Kiitos käynnistäsi Nature.com-sivustolla. Käyttämäsi selainversio tukee CSS:ää rajoitetusti. Parhaan käyttökokemuksen saavuttamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan yhteensopivuustilan käytöstä Internet Explorerissa). Sillä välin näytämme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä jatkuvan tuen varmistamiseksi.
Toisin kuin selkärankaisilla, hyönteisiltä yleisesti uskotaan puuttuvan urospuolisia sukupuolihormoneja. Anopheles gambiae -hyttysten ekdysonisteroidi 20-hydroksiekdysoni (20E) näyttää kehittyneen kontrolloimaan munien kehitystä, kun naaraat syntetisoivat sitä2, ja indusoimaan parittelun vastavaiheen, kun urokset siirtävät sitä sukupuoliyhteydessä3. Koska munien kehitys ja parittelu ovat olennaisia ​​lisääntymisominaisuuksia, ymmärrys siitä, miten naaraspuoliset Anopheles-hyttyset integroivat nämä hormonaaliset signaalit, voisi helpottaa uusien malarian torjuntaohjelmien suunnittelua. Tässä tutkimuksessa paljastamme, että näitä lisääntymistoimintoja säätelevät erilliset sukupuolisteroidit monimutkaisen ekdysteroideja aktivoivien/inaktivoivien entsyymien verkoston kautta. Tunnistimme urosspesifisen hapettuneen ekdysonin, 3-dehydro-20E:n (3D20E), joka suojaa vanhempia sulkemalla naaraan seksuaalisen vastaanottavuuden sukupuoliyhteyden siirron ja defosforylaatiolla tapahtuvan aktivoinnin jälkeen. Huomionarvoista on, että 3D20E-siirto indusoi myös lisääntymisgeenien ilmentymistä, jotka ylläpitävät munien kehitystä Plasmodium-infektion aikana varmistaen tartunnan saaneiden naaraiden terveyden. Naarailta peräisin oleva 20E ei aiheuta seksuaalista vastetta, mutta mahdollistaa parittelun yksilöillä munivat sen jälkeen, kun 20E:tä estävät kinaasit on estetty. Tämän urosspesifisen hyönteissteroidihormonin tunnistaminen ja sen rooli naaraan seksuaalisen vastaanottavuuden, hedelmällisyyden ja Plasmodiumin kanssa tapahtuvan vuorovaikutuksen säätelyssä viittaa siihen, että se voi heikentää malariaa levittävien hyttysten lisääntymismenestystä.
Malariatapaukset ja -kuolemat ovat jälleen nousussa4 Anopheles-hyttysten laajalle levinneen hyönteismyrkkyresistenssin vuoksi. Anopheles-hyttyset ovat ainoa ihmisen malariaparasiittien levittäjä. Näiden hyttysten parittelubiologia on erityisen houkutteleva kohde uusille malarian torjuntatoimenpiteille, koska naaraat parittelevat vain kerran5. Tämän yksittäisen parittelutapahtuman steriiliksi tekeminen voisi merkittävästi vähentää hyttyspopulaatioita pellolla.
Naiset menettävät seksuaalisen toimintakykynsä saatuaan miehiltä runsaasti steroidihormoneja. Tutkimukset ovat osoittaneet, että lisäparittelun vaikeutumisen laukaiseva tekijä on 20-hydroksiekdysoni (20E), steroidihormoni, joka tunnetaan paremmin toukkavaiheen sulkasadon säätelijänä. Urosten kyky syntetisoida ja siirtää 20E:tä on kehittynyt erityisesti Anopheles-lajeissa, jotka kuuluvat Cellia7-alasukuun, joka on levinnyt Afrikassa ja sisältää vaarallisimmat malarian vektorit, mukaan lukien Anopheles gambiae. Tämä on erityisen huomionarvoista, koska näillä lajeilla naaraat tuottavat myös 20E:tä jokaisen veriaterian jälkeen, ja 20E ohjaa oogeneesisykliä (ks. viite 8). Kuitenkin tiedetään vähän siitä, miten naaraat integroivat signaaleja kahdesta eri ekdysonin lähteestä (urossiirto ja verenoton indusointi) vaarantamatta omaa kykyään paritella. Itse asiassa, jos naaraiden tuottama 20E laukaisee seksuaalisen suvaitsemattomuuden, se johtaa hedelmättömyyteen neitsytsyövillä yksilöillä, mikä on hyvin yleinen käyttäytyminen näillä hyttysillä5.
Mahdollinen selitys on, että A. gambiae -urokset siirtävät modifioitua uroskohtaista ekdysonia, joka aktivoi signalointikaskadin naaraan lisääntymiskanavassa, mikä johtaa parittelun epävakauteen. Vaikka selkärankaisilla on useita steroidihormoneja, kuten estrogeenia ja androgeenia (katsaus viitteessä 9), tietojemme mukaan androgeenipainotteisia steroideja ei ole tunnistettu hyönteisissä.
Ryhdyimme määrittämään steroidihormonien repertuaarin sukupuolikypsän A. gambiaen urospuolisessa lisärauhasessa (MAG) etsien mahdollisia modifioivia steroideja. Käyttämällä korkean suorituskyvyn nestekromatografiaa yhdistettynä tandemmassaspektrometriaan (HPLC-MS/MS) aiemmin käytetyn vähemmän spesifisen menetelmän sijaan, havaitsimme tässä kudoksessa ekdysonia (E) ja 20E:tä, mikä vahvisti aiemman tuloksen. Näytteessä olivat kuitenkin pääasiassa hapettuneet fosforyloidut steroidit, mikä on yhdenmukaista kaavan 3-dehydro-20E-22-fosfaatti (3D20E22P)12 kanssa (kuva 1). Muita muotoja ovat 3-dehydro-20E (3D20E) ja 20E-22-fosfaatti (20E22P). 3D20E22P:n HPLC-MS/MS-signaalin intensiteetti oli kaksi kertaluokkaa suurempi kuin sen defosforyloituneen muodon, 3D20E:n, ja kolme kertaluokkaa suurempi kuin E:n ja 20E:n (kuva 1). Vaikka muissa kehon osissa ja alemmissa lisääntymiskanavissa (LRT; laajennetut tiedot, kuva 2) esiintyi myös muissa kehon osissa ja alemmissa lisääntymiskanavissa (LRT; laajennetut tiedot, kuva 2). 1a). Analysoimme myös ekdysteroideja vastakuoliutuneilla (<1 päivän ikäisillä) koirailla ja naarailla ja havaitsimme 3D20E:tä ja 3D20E22P:tä vain MAG:ssa; E:tä, 20E:tä ja 20E22P:tä esiintyi molemmilla sukupuolilla (laajennettu data, kuva 1b). Nämä tiedot viittaavat siihen, että aikuiset A. gambiae -urokset tuottavat MAG:issaan korkeita määriä modifioivia hormoneja, joita naaraat eivät syntetisoi.
