin käyttämällä GROMACS (52) -ohjelmistoa ja MARTINI 2 -voimakenttää (53-55). CHARMM GUI Membrane Builder -ohjelmaa (56, 57) käytettiin sitten kaksoiskerroksen rakentamiseen, joka sisälsi dioleoyylifosfatidyylikoliinia (DOPC) ja Cer C18:aa tai DOPC:tä ja Cer C26:ta. Cer C26:n topologia ja koordinaatit johdetaan DXCE:stä poistamalla ylimääräiset helmet sfingosiinihännästä. Käytä alla kuvattua prosessia kaksoiskerroksen tasapainottamiseen ja ajamiseen, ja käytä sitten järjestelmän viimeisiä koordinaatteja Emp24:ää sisältävän järjestelmän rakentamiseen. Hiivan Emp24:n transmembraaninen domeeni (tähteet 173–193) rakennettiin α-heliksiksi käyttämällä visuaalista MD (VMD) -molekyylirakennetyökalua (58). Sitten, päällekkäisten lipidien poistamisen jälkeen, proteiini rakeistettiin karkeasti ja insertoitiin kaksoiskerrokseen käyttämällä CHARMM GUI:ta. Lopullinen järjestelmä sisältää 1202 DOPC:tä ja 302 Cer C26:ta tai 1197 DOPC:tä ja 295 Cer C18:aa ja Emp24:ää. Järjestelmä ionisoidaan 0,150 M:n pitoisuuteen. Kahdelle kaksikerroskoostumukselle tehtiin neljä riippumatonta toistoa.
Lipidikaksoiskerros tasapainotetaan CHARMM GUI -prosessilla, johon kuuluu 405 000 askeleen minimointi ja tasapainottaminen. Prosessissa sijaintirajoitteita vähitellen vähennetään ja poistetaan, ja aika-askelta kasvatetaan 0,005 ps:stä 0,02 ps:ään. Tasapainotuksen jälkeen se tuottaa 6 µs aika-askelella 0,02 ps. Emp24:n lisäämisen jälkeen käytetään samaa CHARMM GUI -prosessia järjestelmän minimoimiseksi ja tasapainottamiseksi ja suoritetaan sitten 8 sekuntia tuotannossa.
Kaikissa järjestelmissä tasapainotusprosessin aikana painetta säädetään Berendsenin barostaatilla (59) ja tuotantoprosessin aikana Parrinello-Rahmanin barostaatilla (60). Kaikissa tapauksissa keskimääräinen paine on 1 bar ja käytetään semi-isotrooppista paineen kytkentäkaaviota. Tasapainotus- ja tuotantoprosessissa käytetään termostaattia (61), jossa on nopeuden uudelleenkalibrointi, proteiini-, lipidi- ja liuotinhiukkasten lämpötilan kytkemiseen vastaavasti. Koko toiminnan ajan tavoitelämpötila on 310 K. Sitoutumaton vuorovaikutus lasketaan luomalla paritteluluettelo Verletin menetelmällä, jonka puskuritoleranssi on 0,005. Couloumbin termi lasketaan käyttämällä reaktiokenttää ja 1,1 nm:n raja-arvoa. Vander-Waalsin termi käyttää raja-arvoa 1,1 nm:n raja-arvolla, ja Verletin raja-arvoa käytetään mahdollisen ajautumisen havaitsemiseen (62).
VMD:tä käyttäen DOPC-fosfaattihelmien tai keramidi AM1 -helmien ja proteiinin välinen raja-aallonpituus on 0,7 nm, ja proteiinin kanssa vuorovaikutuksessa olevien lipidien lukumäärä lasketaan. Laske ehtymis-rikastumiskerroin (DE) seuraavan kaavan mukaisesti kuten kohdassa (63): DE-kerroin = (lipidien kokonaismäärä proteiinissa 0,7) proteiinissa 0,7 (Cer:n määrä lipidien kokonaismäärässä)
Raportoitu arvo on keskiarvo, ja virhepalkit edustavat neljää toisistaan ​​riippumatonta SE-kopiota. DE-tekijän tilastollinen merkitsevyys lasketaan t-testillä [(keskiarvoDE-tekijä-1)/SE]. Laske P-arvo yksisuuntaisesta jakaumasta.
GROMACS-työkalua käytettiin Emp24:ää sisältävän järjestelmän 2D-sivutiheyskartan laskemiseen jäljen viimeisten 250 ns:n sisällä. Keramidin rikastus-/ehtymiskartan saamiseksi Cerin tiheyskartta jaettiin Cerin ja DOPC:n kartan summalla ja sitten Cerin pitoisuudella kehossa. Käytettiin samaa värikartta-asteikkoa.
Tämän artikkelin lisämateriaaleja on osoitteessa http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Tämä on avoimen saatavuuden artikkeli, joka on jaettu Creative Commons Nimeä-EiKaupallinen -lisenssin ehtojen mukaisesti. Tämä lisenssi sallii käytön, jakelun ja kopioinnin missä tahansa mediassa, kunhan lopullinen käyttö ei ole kaupallista hyötyä varten ja lähtökohtana on, että alkuperäinen teos on oikein. Viite.
Huomautus: Pyydämme sinua antamaan sähköpostiosoitteesi vain, jotta sivulle suosittelemasi henkilö tietää, että haluat hänen näkevän sähköpostin ja että se ei ole roskapostia. Emme tallenna sähköpostiosoitteita.
Tätä kysymystä käytetään testaamaan, oletko vierailija, ja estämään automaattinen roskapostin lähetys.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez (S.Sergio Lopez), Miho Wapez (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D-korkean resoluution reaaliaikainen kuvantaminen paljastaa keramidiketjun pituuden merkityksen proteiinien lajittelulle valikoivissa lähtökohdissa.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez (S.Sergio Lopez), Miho Wapez (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D-korkean resoluution reaaliaikainen kuvantaminen paljastaa keramidiketjun pituuden merkityksen proteiinien lajittelulle valikoivissa lähtökohdissa.
©2020 American Association for Advanced of Science. kaikki oikeudet pidätetään. AAAS on HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ja COUNTER kumppani. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.