Javascript on tällä hetkellä poistettu käytöstä selaimessasi. Jotkin tämän verkkosivuston ominaisuudet eivät toimi, kun JavaScript on poistettu käytöstä.
Rekisteröidy omilla tiedoillasi ja kiinnostavalla lääkkeelläsi, niin yhdistämme antamasi tiedot laajan tietokantaamme artikkeleihin ja lähetämme sinulle sähköpostitse PDF-kopion välittömästi.
Ban-Lan-Gen-rakeet lievittävät dekstraaninatriumsulfaatin aiheuttamaa kroonista uusiutuvaa koliittia hiirillä moduloimalla suoliston mikrobistoa ja palauttamalla suoliston lyhytketjuisten rasvahappojen (SCFA) johdetun GLP-1:n tuotannon
Jiao Peng,1-3,*Li Xi,4,*Zheng Lin,3,5 Duan Lifang,1 Gao Zhengxian,2,5 Diehu,1 Li Jie,6 Li Xiaofeng,6 Shen Xiangchun,5 Xiao Haitao21Pekingin yliopiston Shenzhenin sairaalan farmasian laitos, Shenzhen, Kiinan kansantasavalta; 2Shenzhenin yliopiston terveystieteiden keskuksen farmasian tiedekunta, Shenzhen, Kiinan kansantasavalta; 3Guizhoun lääketieteellisen yliopiston etnisen lääketieteen ja perinteisen kiinalaisen lääketieteen kehittämisen ja soveltamisen teknillisen teknologian tutkimuskeskus, opetusministeriö, Guizhoun maakunnan farmasian avainlaboratorio, Guizhoun lääketieteellinen yliopisto, Guiyang, Kiinan kansantasavalta; 4 Gastroenterologian laitos, Pekingin yliopiston Shenzhenin sairaala, Shenzhen, Kiinan kansantasavalta; 5Farmasian tiedekunta, Guizhoun lääketieteellinen yliopisto, lääkekasvien toiminnan ja soveltamisen valtion avainlaboratorio, Guiyang; 6 Laboratoriolääketieteen laitos, Pekingin yliopistollinen Shenzhenin sairaala, Shenzhen, Kiina [email protected] Shen Xiangchun, Farmasian laitos, Guizhoun lääketieteellinen yliopisto, Guizhou, Kiinan kansantasavalta, 550004, Sähköposti [email protected] Tavoite: GLP-1-pohjainen hoito on uusi hoitovaihtoehto tulehdukselliseen suolistosairauksiin. Ban-Lan-Gen (BLG) -rakeet ovat tunnettu antiviraalinen TCM-valmiste, jolla on potentiaalista tulehdusta estävää vaikutusta erilaisten tulehdustilojen hoidossa. Sen tulehdusta estävä vaikutus paksusuolitulehdukseen ja sen vaikutusmekanismi ovat kuitenkin edelleen epäselviä. MENETELMÄT: Dekstraaninatriumsulfaatin (DSS) aiheuttaman kroonisen uusiutuvan paksusuolentulehduksen määrittäminen hiirillä. Tautiaktiivisuusindeksejä, vaurion histologisia markkereita ja tulehdusta edistävien sytokiinien tasoja määritettiin BLG:n suojaavan vaikutuksen arvioimiseksi. BLG:n vaikutuksia suoliston mikrobiotaan ja suolistoon karakterisoitiin seerumin GLP-1-tasoilla ja paksusuolen Gcg-, GPR41- ja GRP43-ilmentymisellä, suoliston mikrobiotan koostumuksella, ulosteen lyhytketjuisten rasvahappojen tasoilla ja GLP-1:n vapautumisella hiiren primaarisista paksusuolen epiteelisoluista. Lyhytketjuisista rasvahapoista (SCFA) johdetun GLP-1:n tuotanto. Tulokset: BLG-hoito vähensi merkittävästi painonpudotusta, DAI:ta, paksusuolen lyhenemistä, paksusuolen kudosvaurioita ja tulehdusta edistävien sytokiinien TNF-α:n, IL-1β:n ja IL-6:n tasoja paksusuolen kudoksessa. Lisäksi BLG-hoito voi merkittävästi palauttaa paksusuolen Gcg:n, GPR41:n ja GRP43:n ilmentymisen ja seerumin GLP-1-tasot koliittihiirillä ja lisäämällä SCFA:ita tuottavia bakteereja, kuten Akkermansia ja Prevotellaceae_UCG-001, ja vähentämällä bakteerien, kuten Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas ja Oscillibacter, määrää. Lisäksi BLG-hoito voi merkittävästi lisätä SCFA:iden määrää paksusuolen tulehdushiirten ulosteessa. Samaan aikaan in vitro -kokeet osoittivat myös, että BLG-käsiteltyjen hiirten ulosteuute voi stimuloida merkittävästi hiiren primaarisia pieniä paksusuolen epiteelisoluja, jotka erittävät GLP-1:tä. Johtopäätökset: Nämä havainnot viittaavat siihen, että BLG:llä on koliittia ehkäisevä vaikutus. BLG:llä on potentiaalia kehittää hoitomuoto, ainakin osittain moduloimalla suoliston mikrobistoa ja palauttamalla suoliston lyhytketjuisista rasvahapoista (SCFA) peräisin olevan GLP-1:n tuotanto. Lupaavia lääkkeitä krooniseen uusiutuvaan koliittiin. Avainsanat: koliitti, Ban-Lan-Gen-rakeet, suoliston mikrobisto, lyhytketjuiset rasvahapot, GLP-1