MAG- ja naaraspuolisten LRT-näytteitä (mukaan lukien eteiset, siemenrakkulat ja parovarium) dissektioitiin 4 päivän ikäisiltä (4 päivän ikäisiltä) neitsyturoksilta sekä neitsyt- ja paritelluilta naarailta (0,5, 3 ja 12 hv/min). Näiden kudosten ekdysoni analysoitiin HPLC-MS/MS:llä (keskiarvo ± keskiarvovirhe; pariton t-testi, kaksipuolinen, virheellisten löydösten määrällä (FDR) korjattu; NS, ei merkitsevä; *P < 0,05, **P < 0,01. 3D20E: 3 tuntia vs. 0,5 tuntia, P = 0,035; 12 tuntia vs. 3 tuntia, P = 0,0015; 12 tuntia vs. 0,5 tuntia, P = 0,030. 3D20E22P: 3 tuntia vs. 0,5 tuntia, P = 0,25; 12 tuntia vs. 3 tuntia, P = 0,0032; 12 tuntia vs. 0,5 tuntia, P = 0,015). Tiedot ovat peräisin kolmesta biologisesta toistosta. Kunkin kiinnostuksen kohteena olevan ekdysonin piikin pinta-ala laskettiin ja normalisoitiin hyttysten lukumäärän mukaan. Ekdysonia edustaa väri seuraavasti: E, vihreä; 20E, oranssi; 20E22P, violetti; 3D20E, sininen; 3D20E22P, vaaleanpunainen. Pieni kuva suurentaa y-akselin skaalaa osoittaakseen alhaisemmat ekdysonitasot.
Selvittääksemme, siirtyvätkö 3D20E22P ja 3D20E parittelun aikana, dissektoimme naaraspuolisia LRT:itä eri ajankohtina parittelun jälkeen. Vaikka ekdysonia ei löydetty neitsyistä, havaitsimme huomattavia määriä 3D20E22P:tä LRT:ssä heti parittelun jälkeen (0,5 tuntia parittelun jälkeen, hpm). Määrä laski ajan myötä, kun taas 3D20E-tasot nousivat merkittävästi (kuva 1). Käyttämällä kemiallisesti syntetisoitua 3D20E:tä standardina määritimme, että tämän steroidihormonin pitoisuudet parittelussa olevissa LRT:issä olivat vähintään 100 kertaa korkeammat kuin 20E:llä (laajennettu datataulukko 1). Näin ollen 3D20E22P on tärkein urospuolinen ekdysoni, joka siirtyy naaraspuoliseen LRT:hen parittelun aikana, ja sen defosforyloitu muoto, 3D20E, runsastuu huomattavasti pian parittelun jälkeen. Tämä viittaa jälkimmäisen ekdysonin tärkeään rooliin naaraspuolisessa parittelun jälkeisessä biologiassa.
Luotuamme uuden RNA-sekvensointidatan (RNA-seq) (kuva 2a) käyttäen räätälöityä bioinformatiikan prosessia, etsimme ekdysonikinaasia (EcK), ekdysoniodaasia (EO) ja 20E-modifioitua fosfataasigeeniä koodaavaa ekdysonia. EPP:tä ilmentyy lisääntymiskudoksissa. Tunnistimme yhden EPP-geenin kandidaatin ja kaksi potentiaalista EcK-geeniä (EcK1 ja EcK2), mutta emme löytäneet hyvää EO-geenin kandidaattia. Huomionarvoista oli, että yksittäisiä EPP-geenejä ilmentyi korkeilla tasoilla (98,9. persentiili) gambialaisissa MAG-soluissa, mutta ei naaraspuolisissa LRT-soluissa (kuva 2b), vastoin odotuksiamme, koska 3D20E22P:n defosforylaatio tapahtui tässä naaraspuolisessa kudoksessa. Siksi uskomme, että uros-EPP voi siirtyä parittelun aikana. Käytimme itse asiassa in vivo -stabiilia isotooppileimausta peittääksemme naarasproteiinin parittelun jälkeen. Kyseessä on entsyymi, jonka MS tunnisti naaraspuolisessa eteisessä (kuva 2c ja lisätaulukko 1). EPP:n läsnäolo MAG-soluissa ja pariutunut (mutta ei neitsyt) naaraspuolinen LRT varmistettiin myös spesifisillä vasta-aineilla (kuva 2d).
a, Mukautettu bioinformatiikan prosessi, jolla etsitään kummankin sukupuolen lisääntymiskudoksista EcK-, EO- ja EPP-geenejä koodaavia geenejä. Nuolien vieressä olevat numerot osoittavat uros- ja naaraskandidaattien lukumäärän kussakin vaiheessa. Tässä analyysissä tunnistettiin yksi EPP-geeni (EPP) ja yksi EcK-geeni (EcK1), joita ilmentyy uroksissa, ja yksi EcK-geeni (EcK2), jota ilmentyy molemmissa sukupuolissa, mutta joka ei tuota EO-geenikandidaatteja. b, Lämpökartta, jossa vertaillaan kandidaattigeenien ilmentymistä neitsyt- (V) ja parittuvien (M) Anopheles gambiae- ja Anopheles albicans -kudoksissa. Spca, hedelmöitys; MAG-rauhaset, uroskärpästen lisärauhaset; muita kehon osia, mukaan lukien rinnat, siivet, jalat, rasvakudokset ja sisäelimet molemmilla sukupuolilla sekä munasarjat naarailla. EcK2:ta ilmentyy runsaasti sekä Gambian MAG:ssa että eteisissä, kun taas EPP:tä löytyy vain MAG:sta. c, Proteomianalyysi urossiemennesteen ryhmän siirtymisestä naarassiemennesteeseen 3, 12 ja 24 hv:n kohdalla, joka osoittaa 67 runsainta proteiinia. Naaraita kasvatettiin ruokavaliolla, joka sisälsi 15N:ää kaikkien proteiinien merkitsemiseksi (ja peittämiseksi). Merkitsemättömät urokset paritettiin merkittyjen naaraiden kanssa, ja naaraspuoliset LRT:t dissektoitiin 3, 12 ja 24 hv:n kohdalla proteomiikka-analyysia varten (katso lisätaulukko 1 täydellisestä luettelosta siemennesteen proteiineista). Lisäyksessä EPP, Eck1 ja EcK2 havaittiin neitsyturosten MAG:ssa näiden kudosten proteomiikka-analyysin avulla. d, EPP havaittiin Western blotilla pariteltujen naaraiden MAG:ssa ja LRT:ssä, mutta ei neitsytnaarailla tai -uroksilla tai muualla naaraskehossa. Kalvot tutkittiin samanaikaisesti. koetettu anti-aktiinilla (latauskontrolli) ja anti-EPP-vasta-aineilla. Kaikki miehet ovat neitsyitä. Katso geelin lähdetiedot lisäkuvasta 1. Western-blotit tehtiin kahdesti samankaltaisin tuloksin.