Haavainen paksusuolitulehdus (UC) on pitkäaikainen paksusuolen ja peräsuolen tulehduksellinen sairaus, jolle on ominaista toistuva ripuli, vatsakipu, painon lasku ja limakalvomaiset, veriset ulosteet.1 Viime aikoina haavaisen paksusuolentulehduksen esiintyvyys on lisääntynyt aiemmin alhaisen ilmaantuvuuden maissa, kuten Kiinassa, länsimaisten elämäntapojen suosion kasvaessa.2 Tämä kasvu aiheuttaa merkittäviä ongelmia kansanterveydelle ja sillä on vakavia vaikutuksia potilaiden työkykyyn ja elämänlaatuun. Huomionarvoista on, että haavaisen paksusuolentulehduksen patogeneesi on edelleen suurelta osin epäselvä, mutta on yleisesti hyväksyttyä, että genetiikka, ympäristötekijät, suoliston mikrobiota ja immuunijärjestelmä kaikki vaikuttavat haavaisen paksusuolentulehduksen kehittymiseen.3 Vieläkään haavaiseen paksusuolitulehdukseen ei ole parannuskeinoa, ja hoidon tavoitteena on kliinisesti hallita kliinisiä oireita, indusoida ja ylläpitää remissiota, edistää limakalvojen paranemista ja vähentää uusiutumista. Klassisia hoitoja ovat aminosalisylaatit, kortikosteroidit, immunosuppressantit ja biologiset lääkkeet. Nämä lääkkeet eivät kuitenkaan saavuta haluttua vaikutusta erilaisten sivuvaikutustensa vuoksi.4 Viime aikoina monet tapaustutkimukset ovat osoittaneet, että perinteinen kiinalainen lääketiede (TCM) on osoittanut suurta potentiaalia haavaisen paksusuolentulehduksen lievittämisessä vähäisellä toksisuudella, mikä viittaa siihen, että Uudet perinteisen lääketieteen hoidot ovat lupaava hoitostrategia haavaiseen paksusuolitulehdukseen (UC).5-7
Banlangen-rakeet (BLG) on perinteisen kiinalaisen lääketieteen valmiste, joka valmistetaan Banlangen-juuren vesiuutteesta.8 Virustenvastaisen tehonsa lisäksi BLG:llä on potentiaalista tulehdusta estävää vaikutusta erilaisten tulehdustilojen hoidossa.9,10 Lisäksi glukosinolaatteja (R,S-goitriini, progoitriini, epiprorubiini ja glukosidi) on eristetty ja tunnistettu Radix isatidisin vesiuutteista) ja nukleosideja (hypoksantiini, adenosiini, uridiini ja guanosiini) sekä indigoalkaloideja, kuten indigo ja indirubiini.11,12 Aiemmat tutkimukset ovat hyvin dokumentoineet, että adenosiini-, uridiini- ja indirubiiniyhdisteillä on voimakkaita koliittia ehkäiseviä vaikutuksia eri koliitin eläinmalleissa.13-17 BLG:n tehokkuutta koliitissa ei kuitenkaan ole arvioitu näyttöön perustuvilla tutkimuksilla. Tässä tutkimuksessa tutkimme BLG:n suojaavaa vaikutusta dekstraaninatriumsulfaatin (DSS) aiheuttamaan krooniseen uusiutuvaan koliittiin C57BL/6-hiirillä ja havaitsimme, että BLG:n oraalinen anto vähensi merkittävästi heikennetty DSS:n aiheuttama krooninen uusiutuva paksusuoli hiirillä Tulehdus, sen säätelymekanismit liittyvät suoliston mikrobiston modulointiin ja suolistosta peräisin olevan glukagonin kaltaisen peptidi-1:n (GLP-1) tuotannon palautumiseen.
BLG-rakeet (sokerittomat, NMPA-hyväksytyt Z11020357; Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd., Peking, Kiina; eränumero: 20110966) hankittiin apteekeista. DSS (molekyylipaino: 36 000–50 000 daltonia) hankittiin MP Biologicalsilta (Santa Ana, USA). Sulfasalatsiini (SASP) (≥ 98 %:n puhtaus), hematoksyliini ja eosiini hankittiin Sigma-Aldrichilta (St. Louis, MO, USA). Hiiren TNF-α-, IL-1β- ja IL-6 luminex Elisa -määrityspakkaukset hankittiin R&D Systemsiltä (Minneapolis, MN, USA). Etikkahappo, propionihappo ja voihappo hankittiin Aladdin Industriesilta (Shanghai, Kiina). 2-etyylivoihappo hankittiin Merck KGaA:lta (Darmstadt, Saksa).
6–8 viikon ikäiset urospuoliset C57BL/6-hiiret (paino 18–22 g) hankittiin Beijing Wetahe Laboratory Animal Technology Co., Ltd.:ltä (Peking, Kiina) ja niitä pidettiin 22 ± 2 °C:n ympäristössä 12 tunnin valo-pimeäsyklillä. Hiirille syötettiin jyrsijöiden standardiruokaa ja niillä oli vapaa pääsy juomaveteen viikon ajan totuttelemaan uuteen ympäristöön. Hiiret jaettiin sitten satunnaisesti neljään ryhmään: kontrolliryhmä, DSS-malliryhmä, SASP-käsitelty ryhmä (200 mg/kg, suun kautta) ja BLG-käsitelty ryhmä (1 g/kg, suun kautta). Kuten kuvassa 1A on esitetty, aiemman tutkimuksemme mukaan hiirille indusoitiin kokeellinen krooninen relapsoiva koliitti kolmella 1,8 % DSS-syklillä 5 päivän ajan, minkä jälkeen niitä annettiin tislattua vettä 7 päivän ajan aiemman tutkimuksemme mukaisesti.18 SASP- ja BLG-käsiteltyjen ryhmien hiiriä käsiteltiin vastaavasti SASP:llä ja BLG:llä joka päivä alkaen päivästä 0. Alustavien kokeiden mukaan BLG-annos asetettiin 1 g/kg. Samaan aikaan SASP:n annos asetettiin kirjallisuuden mukaisesti 200 mg/kg:aan.4 Kontrolli- ja DSS-malliryhmät saivat saman tilavuuden vettä koko kokeen ajan.
Kuva 1. BLG lievittää DSS:n aiheuttamaa kroonista uusiutuvaa koliittia hiirillä. (A) Kroonisen toistuvan koliitin kokeellinen suunnittelu ja hoito, (B) painonmuutos, (C) taudin aktiivisuusindeksin (DAI) pistemäärä, (D) paksusuolen pituus, (E) paksusuolen edustava kuva, (F) H&E-värjäys, paksusuoli (suurennus, ×100) ja (G) histologinen pistemäärä. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM (n = 6). ##p < 0,01 tai ###p < 0,001 vs. kontrolliryhmä (Con); *p < 0,05 tai **p < 0,01 tai ***p < 0,001 vs. DSS-ryhmä.
Paino, ulosteen koostumus ja peräsuolen verenvuoto kirjattiin päivittäin. Sairausaktiivisuusindeksi (DAI) määritettiin yhdistämällä painon, ulosteen koostumuksen ja peräsuolen verenvuodon pisteet aiemmin kuvatulla tavalla.19 Kokeen lopussa kaikki hiiret lopetettiin ja veri, ulosteet ja paksusuoli kerättiin jatkotutkimuksia varten.
Paksusuolen kudos fiksoitiin formaliinilla ja upotettiin parafiiniin. 5 mikronin leikkeet tehtiin ja värjättiin hematoksyliini-eosiinilla (H&E), minkä jälkeen ne sokkoutettiin ja pisteytettiin aiemmin kuvatulla tavalla.19
Paksusuolen kudoksen kokonais-RNA uutettiin Trizol-reagenssilla (Invitrogen, Carlsbad, CA), minkä jälkeen cDNA uutettiin käänteiskopioijaentsyymillä (TaKaRa, Kusatsu, Shiga, Japani). Kvantitatiivinen PCR suoritettiin reaaliaikaisella PCR-järjestelmällä ja SYBR Green Masterilla (Roche, Basel, Sveitsi). Kohdegeenien transkriptit normalisoitiin β-aktiiniksi ja tiedot analysoitiin 2-ΔΔCT-menetelmällä. Geenialukesekvenssit on esitetty taulukossa 1.
Hiiren paksusuolen epiteelisolujen primaarinen eristäminen ja viljely suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla.20 Lyhyesti sanottuna 6–8 viikon ikäisten hiirten paksusuolet poistettiin ensin lopettamisen jälkeen kohdunkaulan sijoiltaanmenolla, sitten ne avattiin pituussuunnassa, käsiteltiin Hanksin tasapainotetulla suolaliuoksella (HBSS, ilman kalsiumia ja magnesiumia) ja leikattiin 0,5–1 mm:n pieniksi paloiksi. Tämän jälkeen kudokset digestoitiin 0,4 mg/ml kollagenaasi XI:llä (Sigma, Poole, Iso-Britannia) vapaassa DMEM-elatusaineessa ja sentrifugoitiin 300 x g:ssä 5 minuuttia huoneenlämmössä. Pelletti suspendoitiin uudelleen DMEM-elatusaineeseen (täydennettynä 10 % naudan sikiön seerumilla, 100 yksikköä/ml penisilliiniä ja 100 µg/ml streptomysiiniä) 37 °C:ssa ja johdettiin nailonverkon läpi (huokoskoko ~250 µm). Paksusuolen epiteelisolujen alikvootit asetettiin lasipohjaisiin maljoihin ja inkuboitiin etikkahapon, propionihapon, voihapon ja hiiren ulosteuutteiden kanssa 2 tuntia 37 °C:ssa, 5 % CO2.
Paksusuolen kudos homogenisoitiin PBS:llä, ja sytokiinien IL-6:n, TNF-α:n ja IL-1β:n pitoisuudet paksusuolen kudoksessa määritettiin Luminex ELISA -määrityspakkauksilla (R&D systems, Minneapolis, MN, USA). Samoin GLP-1-pitoisuudet primaaristen hiiren paksusuolen epiteelisolujen seerumissa ja viljelyalustassa määritettiin ELISA-pakkauksella (Bioswamp, Wuhan, Kiina) valmistajan ohjeiden mukaisesti.
Kokonais-DNA ulosteesta uutettiin DNA-uuttopakkauksella (Tiangen, Kiina). DNA:n laatu ja määrä mitattiin suhteilla 260 nm/280 nm ja 260 nm/230 nm. Myöhemmin, käyttäen kutakin uutettua DNA:ta templaattina, spesifisiä alukkeita 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) ja 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) käytettiin monistamaan 16S rRNA -geenin V3-V4-alueet eri alueilla. PCR-tuotteet puhdistettiin käyttämällä QIAquick Gel Extraction Kit -pakkausta (QIAGEN, Saksa), kvantifioitiin reaaliaikaisella PCR:llä ja sekvensoitiin käyttämällä IlluminaMiseq PE300 -sekvensointialustaa (Illumina Inc., CA, USA). Bioinformatiikka-analyysissä datankäsittely suoritettiin aiemmin raportoitujen protokollien mukaisesti.21,22 Lyhyesti sanottuna, käytä Cutadapt (V1.9.1) -ohjelmaa raa'iden express-tiedostojen suodattamiseen. OTU:t klusteroitiin käyttämällä UPARSE-ohjelmaa (versio 7.0.1001). samankaltaisuusraja oli 97 %, ja UCHIME:tä käytettiin kimeeristen sekvenssien poistamiseen. Yhteisökoostumusanalyysi ja luokittelu suoritettiin käyttämällä RDP-luokittelijaa (http://rdp.cme.msu.edu/), joka perustui SILVA-ribosomaalisen RNA:n geenitietokantaan.
Lyhytketjuisten rasvahappojen (etikkahappo, propionihappo ja voihappo) pitoisuudet mitattiin Tao et al.:n aiemmin kuvaamalla tavalla, joitakin muutoksia tehden.23 Lyhyesti sanottuna 100 mg ulostetta suspendoitiin ensin 0,4 ml:aan deionisoitua vettä, sen jälkeen 0,1 ml:aan 50-prosenttista rikkihappoa ja 0,5 ml:aan 2-etyylivoihappoa (sisäinen standardi), minkä jälkeen homogenisoitiin ja kuumennettiin 4 °C:ssa. Sentrifugoi nopeudella 12 000 rpm 15 minuuttia °C:ssa. Supernatantti uutettiin 0,5 ml:lla eetteriä ja injektoitiin kaasukromatografiin analyysia varten. Kaasukromatografia- (GC) analyysiä varten näytteet analysoitiin GC-2010 Plus -kaasukromatografilla (Shimadzu, Inc.), joka oli varustettu liekki-ionisaatiodetektorilla (FID). Erotus tehtiin käyttämällä ZKAT-624-kolonnia, 30 m × 0,53 mm × 0,3 μm (Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., Kiina). Tiedot hankittiin GC-liuosohjelmistolla (Shimadzu, Inc.). Jakosuhde oli 10:1, kantajakaasu oli typpeä ja virtausnopeus oli 6 ml/min. Injektiotilavuus oli 1 μl. Injektorin ja detektorin lämpötila oli 300 °C. Uunin lämpötila pidettiin 140 °C:ssa 13,5 minuuttia, sitten nostettiin 250 °C:seen nopeudella 120 °C/min; lämpötila pidettiin 5 minuuttia.