EPP:n ekdysteroidifosfofosfataasiaktiivisuus varmistettiin HPLC-MS/MS:llä inkuboinnin jälkeen MAG:sta eristetyn 3D20E22P:n kanssa (laajennettu data, kuva 2a). Lisäksi, kun hiljensimme EPP:n RNA-välitteisellä interferenssillä (RNAi), havaitsimme voimakkaan fosfataasiaktiivisuuden vähenemisen näiden koiraiden lisääntymiskudoksissa (kuva 3a), ja EPP-hiljennetyillä koirailla paritetuilla naarailla havaittiin merkittävästi pienempi defosforyloitunut 3D20E:n osuus (kuva 3b) osittaisesta geenien hiljentämisestä huolimatta (laajennettu data, kuva 2b, c). Sitä vastoin emme havainneet merkittäviä muutoksia 20E22P/20E-suhteessa samoilla hyttysillä, mikä saattaa viitata siihen, että entsyymi on spesifinen 3D20E22P:lle (kuva 3b).
a, MAG-geenin fosfataasiaktiivisuuden väheneminen, joka johtui EPP-vaimennuksesta käyttämällä kaksijuosteista EPP-RNA:ta (dsEPP) tai kaksijuosteista GFP-RNA:ta (dsGFP). Jokaisessa replikaatissa käytettiin 20 MAG-poolia (P = 0,0046, paritettu t-testi, kaksipuolinen), joita edustivat erilliset pisteet. b, EPP-vaimennettujen urosten kanssa paritetuilla naarailla oli merkittävästi pienempi defosforyloituneen 3D20E:n osuus nopeudella 3 hvm (P = 0,0043, pariton t-testi, kaksipuolinen), kun taas 20E-tasot eivät muuttuneet (P = 0,063, pariton). t-testi, kaksipuolinen). Tiedot esitetään keskiarvona ± keskiarvovirhe kolmesta poolista, joissa kussakin on 13, 16 ja 19 naarasta.c, EPP-vaimennettujen urosten kanssa paritetuilla naarailla oli merkittävästi korkeampi uudelleenparittelun määrä (P = 0,0002, Fisherin tarkka testi, kaksipuolinen). Naaraat pakotettiin ensin parittelemaan parittelustatuksensa varmistamiseksi; Kaksi päivää myöhemmin ne otettiin yhteyttä muihin transgeenisiä siittiöitä kantaviin uroksiin uudelleenparitteluasteen arvioimiseksi transgeenin kvantitatiivisella PCR-detektiolla.d, Verellä ruokituilla naarailla, jotka oli paritettu EPP-vaimennettujen urosten kanssa, oli merkittävästi heikentynyt hedelmällisyys (P < 0,0001; Mann-Whitney-testi, kaksipuolinen) ja hieman vähentynyt munien määrä (P = 0,088, Mann-Whitney-testi, kaksipuolinen), kun taas kutuasteeseen ei ollut vaikutusta (P = 0,94, Fisherin tarkka testi, kaksipuolinen). Kaikissa paneeleissa n edustaa biologisesti riippumattomien hyttysnäytteiden lukumäärää.NS, ei merkitsevä.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Seuraavaksi arvioimme, onko ekdysonin defosforylaatiolla merkitystä paritteluresistenssin indusoinnissa naarailla. Merkillepantavaa oli, että EPP:tä vailla olevien urosten kanssa paritetut naaraat parittelivat uudelleen paljon useammin (44,9 %) kuin kontrolliryhmän naaraat (10,4 %), kun ne altistettiin lisää (transgeenisille) uroksille (kuva 3c). Havaitsimme myös merkittävän hedelmällisyyden laskun (kuva 3d, vasen) ja näiden naaraiden munimien munien määrän pienenemisen (kuva 3d, keskellä), kun taas naaraiden munimien munien prosenttiosuus (toinen parittelun aiheuttama vaste) ei muuttunut (kuva 3d, oikea). Ottaen huomioon EPP:n havaitun spesifisyyden 3D20E22P:lle, nämä tulokset viittaavat siihen, että parittelun aikana siirretyn EPP:n aiheuttama 3D20E:n aktivoituminen voi olla tärkeässä roolissa naaraiden vastaanottavuuden sammuttamisessa lisäparittelulle, mikä on aiemmin liitetty 20E:n suvulliseen siirtymiseen. Siksi tämä uroskohtainen hormoni vaikuttaa myös voimakkaasti naaraiden hedelmällisyyteen.
Seuraavaksi vertasimme 20E:n ja 3D20E:n aktiivisuuksia injektiokokeissa sukupuolikypsillä neitsyillä käyttäen kemiallisesti syntetisoitua 3D20E:tä (kuva 4a–c) ja kaupallisesti saatavilla olevaa 20E:tä. Havaitsimme, että 3D20E oli merkittävästi tehokkaampi kuin 20E sammuttamaan naaraiden herkkyyden parittelulle molemmilla pitoisuuksilla (kuva 4d). Merkillepantavaa oli, että puolet 3D20E:n fysiologisesta pitoisuudesta LRT:ssä (1 066 pg injektion jälkeen vs. 2 022 pg parittelun jälkeen) indusoi 20 kertaa suuremman osuuden hoitoon reagoimattomista naaraista kuin 20E:n fysiologinen taso (361 pg injektion jälkeen) 24 tuntia injektion jälkeen suurimmalla pitoisuudella, 18 pg parittelun jälkeen; Laajennettu datataulukko 1). Tämä tulos on yhdenmukainen sen käsityksen kanssa, että 20E:n suvullinen siirtyminen ei aiheuta parittelun vastarefraktiojaksoja, ja viittaa edelleen siihen, että 3D20E on merkittävä tekijä vanhemman ja lapsen välisen suhteen varmistamisessa. 3D20E oli myös merkittävästi aktiivisempi kuin 20E munintakokeissa neitsytnaarailla (kuva 4e), mikä viittaa siihen, että osittaisen EPP-vaimennuksen jälkeen havaitsemamme normaali munintanopeus johtui parittelun aiheuttamien naarastekijöiden edelleen tuottamasta jäännös-3D20E-aktiivisuudesta.
(a,b) 3D20E, joka on kemiallisesti syntetisoitu yhdisteestä 20E (a) erittäin korkealla konversiolla/tehokkuudella (tiedot esitetään keskiarvona ± keskiarvovirhe kolmesta riippumattomasta synteesireaktiosta) (b).c, Massaspektri (alaosa) vastaa täsmälleen paritetussa naaraspuoliskossa olevaa ekdysonia (yläosa).d, Verrattuna yhdisteeseen 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; Fisherin tarkka testi, kaksipuolinen) ja 10 % etanoliin (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; Fisherin tarkka testi, kaksipuolinen), kun taas 20E oli merkittävästi korkeampi kuin kontrolli vain suuremmilla annoksilla (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; Fisherin tarkka testi, kaksipuolinen).e, 3D20E-injektio indusoi merkitsevästi korkeammat kutunopeudet neitsyillä naarailla kuin 10 % etanolia sisältävillä kontrolleilla (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; Fisherin tarkka testi, kaksipuolinen), kun taas 20E verrattuna kontrolleihin vain suuremmilla annoksilla (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; Fisherin tarkka testi, kaksipuolinen). 3D20E indusoi merkitsevästi korkeammat kutunopeudet kuin 20E suuremmilla annoksilla (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; Fisherin tarkka testi, kaksipuolinen). Kaikissa paneeleissa n edustaa biologisesti riippumattomien hyttysnäytteiden lukumäärää. NS, ei merkitsevä. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Tiedot ovat peräisin kolmesta toistoja.
Aiemmissa tutkimuksissa havaitsimme, että steroidihormonien suvullinen siirtyminen indusoi MISO:n (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11) ilmentymistä. MISO on naaraspuolinen lisääntymisgeeni, joka suojaa A. gambiae -naaraita P. falciparum -infektiolta. 13:n, tappavimman ihmisen malarialoisen, aiheuttamat terveyskustannukset. Koska MISO on tärkeä Anophelesin lisääntymiskyvylle malariaendeemisillä alueilla, päätimme selvittää, kumpi hormoni, 3D20E vai 20E, laukaisee tämän geenin ilmentymisen. Havaitsimme, että vaikka 20E-injektio indusoi spesifisesti tai voimakkaammin joitakin ydinhormonireseptoreita (HR), kuten HR3 ja HR4, ja tyypillisiä alavirran steroidikohteita, kuten yolkogeenisiä geenejä Vg14, 15, 16, 3D20E indusoi MISO:a voimakkaammin (laajennettu data, kuva 3). Näin ollen tämän androgeenisen steroidihormonin suvullinen siirtyminen näyttää indusoivan mekanismeja, jotka suojaavat naaraita loisinfektion aiheuttamilta kustannuksilta. Lisäksi 3D20E vaikuttaa eri tavoin molempiin isoformeihin. E-reseptori EcR, joka indusoi EcR-A:n ja repressoi EcR-B:n, ja laukaisee voimakkaammin muita parittelua indusoivia geenejä, mukaan lukien HPX15:n, joka vaikuttaa naaraiden hedelmällisyyteen. Tämä voisi selittää merkittävän hedelmättömyyden, jota on havaittu naarailla, jotka on paritettu EPP-vaimennettujen urosten kanssa (laajennettu data, kuva 3). Nämä tiedot viittaavat kahden ekdysonihormonin ensisijaisesti aktivoimien alavirran reittien olemassaoloon, jotka voivat olla sukupuolispesifisen toiminnan taustalla.
Seuraavaksi testasimme bioinformatiikan tutkimusputkessamme tunnistettujen kahden EcK-geenin toimintaa. EcK1:n tai EcK2:n hiljentäminen johti merkittävään kuolleisuuteen uroksilla (laajennettu data, kuva 4a), mikä viittaa siihen, että ekdysonin fosforylaatio ja siten inaktivaatio on tärkeää selviytymisen kannalta. Koska EcK2:ta ilmentyi korkeammilla tasoilla kuin EcK1:tä ja se havaittiin MAG-soluissa proteomiikalla (kuva 2b, c ja lisätaulukko 2), validoimme sen ekdysteroidikinaasiaktiivisuuden inkuboimalla sitä 20E:n kanssa, mikä johti 20E22P:n fosforylaatioon (laajennettu data, kuva 2).4b). Käytettäessä 3D20E:tä substraattina emme kyenneet havaitsemaan fosforyloitua tuotetta 3D20E22P (laajennettu data, kuva 4c), mikä viittaa siihen, että 20E eikä 3D20E saattaa olla EcK2:n ensisijainen kohde.
RNA-sekvensointianalyysimme mukaan EcK2:ta ilmentyi runsaasti myös neitsytnaaraiden LRT:ssä, jossa se kytkeytyi pois päältä parittelun jälkeen (kuva 2b). Vahvistimme nämä tiedot ja totesimme, että veren syöttäminen ei vaikuttanut EcK2:n ilmentymiseen (laajennettu data, kuva 5a). Laajentamalla alkuperäisiä MS-kokeitamme totesimme, että 20E22P:n huippu oli läheisessä yhteydessä 20E:n huippuun (22–26 tuntia veriaterian jälkeen; laajennettu data, kuva 5b). EcK2:n hiljentäminen neitsytnaarailla johti 20E:n ja 20E22P:n suhteellisen suhteen kolminkertaistumiseen 26 tuntia veriaterian jälkeen (laajennettu data, kuvat 2c ja 5c), mikä vahvistaa, että EcK2 fosforyloi myös 20E:tä naarailla. Huomionarvoista on, että EcK2-köyhät neitsyet säilyttivät täyden seksuaalisen vastaanottavuuden (laajennettu data, kuva 5d, e), mikä viittaa edelleen siihen, että naaraiden 20E:n tuotanto ei indusoi parittelun vastarefraktiojaksoja. Näillä naarailla oli kuitenkin merkittävästi lisääntynyt munintaprosentit verrattuna kontrolleihin, ja yli 30 % neitsyistä munisi (laajennettu data, kuva 5f). Jos kaksijuosteista Eck2 RNA:ta (dsEcK2) injektoitiin veren syöttämisen jälkeen, kutua ei tapahtunut, jolloin veren nauttimisesta johtuva 20E-huippu oli laskenut. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset tukevat mallia, jonka mukaan veren imemisen jälkeen tuotettu 20E voi indusoida kutua, mutta vain silloin, kun kutua estävä tekijä (EcK2 ja mahdollisesti muut tekijät) kytketään pois päältä parittelun vaikutuksesta. Eivätkä 20E- eivätkä 3D20E-injektiot estäneet EcK2:n ilmentymistä neitsyillä (laajennettu data, kuva 5g), mikä viittaa siihen, että muut tekijät välittävät tämän kinaasin estoa. Veren syöttämisen jälkeiset 20E-tasot eivät kuitenkaan riittäneet aiheuttamaan paritteluepämukavuutta, vaan ne laukaistiin tehokkaasti sukupuoliteitse siirrettyjen 3D20E-solujen korkeiden titterien ansiosta.