Tiedot esitetään keskiarvona ± keskiarvon standardivirhe (SEM). Tiedon merkitsevyys arvioitiin yksisuuntaisella ANOVA:lla ja sen jälkeen Duncanin monialuetestillä. Kaikissa laskelmissa käytettiin GraphPad Prism 5.0 -ohjelmistoa (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA), ja p < 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitseväksi.
On hyvin tiedossa, että haavainen paksusuolitulehdus on krooninen uusiutuva paksusuolentulehdus, johon liittyy voimakasta vatsakipua, ripulia ja verenvuotoa. Siksi tutkittiin DSS:n aiheuttamaa kroonista uusiutuvaa paksusuolitulehdusta hiirillä BLG:n koliitin vastaisen tehon arvioimiseksi (kuva 1A). Verrokkiryhmään verrattuna DSS-malliryhmän hiirillä oli merkittävästi pienempi paino ja korkeampi DAI, ja nämä muutokset korjaantuivat merkittävästi 24 päivän BLG-hoidon jälkeen (kuva 1B ja C). Paksusuolen lyheneminen on tärkeä haavaisen paksusuolentulehduksen tunnusmerkki. Kuten kuvissa 1D ja E on esitetty, DSS:ää saaneiden hiirten paksusuolen pituus lyheni merkittävästi, mutta BLG-hoito helpotti sitä. Myöhemmin suoritettiin histopatologinen analyysi paksusuolen tulehduksen arvioimiseksi. H&E-värjätyt kuvat ja patologiset pisteet osoittivat, että DSS:n anto häiritsi merkittävästi paksusuolen rakennetta ja johti kryptien tuhoutumiseen, kun taas BLG-hoito vähensi merkittävästi kryptien tuhoutumista ja patologisia pisteytyksiä (kuva 1F ja G). Huomionarvoista on, että BLG:n suojaava vaikutus annoksella 1 g/kg oli verrattavissa SASP:n suojaavaan vaikutukseen annoksella 200 mg/kg. Nämä löydökset viittaavat siihen, että BLG on tehokas vähentämään DSS:n aiheuttaman kroonisen uusiutuvan koliitin vaikeusastetta hiirillä.
TNF-α, IL-1β ja IL-6 ovat tärkeitä paksusuolen tulehduksen tulehdusmarkkereita. Kuten kuvassa 2A on esitetty, DSS indusoi merkittävän lisääntymisen TNF-α:n, IL-1β:n ja IL-6:n geenien ilmentymisessä paksusuolessa verrattuna kontrolliryhmään. BLG:n anto voi merkittävästi kumota nämä DSS:n välittämät muutokset. Seuraavaksi käytimme ELISA-menetelmää määrittääksemme tulehdussytokiinien TNF-α:n, IL-1β:n ja IL-6:n pitoisuudet paksusuolen kudoksessa. Tulokset osoittivat myös, että TNF-α:n, IL-1β:n ja IL-6:n pitoisuudet paksusuolessa olivat merkittävästi lisääntyneet DSS:llä hoidetuilla hiirillä, kun taas BLG-hoito lievensi näitä nousuja (kuva 2B).
Kuva 2. BLG estää tulehdusta edistävien sytokiinien TNF-α:n, IL-1β:n ja IL-6:n geenien ilmentymistä ja tuotantoa DSS-käsiteltyjen hiirten paksusuolessa. (A) TNF-α:n, IL-1β:n ja IL-6:n geenien ilmentyminen paksusuolessa; (B) TNF-α:n, IL-1β:n ja IL-6:n paksusuolen proteiinitasot. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM (n = 4–6). #p < 0,05 tai ##p < 0,01 tai ###p < 0,001 vs. kontrolliryhmä (Con); *p < 0,05 tai **p < 0,01 vs. DSS-ryhmä.
Suoliston dysbioosi on kriittinen haavaisen paksusuolentulehduksen patogeneesissä.24 Selvittääkseen, moduloiko BLG DSS-käsiteltyjen hiirten suoliston mikrobistoa, suoritettiin 16S rRNA -sekvensointi suoliston sisällön bakteeriyhteisön analysoimiseksi. Venn-diagrammi osoittaa, että kolmella ryhmällä on 385 yhteistä OTU:ta. Samaan aikaan jokaisella ryhmällä oli ainutlaatuiset OTU:t (kuva 3A). Lisäksi kuvissa 3B ja C esitetyt Chao1-indeksi ja Shannon-indeksi osoittivat, että suoliston mikrobiston yhteisödiversiteetti oli vähentynyt BLG-käsitellyillä hiirillä, koska Shannon-indeksi oli merkittävästi pienentynyt BLG-käsitellyssä ryhmässä. Pääkomponenttianalyysiä (PCA) ja pääkoordinaattianalyysia (PCoA) käytettiin klusterointimallien määrittämiseen kolmen ryhmän välillä, ja ne osoittivat, että DSS-käsiteltyjen hiirten yhteisörakenne oli selvästi eriytynyt BLG-käsittelyn jälkeen (kuva 3D ja E). Nämä tiedot viittaavat siihen, että BLG-käsittely vaikutti merkittävästi DSS:n aiheuttamasta koliitista kärsivien hiirten yhteisörakenteeseen.
Kuva 3. BLG muuttaa suoliston mikrobiotan monimuotoisuutta hiirillä, joilla on DSS:n aiheuttama koliitti. (A) OTU:n Venn-diagrammi, (B) Chao1-indeksi, (C) Shannonin rikkausindeksi, (D) OTU:n pääkomponenttianalyysin (PCA) pisteytyskuvaaja, (E) OTU:n pääkoordinaattianalyysin (PCoA) pisteytys. Kuva. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM (n = 6). **p < 0,01 vs. DSS-ryhmä.