Tuloksemme antavat tärkeää tietoa A. gambiaen lisääntymismenestystä säätelevistä mekanismeista. On syntynyt malli, jossa koiraat ovat kehittyneet syntetisoimaan korkeita määriä 3D20E:tä, koiraalle spesifistä modifioitua ekdysonia, joka varmistaa sukutaustan tekemällä naaraista herkempiä lisääntymiselle. Samaan aikaan nämä malariavektorit ovat myös kehittäneet tehokkaan järjestelmän 3D20E:n aktivoimiseksi naarailla vastauksena koiraalle spesifisen EPP:n suvulliseen siirtymiseen. Tietojemme mukaan tämä on ensimmäinen esimerkki koiraan ja naiseen hallitsemasta steroidihormonijärjestelmästä, jolla on ainutlaatuinen ja kriittinen tehtävä hyönteisissä. Koiraalle spesifinen ekdysonin toiminta on oletettu, mutta sitä ei ole lopullisesti osoitettu. Esimerkiksi suurelta osin kumottu hypoteesi 18 on, että nämä toiminnot voi suorittaa 20E:n esiaste E1. On hyvin tunnettua, että Drosophila-kärpäsillä monandrian laukaisee pienten sukupuolipeptidien 19,20 suvullinen siirtyminen, jotka ovat vuorovaikutuksessa naaraan lisääntymiskanavaa hermottavien neuronien kanssa spesifisten sukupuolipeptidireseptorien 21,22 kautta. Lisätyötä tarvitaan, jotta voidaan määrittää alavirran signalointikaskadit, joita säätelevät 3D20E A. gambiae -naarailla ja sen määrittämiseksi, voidaanko näitä kaskadeja säilyttää hyttysten ja Drosophilan välillä.
Koska 3D20E:llä on tutkimuksessamme havaittu tärkeä rooli naaraiden hedelmällisyydessä ja käyttäytymisessä, 3D20E:n synteesiin ja aktivaatioon johtavat reitit tarjoavat uusia mahdollisuuksia tulevaisuuden hyttysten torjuntastrategioille, kuten kilpailukykyisten steriilien koiraiden luomiselle steriileissä hyönteisteknologiastrategioissa, joita voidaan käyttää villiin vapauttamiseen tai 3D20E:n jäljittelemiseen neitsytleikissä. 3D20E:n koiraskohtainen toiminto on saattanut kehittyä, kun A. gambiae ja muut Cellia-lajit saivat kyvyn hyytyä siemennesteensä parittelutulpiksi, koska tämä mahdollistaa suuren määrän hormonien ja hormoneja aktivoivien entsyymien tehokkaan siirtymisen. Monandrian toteuttava 3D20E-evoluutio puolestaan ​​tarjoaa naaraille mekanismin (MISO:n korkean ilmentymisen kautta) edistää lisääntymiskykyään alueilla, joilla on korkea malarian esiintyvyys, mikä epäsuorasti edistää Plasmodiumin leviämistä. Koska naaraspuolisen 20E:n on osoitettu vaikuttavan merkittävästi P. falciparumin selviytymiseen ja kasvuun naaraspuolisissa Anopheles-hyttysissä,24 sekä uros- että naaraspuoliset steroidihormonireitit ovat nyt keskeisiä hyttysen ja loisen vuorovaikutuksen osa-alueita.
A. gambiae G3 -kantoja kasvatettiin hyönteisten vakio-olosuhteissa (26–28 °C, 65–80 % suhteellinen kosteus, 12:12 h valoisa/pimeä fotoperiodi). Toukille syötettiin jauhemaista kalanruokaa (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets ja Tetra Pond Sticks suhteessa 7:7:2). Aikuisille hyttysille syötettiin vapaasti 10 % dekstroosiliuosta ja viikoittain ihmisverta (tutkimusveren komponentit). Neitsythystys saatiin erottamalla sukupuolet kotelovaiheessa mikroskopian avulla tutkittuaan päitä. DsRed-transgeeniä kantavia uroksia on kuvattu aiemmin.
Pakotetun parittelun kokeet suoritettiin aiemmin kuvattujen protokollien mukaisesti. Luonnollisessa parittelussa 4 päivän ikäisiä neitsytnaaraita pidettiin suhteessa 1:3 sukupuolikypsien neitsyturosten kanssa kahden yön ajan. Kokeissa, joissa uroksiin injektoitiin dsEPP:tä, yhteishäkkiminen osui yksiin injektion jälkeisten päivien 3–4 kanssa, jolloin fosfataasiaktiivisuus oli maksimaalisesti hiljentynyt (laajennettu data, kuva 2b).
Hyttysten kudokset, jäljelle jääneet ruhot (loput ruumiista) tai koko ruumis dissektioitiin 100-prosenttiseen metanoliin ja homogenisoitiin homogenisaattorilla (2 mm:n lasihelmet, 2 400 rpm, 90 sekuntia). Kudosmäärät ja metanolitilavuudet olivat seuraavat: loput ruumiista, 50 µl 1 000 µl:ssa; MAG, 50–100 µl 80 µl; naaraspuoliset LRT:t, 25–50 µl 80 µl. Sakka uutettiin toisella metanolilla samalla metanolitilavuudella. Solujätteet poistettiin sentrifugoimalla. Molemmista uutteista saatu metanoli yhdistettiin ja kuivattiin typpivirrassa, minkä jälkeen se suspendoitiin uudelleen seuraaviin tilavuuksiin 80-prosenttista metanolia vedessä: loput ruumiista, 50 µl; MAGit ja naaraspuoliset LRT:t, 30 µl.