Arvioidaksemme ulosteen mikrobiston erityisiä muutoksia analysoimme suoliston mikrobiston koostumusta kaikilla taksonomisilla tasoilla. Kuten kuvassa 4A on esitetty, kaikkien ryhmien pääjaksot olivat Firmicutes ja Bacteroidetes, joita seurasivat Verrucomicrobia. Firmicutes-bakteerien suhteelliset runsaudet ja Firmicutes/Bacteroidetes-suhteet olivat merkittävästi kohonneet DSS-käsiteltyjen hiirten ulosteen mikrobiyhteisöissä verrattuna kontrollihiiriin, ja nämä muutokset korjaantuivat merkittävästi BLG-hoidon jälkeen. Erityisesti BLG-käsittely lisäsi merkittävästi Verrucobacteriumin suhteellista runsautta DSS:n aiheuttamasta koliitista kärsivien hiirten ulosteissa. Kotitaloustasolla ulosteen mikrobiyhteisöissä oli Lachnospiriaceae-, Muribaculaceae-, Akkermansiaceae-, Ruminococcaceae- ja Prevotellaceae-heimon sukuja (kuva 4B). Verrattuna DSS-ryhmään BLG:n väheneminen lisäsi Akkermansiaceae-heimon sukujen määrää, mutta vähensi Lachnospiraceae- ja Ruminococcaceae-heimon sukujen määrää. Huomionarvoista on, että suvutasolla ulosteen mikrobistossa oli Lachnospira_NK4A136_group, Akkermansia ja Prevotellaceae_UCG-001 (kuva 4C). Tämä löydös osoitti myös, että BLG-käsittely korjasi tehokkaasti mikrobiston epätasapainon vasteena DSS-altistukseen, jolle on ominaista Eubacterium_xylanophilum_group-, Ruminococcaceae_UCG-014-, Intestinimonas- ja Oscillibacter-bakteerien väheneminen sekä Akkermansia- ja Prevotellaceae_UCG-001-bakteerien lisääntyminen.
Kuva 4. BLG muuttaa suoliston mikrobiston runsautta DSS:n indusoimalla koliitilla varustetuilla hiirillä. (A) Suoliston mikrobiston runsaus pääjaksotasolla; (B) Suoliston mikrobiston runsaus heimotasolla; (C) Suoliston mikrobiston runsaus suvutasolla. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM (n = 6). #p < 0,05 tai ###p < 0,001 vs. kontrolliryhmä (Con); *p < 0,05 tai **p < 0,01 tai ***p < 0,001 vs. DSS-ryhmä.
Koska lyhytketjuiset rasvahapot (SCFA) ovat Akkermansian ja Prevotellaceae_UCG-001:n tärkeimmät metaboliitit, kun taas asetaatti, propionaatti ja butyraatti ovat yleisimmät SCFA-yhdisteet suoliston luumenissa,25-27 olemme edelleen tutkimuksessamme. Kuten kuvassa 5 on esitetty, ulosteen asetaatti-, propionaatti- ja butyraattipitoisuudet laskivat merkittävästi DSS-käsitellyssä ryhmässä, kun taas BLG-käsittely pystyi suurelta osin estämään tämän vähenemisen.
Kuva 5. BLG lisää lyhytketjuisten rasvahappojen (SCFA) pitoisuuksia DSS:n aiheuttamasta koliitista kärsivien hiirten ulosteissa. (A) Etikkahappopitoisuus ulosteessa; (B) propionihappopitoisuus ulosteessa; (C) voihappopitoisuus ulosteessa. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM (n = 6). #p < 0,05 tai ##p < 0,01 vs. kontrolliryhmä (Con); *p < 0,05 tai **p < 0,01 vs. DSS-ryhmä.
Laskimme edelleen Pearsonin korrelaatiokertoimen suvun tason erottelujen lyhyen ketjun rasvahappojen (SCFA) ja ulosteen mikrobiotan välillä. Kuten kuvassa 6 on esitetty, Akkermansia korreloi positiivisesti propionihapon (Pearson = 0,4866) ja voihapon (Pearson = 0,6192) tuotannon kanssa. Sitä vastoin sekä Enteromonas että Oscillobacter korreloivat negatiivisesti asetaatin tuotantoon Pearsonin kertoimien ollessa 0,4709 ja 0,5104. Samoin Ruminococcaceae_UCG-014 korreloi negatiivisesti propionihapon (Pearson = 0,4508) ja voihapon (Pearson = 0,5842) tuotannon kanssa.
Kuva 6. Pearsonin korrelaatioanalyysi erilaisten lyhytketjuisten rasvahappojen ja paksusuolen mikrobien välillä. (A) Enteromonas etikkahapolla; (B) Aivotärähdysbasilli etikkahapolla; (C) Akkermansia vs. propionihappo; (D) Ruminococcus_UCG-014 propionihapolla; (E) Akkermansia voihapolla; (F) Ruminococcus_UCG-014 voihapolla.
Glukagonin kaltainen peptidi-1 (GLP-1) on solutyyppispesifinen proglukagonin (Gcg) translaation jälkeinen tuote, jolla on anti-inflammatorisia ominaisuuksia.28 Kuten kuvassa 7 on esitetty, DSS indusoi merkittävän Gcg-mRNA:n ilmentymisen vähenemisen. Paksusuoli- ja BLG-käsittely pystyivät merkittävästi kumoamaan DSS:n aiheuttaman Gcg:n vähenemisen verrattuna kontrolliryhmään (kuva 7A). Samaan aikaan GLP-1:n taso seerumissa oli merkittävästi laskenut DSS-käsitellyssä ryhmässä, ja BLG-käsittely pystyi suurelta osin estämään tämän vähenemisen (kuva 7B). Koska lyhytketjuiset rasvahapot voivat stimuloida GLP-1:n eritystä G-proteiinikytkentäisen reseptorin 43 (GRP43) ja G-proteiinikytkentäisen reseptorin 41 (GRP41) aktivaation kautta, tutkimme myös GPR41:tä ja GRP43:a koliittihiirten paksusuolessa ja havaitsimme, että GRP43:n ja GPR41:n paksusuolen mRNA:n ilmentyminen väheni merkittävästi DSS-altistuksen jälkeen, ja BLG-käsittely pystyi tehokkaasti korjaamaan nämä vähenemiset (kuva 7C ​​ja D).
Kuva 7. BLG lisää seerumin GLP-1-tasoja ja paksusuolen Gcg-, GPR41- ja GRP43-mRNA:n ilmentymistä DSS-käsitellyillä hiirillä. (A) Gcg-mRNA:n ilmentyminen paksusuolen kudoksessa; (B) GLP-1-taso seerumissa; (C) GPR41-mRNA:n ilmentyminen paksusuolen kudoksessa; (D) GPR43-mRNA:n ilmentyminen paksusuolen kudoksessa. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM (n = 5–6). #p < 0,05 tai ##p < 0,01 vs. kontrolliryhmä (Con); *p < 0,05 vs. DSS-ryhmä.
Koska BLG-hoito saattoi lisätä seerumin GLP-1-tasoja, paksusuolen Gcg-mRNA:n ilmentymistä ja ulosteen SCFA-tasoja DSS-käsitellyillä hiirillä, tutkimme edelleen asetaattia, propionaattia ja butyraattia sekä kontrolli- (F-Con), DSS-koliittia sairastavien (F-Con) ja BLG-käsiteltyjen paksusuolitulehdusta sairastavien (F-BLG) hiirten GLP-1:n vapautumista primaarisista hiiren paksusuolen epiteelisoluista. Kuten kuvassa 8A on esitetty, 2 mM etikkahapolla, propionihapolla ja voihapolla käsitellyt primaariset hiiren paksusuolen epiteelisolut stimuloivat merkittävästi GLP-1:n vapautumista, mikä on yhdenmukaista aiempien tutkimusten kanssa.29,30 Samoin kaikki F-Con-, F-DSS- ja F-BLG-solut (vastaa 0,25 g ulostetta) stimuloivat suuresti GLP-1:n vapautumista primaarisista hiiren paksusuolen epiteelisoluista. Huomionarvoista on, että F-DSS-käsiteltyjen primaaristen hiiren paksusuolen epiteelisolujen vapauttaman GLP-1:n määrä oli paljon pienempi kuin F-Con- ja F-BLG-käsiteltyjen primaaristen hiiren paksusuolen epiteelisolujen. (Kuva 8B). Nämä tiedot viittaavat siihen, että BLG-hoito palautti merkittävästi suoliston lyhytketjuisista rasvahapoista (SCFA) peräisin olevan GLP-1:n tuotannon.
Kuva 8. BLG:stä johdetut lyhyen ketjun rasvahapot (SCFA) stimuloivat GLP-1:n vapautumista hiiren primaarisista paksusuolen epiteelisoluista. (A) Etikkahappo, propionihappo ja voihappo stimuloivat GLP-1:n vapautumista hiiren primaarisista paksusuolen epiteelisoluista; (B) ulosteuutteet F-Con, F-DSS ja F-BLG stimuloivat hiiren primaarisia paksusuolen epiteelisoluja. Vapautuneen GLP-1:n määrä. Paksusuolen epiteelisoluja asetettiin lasipohjaisiin petrimaljoihin ja käsiteltiin 2 mM etikkahapolla, propionihapolla, voihapolla ja ulosteuutteilla F-Con, F-DSS ja F-BLG (vastaa 0,25 g ulostetta). 2 tuntia 37 °C:ssa, 5 % CO2:ta. Hiiren primaarisista paksusuolen epiteelisoluista vapautuneen GLP-1:n määrä havaittiin ELISA:lla. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM (n = 3). #p < 0,05 tai ##p < 0,01 vs. tyhjä tai F-Con; *p < 0,05 vs. F-DSS.
Lyhenteet: Ace, etikkahappo; Pro, propionihappo; kuitenkin voihappo; F-Con, kontrollihiirten ulosteuute; F-DSS, koliittihiirten ulosteuute; F-BLG, BLG:llä käsitellystä paksusuolesta. Tulehduksellisten hiirten ulosteuutteet.
Maailman terveysjärjestön luokittelema haavainen paksusuolitulehdus on muuttumassa maailmanlaajuiseksi uhkaksi; Tehokkaita menetelmiä taudin ennustamiseksi, ehkäisemiseksi ja hoitamiseksi on kuitenkin edelleen rajallisesti. Siksi on kiireellisesti tutkittava ja kehitettävä uusia turvallisia ja tehokkaita hoitostrategioita haavaiseen paksusuolitulehdukseen. Perinteisen kiinalaisen lääketieteen valmisteet ovat lupaava vaihtoehto, koska monien perinteisen kiinalaisen lääketieteen valmisteiden on osoitettu olevan tehokkaita haavaisen paksusuolentulehduksen hoidossa kiinalaisessa väestössä vuosisatojen ajan, ja ne ovat kaikki biologisia orgaanisia aineita ja luonnonmateriaaleja, jotka ovat enimmäkseen vaarattomia ihmisille ja eläimille.31,32 Tämän tutkimuksen tavoitteena oli etsiä turvallinen ja tehokas perinteisen kiinalaisen lääketieteen valmiste haavaisen paksusuolentulehduksen hoitoon ja tutkia sen vaikutusmekanismia. BLG on tunnettu kiinalainen yrttivalmiste, jota käytetään flunssan hoitoon.8,33 Laboratoriomme ja muiden tekemä työ on osoittanut, että indigo, samasta raaka-aineesta kuin BLG valmistettu jalostettu perinteisen kiinalaisen lääketieteen tuote, on merkittävästi tehokas haavaisen paksusuolentulehduksen hoidossa ihmisillä ja eläimillä.4,34 BLG:n koliittia estävät vaikutukset ja sen vaikutukset Mekanismi on kuitenkin epäselvä. Tässä tutkimuksessa tuloksemme osoittavat, että BLG lievittää tehokkaasti DSS:n aiheuttamaa paksusuolen tulehdusta, joka liittyy suoliston mikrobiston modulointiin ja palautumiseen. suolistosta peräisin olevaa GLP-1:n tuotantoa.
On hyvin tunnettua, että haavaiselle paksusuolentulehdukselle on ominaista uusiutuvat jaksot, joihin liittyy tyypillisiä kliinisiä piirteitä, kuten painonpudotus, ripuli, peräsuolen verenvuoto ja laaja paksusuolen limakalvovaurio.35 Kroonista uusiutuvaa koliittia hoidettiin antamalla kolme sykliä 1,8 % DSS:ää viiden päivän ajan, minkä jälkeen potilaalle annettiin seitsemän päivää vettä. Kuten kuvassa 1B on esitetty, vaihteleva painonpudotus ja DAI-pisteet osoittivat kroonisen uusiutuvan koliitin onnistuneen induktion. BLG:llä hoidetun ryhmän hiiret osoittivat toipumista ylöspäin päivästä 8 lähtien, mikä oli merkitsevästi erilainen kuin päivä 24. Samat muutokset havaittiin myös DAI-pisteissä, mikä viittaa koliitin kliinisen paranemisen paranemiseen. Paksusuolen vaurion ja tulehdustilan osalta paksusuolen pituus, paksusuolen kudosvaurio sekä tulehdusta edistävien sytokiinien TNF-α:n, IL-1β:n ja IL-6:n geenien ilmentyminen ja tuotanto paksusuolen kudoksessa paranivat myös huomattavasti BLG-hoidon jälkeen. Yhdessä nämä tulokset osoittavat selvästi, että BLG on tehokas kroonisen uusiutuvan koliitin hoidossa hiirillä.