Näytteet analysoitiin massaspektrometrillä (ID-X, Thermo Fisher), joka oli kytketty LC-laitteeseen (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl näytettä injektoitiin 3 µm, 100 × 4,6 mm kolonniin (Inspire C8, Dikma), jota pidettiin 25 °C:ssa. LC:n liikkuvat faasit olivat A (vesi, 0,1 % muurahaishappoa) ja B (asetonitriili, 0,1 % muurahaishappoa). LC-gradientti oli seuraava: 5 % B:tä 1 minuutin ajan, sitten nostettiin 100 %:iin B:tä 11 minuutin aikana. 8 minuutin kuluttua 100 %:ssa kolonni tasapainotetaan uudelleen 5 % B:ssä 4 minuutin ajan. Virtausnopeus oli 0,3 ml min-1. Ionisaatio MS-lähteessä suoritetaan kuumennetulla sähkösuihkutusionaatiolla positiivisessa ja negatiivisessa tilassa.
Massaspektrometri mittaa dataa m/z-alueella 350–680 60 000:n resoluutiolla täydessä MS-tilassa. MS/MS-data kerättiin [M + H]+ (kaikki kohteet), [M - H2O + H]+ (kaikki kohteet) ja [M - H]- (fosforyloidut kohteet) -yhdisteille. MS/MS-dataa käytettiin varmistamaan kohteiden ekdysoniominaisuudet, joille ei ollut saatavilla standardia. Kohteena olevien ekdysteroidien tunnistamiseksi analysoitiin kaikkien yli 15 %:n suhteellisen runsauden omaavien HPLC-piikkien MS/MS-data. Kvantifioi käyttämällä puhtaista standardeista (20E, 3D20E) luotuja standardikäyriä yhden tietyn näytteen (kaikki muut kohteet) absoluuttisten määrien tai laimennosten laskemiseksi niiden vastaavuuden laskemiseksi yhdellä uroksellisella löydetyille määrille. 3D20E:lle kvantifiointi suoritettiin käyttämällä seuraavien adduktien summaa: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Data uutettiin ja kvantifioitiin Tracefinderillä (versio 4.1). MS/MS-tiedot analysoitiin Xcaliburilla (versio 4.4). E:n, 20E:n ja 3D20E:n MS-spektrejä verrattiin vastaaviin standardeihin. 3D20E22P analysoitiin derivatisoimalla Girardin reagenssilla. 20E22P analysoitiin m/z-suhteen perusteella.
3D20E22P puhdistettiin MAG:sta. Puhdistus suoritettiin analyyttisessä mittakaavassa käyttäen ultra-tehonestekromatografiaa (Acquity, Waters) ja kvadrupolimassaan perustuvaa detektoria (QDa, Acquity, Waters) samoissa LC-olosuhteissa kuin HPLC-MS/MS-analyysissä. Fraktioiden kerääminen käynnistettiin, kun 3D20E22P:tä vastaava m/z havaittiin samalla retentioajalla kuin aiemmin määritettiin. Uutettujen yhdisteiden puhtaus tarkistettiin sitten HPLC-MS/MS:llä edellä kuvatulla tavalla.
Kokonais-RNA uutettiin 10–12 lisääntymiskudoksesta tai muusta kehon osasta (päättömästä) käyttämällä TRI-reagenssia (Thermo Fisher) valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA käsiteltiin TURBO DNase -reagenssilla (Thermo Fisher). cDNA syntetisoitiin käyttämällä Moloney-hiiren leukemiaviruksen käänteiskopioijaentsyymiä (M-MLV RT; Thermo Fisher) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Käänteiskopioinnin kvantitatiivisen PCR:n alukkeet (RT-qPCR; laajennettu datataulukko 2) on aiemmin julkaistu24 tai suunniteltu käyttämällä Primer-BLAST26:ta, etusijalla olivat 70–150 bp:n kokoiset tuotteet, jotka ulottuivat eksoni-eksoniliitosten yli tai alukeparialukkeet erottavat eksonit. Kolmesta neljään biologiseen replikaattiin kuuluvat cDNA-näytteet laimennettiin nelinkertaisesti vedellä RT-qPCR:ää varten. Kvantifiointi suoritettiin 15 µl:n replikaattireaktioissa, jotka sisälsivät 1× PowerUp SYBR Green Master Mixiä (Thermo Fisher), alukkeita ja 5 µl laimennettua cDNA:ta. Reaktiot ajettiin QuantStudio 6 Pro -reaaliaikaisella PCR-järjestelmällä (Thermo Fisher) ja tiedot kerättiin ja analysoitiin Design and Analysis -ohjelmistolla (versio 2.4.3). Kuten tässä tutkimuksessa osoitettiin, suhteelliset määrät normalisoitiin ribosomaalisen geenin RpL19 (AGAP004422) suhteen, jonka ilmentyminen ei muuttunut merkittävästi veren syöttämisen27 tai parittelun3 myötä.
RNA:n laatu tarkistettiin Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer -laitteella (Agilent). Illumina-paritettujen päiden kirjastot valmistettiin ja ajettiin MIT:n ja Harvardin Broad Institutessa. Sekvensointitulokset kohdistettiin A. gambiae -genomiin (PEST-kanta, versio 4.12) käyttämällä HISAT2-ohjelmaa (versio 2.0.5) oletusparametreilla. Lukemat, joiden kartoituslaatu (MAPQ) -pisteet olivat alle 30, poistettiin Samtools-ohjelmalla (versio 1.3.1). Geeneihin kartoitettujen lukujen lukumäärä laskettiin käyttämällä htseq-count-ohjelmaa (versio 0.9.1) oletusparametreilla. Normalisoidut lukumäärät laskettiin ja geenien differentiaalista ilmentymistä analysoitiin käyttämällä DESeq2-pakettia (versio 1.28.1) R-ohjelmassa (versio 4.0.3).