Miten BLG vaikuttaa farmakologisesti? Lukuisat aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että suoliston mikrobiotalla on keskeinen rooli haavaisen paksusuolentulehduksen patogeneesissä, ja mikrobiomiin perustuvat ja mikrobiomiin kohdennetut hoidot ovat nousseet erittäin houkuttelevaksi strategiaksi haavaisen paksusuolentulehduksen hoidossa. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että BLG-hoito johti merkittäviin muutoksiin suoliston mikrobiotan koostumuksessa, mikä viittaa siihen, että BLG:n suojaava vaikutus DSS:n aiheuttamaa koliittia vastaan ​​liittyy suoliston mikrobiotan modulointiin. Tämä havainto on yhdenmukainen sen käsityksen kanssa, että suoliston mikrobiotan homeostaasin uudelleenohjelmointi on tärkeä lähestymistapa TCM-valmisteiden tehokkuuden ymmärtämiseksi.36,37 Huomionarvoista on, että Akkermansia on gramnegatiivinen ja ehdottomasti anaerobinen bakteeri, joka elää suoliston limakerroksessa ja hajottaa musiineja, tuottaa propionihappoa, stimuloi pikarisolujen erilaistumista ja ylläpitää limakalvon suojamuuria.26 Useat kliiniset ja eläinkokeet viittaavat siihen, että Akkermansia liittyy vahvasti terveeseen limakalvoon,38 ja Akkermansia spp.:n suun kautta antaminen on tärkeää. voi merkittävästi parantaa limakalvojen tulehdusta.39 Nykyiset tietomme viittaavat siihen, että Akkermansian suhteellinen runsaus lisääntyy merkittävästi BLG-käsittelyn jälkeen. Lisäksi Prevotellaceae_UCG-001 on lyhytketjuisia rasvahappoja (SCFA) tuottava bakteeri.27 Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että Prevotellaceae_UCG-001:tä löydettiin suhteellisen alhaisena runsautena koliittia sairastavien eläinten ulosteista.40,41 Nykyiset tietomme osoittavat myös, että BLG-käsittely voi merkittävästi lisätä Prevotellaceae_UCG-001:n suhteellista runsautta DSS-käsiteltyjen hiirten paksusuolessa. Sitä vastoin Oscillibacter on mesofiilinen, ehdottomasti anaerobinen bakteeri.42 raportoi, että Oscillibacterin suhteellinen runsaus lisääntyi merkittävästi UC-hiirissä ja korreloi merkittävästi positiivisesti IL-6- ja IL-1β-tasojen ja patologisten pisteiden kanssa.43,44 Huomionarvoista on, että BLG-käsittely vähensi merkittävästi Oscillibacterin suhteellista runsautta DSS-käsiteltyjen hiirten ulosteissa. On huomattava, että nämä BLG:n muokkaamat bakteerit olivat eniten lyhytketjuisia rasvahappoja tuottavia bakteereja. Lukuisat aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet lyhytketjuisten rasvahappojen mahdolliset hyödylliset vaikutukset paksusuolen tulehduksesta ja suoliston epiteelin eheyden suojasta.45,46 Nykyiset tietomme havaitsivat myös, että SCFA-asetaatin, -propionaatin ja -butyraatin pitoisuudet DSS-käsiteltyjen ulosteiden sisällä olivat huomattavasti kohonneet BLG-käsitellyillä hiirillä. Yhdessä nämä havainnot osoittavat selvästi, että BLG-hoito voi tehokkaasti lisätä DSS:n indusoimia SCFA:ita tuottavia bakteereja kroonista uusiutuvaa koliittia sairastavilla hiirillä.
GLP-1 on inkretiini, jota tuotetaan pääasiassa sykkyräsuolessa ja paksusuolessa, ja sillä on tärkeä rooli mahalaukun tyhjenemisen viivästyttämisessä ja aterianjälkeisen verensokerin alentamisessa.47 Todisteet viittaavat siihen, että dipeptidyylipeptidaasi (DPP)-4, GLP-1-reseptorin agonisti ja GLP-1-nanolääke, voivat tehokkaasti lievittää suoliston tulehdusta hiirillä.48-51 Kuten aiemmissa tutkimuksissa on raportoitu, korkeat lyhytketjuisten rasvahappojen (SCFA) pitoisuudet liittyivät plasman GLP-1-tasoihin ihmisillä ja hiirillä.52 Nykyiset tietomme osoittavat, että BLG-hoidon jälkeen seerumin GLP-1-tasot ja Gcg mRNA:n ilmentyminen lisääntyivät merkittävästi. Samoin GLP-1:n eritys lisääntyi merkittävästi paksusuolen viljelmissä BLG-käsiteltyjen koliittihiirten ulosteuutteilla stimuloinnin jälkeen verrattuna DSS-käsiteltyjen koliittihiirten ulosteuutteilla stimulointiin.Miten lyhytketjuiset rasvahapot vaikuttavat GLP-1:n vapautumiseen?Gwen Tolhurst et al. raportoi, että SCFA voi stimuloida GLP-1:n eritystä GRP43:n ja GPR41:n kautta.29 Nykyiset tietomme osoittavat myös, että BLG-käsittely lisää merkittävästi GRP43:n ja GPR41:n mRNA:n ilmentymistä DSS-käsiteltyjen hiirten paksusuolessa. Nämä tiedot viittaavat siihen, että BLG-käsittely voi palauttaa SCFA:n edistämän GLP-1:n tuotannon aktivoimalla GRP43:n ja GPR41:n.