Ekdysonia modifioivat geenikandidaatit tunnistettiin hakemalla ensin A. gambiae -genomia PSI-BLAST-algoritmilla (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) käyttäen oletusarvoparametreja seuraavilla kyselyproteiinisekvensseillä: Bombyx mori (lisäysnro NP_001038956.1), Musca domestica (lisäysnro XP_005182020.1, XP_005175332.1 ja XP_011294434.1) ja Microplitis demolitor (lisäysnro XP_008552646.1 ja XP_008552645.1) EcK B. mori (lisäysnro NP_001036900), Drosophila melanogaster (lisäysnro NP_651202), Apis mellifera (lisäysnro XP_394838) ja Acyrthosiphon pisum (lisäysnro XP_001947166); sekä EPP B. morista (lisäysnro XP_001947166) NP_001177919.1 ja NP_001243996.1) ja EO D. melanogasterista (lisäysnro NP_572986.1) (vaihe 1). Seuraavaksi suodatetaan osumat Gambian lisääntymiskudoksessa (naaras LRT tai MAG) havaittujen korkean mRNA-ilmentymisen perusteella (>100 fragmenttia/kiloemäseksonia miljoonaa kartoitettua lukua (FPKM) tai >85 %) (vaihe 2). Spesifisyyden parantamiseksi valitsimme kandidaattientsyymejä, joita ilmentyy myös A. albimanuksen lisääntymiskudoksessa. Anopheles-laji ei syntetisoi tai siirrä ekdysonia parittelun aikana. Kandidaattigeenit suodatettiin niiden alhaisen ilmentymisen (<100 FPKM tai <85. persentiili) perusteella A. albimanuksen lisääntymiskudoksessa (vaihe 3). Viimeisenä suodattimena (vaihe 4) kandidaattigeenien on täytettävä vähintään yksi seuraavista vaatimuksista: (1) merkittävästi lisääntynyt parittelun jälkeen (P < 0,05) eri tavoin ilmentyneiden geenien analyysin mukaan ja (2) ei-lisääntymiskudoksissa (< 85 % tai <100 FPKM).
Muokkasimme aiemmin kuvattuja menetelmiä 28, 29, 30 saavuttaaksemme koko organismin isotooppileimauksen. Lyhyesti sanottuna villityypin Saccharomyces cerevisiae tyyppiä II (YSC2, Sigma) testattiin hiivatypillä (BD Difco, DF0335), joka sisälsi (paino/tilavuus) 2 % glukoosia (G7528, Sigma), 1,7 % aminohappotonta ja ammoniumsulfaattia. viljelyalustaa) ja 5 % 15N ammoniumsulfaattia (NLM-713, >99 %, Cambridge Isotope Laboratories) ainoana typpilähteenä. Hiiva otettiin talteen sentrifugoimalla ja hyttystoukkia ruokittiin vapaasti koteloitumiseen asti. Neljännen asteen kuolleisuuden estämiseksi lisättiin kalajauhoa (0,5 mg per 300 toukkaa). Parittelukokeissa käytettiin vain naaraita, ja leimaamattomia uroksia käytettiin parittelun aikana siirtyneen urosproteomin analysointiin.
4–6 päivän ikäiset 15N-merkityt neitsytnaaraat pakotettiin parittelemaan ikätasoitettujen merkitsemättömien neitsytkoirien kanssa. Onnistunut parittelu varmistettiin havaitsemalla parittelutulpat epifluoresenssimikroskopialla. 3, 12 ja 24 tpm:n kohdalla 45–55 paritetun naaraan eteiset dissektoitiin 50 µl:aan ammoniumbikarbonaattipuskuria (pH 7,8) ja homogenisoitiin survimella. Homogenaatti sentrifugoitiin ja supernatantti sekoitettiin 50 µl:aan 0,1 % RapiGestiä (186001860, Waters) 50 mM ammoniumbikarbonaatissa. Kunkin näytteen supernatantti ja pelletti pakastettiin pikajäällä ja lähetettiin yön yli Washingtonin yliopiston MacCoss-laboratorioon, jossa näytteen valmistelu LC-MS/MS:ää varten suoritettiin. Suspendoi pelletti uudelleen 50 µl:aan 0,1 % RapiGestiä 50 mM ammoniumbikarbonaatissa ja sonikoita vesihauteessa. Pelletin ja supernatantin proteiinipitoisuus mitattiin BCA:lla. Määrityksessä näytteet pelkistettiin 5 mM ditiotreitolilla (DTT; Sigma), alkyloitiin 15 mM jodiasetamidilla (Sigma) ja inkuboitiin 37 °C:ssa (1:0 50) 1 tunnin ajan trypsinoinnilla: trypsiini:substraatti-suhteella). RapiGest lysoitiin lisäämällä 200 mM HCl:a, minkä jälkeen inkuboitiin 37 °C:ssa 45 minuuttia ja sentrifugoitiin nopeudella 14 000 rpm 10 minuuttia 4 °C:ssa jätteiden poistamiseksi. Näytteet pestiin kaksoismoodi-kiinteäfaasiuutolla (Oasis MCX -patruunat, Waters) ja suspendoitiin uudelleen 0,1 % muurahaishappoon lopulliseen proteiinipitoisuuteen 0,33 µg µl-1. Leimaamattomia MAG-proteomeja analysoitiin samalla tavalla neitsyteläimiltä. Jokaisesta näytteestä analysoitiin kaksi analyyttistä toistoa. Seuraavaksi analysoitiin 1 µg kutakin näytteestä käyttämällä 25 cm:n fuusioitua silikageeliä 75 μm:n kolonnilla, jossa oli 4 cm:n fuusioitu... piidioksidi Kasil1 (PQ) -frittiloukku, joka on täytetty Jupiter C12 -käänteisfaasihartsilla (Phenomenex), ja 180 minuutin nestekromatografia. Näyteanalyysit – MS/MS ajettiin Q-Exactive HF -massaspektrometrillä (Thermo Fisher) ja nanoACQUITY UPLC -järjestelmällä (Waters). Kullekin ajolle generoidut dataan liittyvät hankintatiedot muunnettiin mzML-muotoon käyttämällä Proteowizardia (versio 3.0.20287) ja Comet31:tä (versio 3.2) FASTA-tietokantaa vasten, joka sisälsi proteiinisekvenssejä Anopheles gambiaesta (VectorBase versio 54), Anopheles coluzzista (Haku tehtiin Mali-NIH:sta (VectorBase versio 54), Saccharomyces cerevisiaesta (Uniprot, maaliskuu 2021), A. gambiaen RNA-sekvensoinnista ja tunnettujen ihmisen kontaminanttien kolmen kehyksen translaatioista. Peptidikarttaan sopivat FDR:t määritettiin käyttämällä Percolator32:ta (versio 3.05) kynnysarvolla 0,01, ja peptidit koottiin proteiinitunnistuksiksi käyttämällä proteiiniparsimoniaa Limelight33:ssa (versio 2.2.0). Proteiinin suhteellinen runsaus arvioitiin käyttämällä normalisoitua spektraalista runsauskerrointa (NSAF), joka laskettiin kullekin proteiinille kussakin ajossa aiemmin kuvatulla tavalla. Kunkin proteiinin NSAF keskiarvoistettiin kahden eri biologisen replikaatin näytteistä.15N-leimaus peitti onnistuneesti naarasproteomin, vaikka pieni määrä leimaamatonta proteiinia havaittiin leimatuista neitsyistä. Havaitsimme urosproteiinin vähenemisen (1-5 spektriä) naarasraakanäytteissä vain teknisissä ajoissa, joissa raakanäytteet ajettiin uros-/parittelunäytteiden jälkeen HPLC:n "siirtymän" seurauksena. Satunnaisesti leimatuista neitsyistä "kontaminantteina" löydetyt proteiinit on lueteltu lisätaulukossa 1.