BLG on pitkäaikainen käsikauppalääke Kiinassa. Kunming-hiirten siedetty BLG-annos on 80 g/kg, eikä akuuttia toksisuutta ole havaittu.53 Tällä hetkellä suositeltu BLG-annos (ilman sokeria) ihmisille on 9–15 g/vrk (3 kertaa päivässä). Tutkimuksemme osoitti, että 1 g/kg BLG lievitti DSS:n aiheuttamaa kroonista uusiutuvaa koliittia hiirillä. Tämä annos on lähellä kliinisesti käytettyä BLG-annosta. Tutkimuksemme havaitsi myös, että sen vaikutusmekanismi välittyy ainakin osittain suoliston mikrobiston muutosten kautta, erityisesti lyhytketjuisia rasvahappoja tuottavien bakteerien, kuten Akkermansian ja Prevotellaceae_UCG-001:n, kautta suolistosta peräisin olevan GLP-1:n tuotannon palauttamiseksi. Nämä havainnot viittaavat siihen, että BLG:tä on syytä harkita lisää potentiaalisena terapeuttisena aineena kliinisessä koliitin hoidossa. Tarkkaa mekanismia, jolla se moduloi suoliston mikrobistoa, ei kuitenkaan ole vielä vahvistettu mikrobiotapuutteisilla hiirillä ja ulosteen bakteerien siirroilla.
Ace, etikkahappo; but, voihappo; BLG, pandani; DSS, dekstraaninatriumsulfaatti; DAI, taudin aktiivisuusindeksi; DPP, dipeptidyylipeptidaasi; FID, liekki-ionisaatiodetektori; F-Con, kontrolli; Hiirien ulosteuutteet; F-DSS, DSS-koliittihiirten ulosteuutteet; F-BLG, BLG-käsiteltyjen koliittihiirten ulosteuutteet; GLP-1, glukagonin kaltainen peptidi-1; Gcg, glukagoni; kaasukromatografia, kaasukromatografia; GRP43, G-proteiinikytkentäinen reseptori 43; GRP41, G-proteiinikytkentäinen reseptori 41; H&E, hematoksyliini-eosiini; HBSS, Hanksin tasapainotettu suolaliuos; OTC, OTC; PCA, pääkomponenttianalyysi; PCoA, pääkoordinaattianalyysi; Pro, propionihappo; SASP, sulfasalatsiini; SCFA, lyhytketjuiset rasvahapot; kiinalainen lääketiede, perinteinen kiinalainen lääketiede; haavainen paksusuolitulehdus, haavainen paksusuolitulehdus.
Pekingin yliopiston Shenzhenin ja Hongkongin tiede- ja teknologiayliopiston lääketieteellisen keskuksen (Shenzhen, Kiina) eläinten eettinen toimikunta hyväksyi kaikki kokeelliset protokollat ​​institutionaalisten ohjeiden ja eläinmääräysten mukaisesti (eettinen numero A2020157).
Kaikki kirjoittajat antoivat merkittävän panoksen artikkeleiden suunnitteluun ja suunnitteluun, tiedonhankintaan tai tiedon analysointiin ja tulkintaan; osallistuivat artikkelin luonnosteluun tai tärkeän älyllisen sisällön kriittiseen tarkistamiseen; suostuivat lähettämään käsikirjoituksen tähän julkaisuun; hyväksyivät lopulta julkaistavan version; olivat vastuussa kaikista työn osa-alueista.
Tätä työtä tukivat Kiinan kansallinen luonnontieteiden säätiö (81560676 ja 81660479), Shenzhenin yliopiston ensiluokkainen projekti (86000000210), Shenzhenin tiede- ja teknologiainnovaatiokomitean rahasto (JCYJ20210324093810026), Guangdongin maakunnan lääketieteellisen tieteen ja teknologian tutkimusrahasto (A2020157 ja A2020272), Guizhoun lääketieteellisen yliopiston apteekki (Guizhoun maakunta), jota rahoitti Key Laboratory (YWZJ2020-01) ja Pekingin yliopiston Shenzhenin sairaala (JCYJ2018009).
1. Tang B, Zhu J, Zhang B, ym. Triptolidin terapeuttinen potentiaali tulehdusta estävänä aineena dekstraaninatriumsulfaatin aiheuttamassa kokeellisessa koliitissa hiirillä. pre-immune.2020;11:592084.doi: 10.3389/fimmu.2020.592084
2. Kaplan GG. IBD:n maailmanlaajuinen taakka: vuosina 2015–2025. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2015;12:720–727. doi: 10.1038/nrgastro.2015.150
3. Peng J, Zheng TT, Li Xue ym. Kasviperäiset alkaloidit: lupaavia sairauden modifioijia tulehduksellisessa suolistosairaudessa. Prepharmacology.2019;10:351.doi:10.3389/fphar.2019.00351
4. Xiao Haiteng, Peng Jie, Wen B, et al. Indigo Naturalis estää paksusuolen oksidatiivista stressiä ja Th1/Th17-vasteita DSS:n aiheuttamassa koliitissa hiirillä. Oxid Med Cell Longev. 2019;2019:9480945.doi: 10.1155/2019/9480945
5. Chen M, Ding Y, Tong Z. Sophora flavescensin (Sophora flavescens) teho ja turvallisuus kiinalainen rohdosvalmiste haavaisen paksusuolitulehduksen hoidossa: kliininen näyttö ja mahdolliset mekanismit. Prepharmacology.2020;11:603476.doi:10.3389/fphar.2020.603476
6. Cao Fang, Liu Jie, Sha Benxing, Pan HF. Luonnontuotteet: kokeellisesti tehokkaita lääkkeitä tulehduksellisen suolistosairauden hoitoon. Curr Pharmaceuticals. 2019;25:4893–4913. doi: 10.2174/1381612825666191216154224
7. Zhang C, Jiang M, Lu A. Pohdintoja haavaisen paksusuolitulehduksen adjuvanttihoidosta perinteisen kiinalaisen lääketieteen avulla. Clinical Rev Allergy Immunization. 2013;44:274–283. doi: 10.1007/s12016-012-8328-9
8. Li Zhongteng, Li Li, Chen TT ym. Banlangen-rakeiden teho ja turvallisuus kausi-influenssan hoidossa: satunnaistetun kontrolloidun tutkimuksen tutkimusprotokolla. trial.2015;16:126.doi: 10.1186/s13063-015-0645-x