Kaksi antigeenistä peptidiä, QTTDRVAPAPDQQQ (isotyypin PA sisällä) ja MESDGTTPSGDSEQ (isotyypin PA ja PB sisällä) Genscriptissä. Nämä kaksi peptidiä yhdistettiin, konjugoitiin kantajaproteiiniin KLH ja injektoitiin Uuden-Seelannin kaneihin. Kanit lopetettiin neljännen injektion jälkeen ja kokonais-IgG eristettiin affiniteettipuhdistuksella. EPP-spesifisimmän kanin IgG:tä käytettiin jatkotutkimuksiin Western blot -analyysissä.
Western blot -analyyseissä lisättiin erikseen MAGia (n = 10, jossa n edustaa biologisesti riippumattomien hyttysnäytteiden lukumäärää) ja naaraspuolisia LRT-hyttysnäytteitä (n = 30) 4 päivän ikäisiltä neitsytkoirailta ja neitsyt- tai pakkosiirretyiltä naarailta (<10 parittelun jälkeen), proteiiniuuttopuskuria (50 mM Tris, pH 8,0; 1 % NP-40; 0,25 % natriumdeoksikolaattia; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× proteaasi-inhibiittoricocktail (Roche)). Näytteet homogenisoitiin heti dissektion jälkeen homogenisaattorilla (2 mm lasihelmet, 2 400 rpm, 90 sekuntia). Liukenematon jäte poistettiin sentrifugoimalla 20 000 g:n voimalla 4 °C:ssa. Proteiinit kvantifioitiin Bradford-määrityksellä (Bio-Rad). Sitten 20 µg MAG-proteiinia, 40 µg LRT-proteiinia ja 20 µg jäännösproteiinia denaturoitiin ja erotettiin 10 % Bis-Trisillä. NuPAGE käyttäen MOPS-puskuria. Proteiinit siirrettiin polyvinylideenifluoridikalvoille käyttäen iBlot2-siirtojärjestelmää (Thermo Fisher). Kalvot pestiin kahdesti 1× PBS-T:llä (0,1 % Tween-20 PBS:ssä) ja sitten blokattiin Odyssey-blokkauspuskurissa (Li-Cor) 1 tunnin ajan 22 °C:ssa. Kalvoja ravisteltiin yön yli 4 °C:ssa räätälöidyn kaniinin anti-EPP-polyklonaalisen primaarivasta-aineen (1:700 blokkauspuskurissa) ja rotan anti-aktiini-monoklonaalisen primaarivasta-aineen MAC237 (Abeam; 1:4 000) kanssa. Kalvot pestiin PBS-T:llä ja inkuboitiin sitten sekundaaristen vasta-aineiden (aasin anti-kaniini 800CW ja vuohen anti-rotta 680LT (Li-Cor), molemmat 1:20 000) kanssa blokkauspuskurissa, joka sisälsi 0,01 % SDS:ää ja 0,2 % Tween-20:tä, 1 tunnin ajan 22 °C:ssa. Kalvot pestiin PBS-T:llä ja kuvattiin Odyssey CLx -laitteella. skanneri. Kuvat kerättiin ja käsiteltiin Image Studiolla (versio 5.2). EPP-RA-isoformia (82 kDa) vastaavaa spesifistä juovaa ei havaittu.
EPP:n (isoformina AGAP002463-RB, joka sisältää histidiinifosfataasidomeenin, NCBI:n konservoituneen domeenin haku 34) ja EcK2:n (AGAP002181) koodaavat alueet kloonattiin pET-21a(+)-plasmidiin (Novagen Millipore Sigma); alukkeet on lueteltu laajennetussa datataulukossa 2. Kahdeksan GS4-linkkeriä (peräkkäin) lisättiin ennen pET-21a(+)-EcK2-konstruktin C-terminaalista 6xHis-merkkiä. Rekombinanttiproteiinit tuotettiin käyttämällä NEBExpress-solutonta E. coli -proteiinisynteesireaktiota (New England BioLabs). Rekombinanttiproteiinit puhdistettiin käyttämällä NEBExpress Ni -spin-kolonneja (New England BioLabs). Dihydrofolaattireduktaasi (DHFR) -kontrolliproteiini tuotettiin käyttämällä DNA-templaattia NEBExpress-soluvapaasta E. coli -proteiinisynteesipakkauksesta. Proteiineja säilytettiin 50-prosenttisessa glyserolissa PBS:ssä -20 °C:ssa enintään 3 kuukautta.
EPP:n ja kudosuutteiden fosfataasiaktiivisuus mitattiin käyttämällä 4-nitrofenyylifosfaattia (pNPP; Sigma-Aldrich). Reaktiopuskuri sisälsi 25 mM Trisiä, 50 mM etikkahappoa, 25 mM Bis-Trisiä, 150 mM NaCl:a, 0,1 mM EDTA:ta ja 1 mM DTT:tä. Kudos homogenisoitiin reaktiopuskurissa ja solujätteet poistettiin sentrifugoimalla. Reaktio aloitettiin lisäämällä entsyymiä tai kudosuutetta reaktiopuskuriin, joka sisälsi 2,5 mg ml-1 pNPP:tä. Reaktioseosta inkuboitiin huoneenlämmössä pimeässä, ja pNPP:stä muuntuneen pNP:n määrä kvantifioitiin mittaamalla absorbanssi 405 nm:ssä eri aikoina.
EcK-aktiivisuuden in vitro -määrityksessä proteiinia inkuboitiin 0,2 mg:n 20E:n tai 3D20E:n kanssa 200 µl:ssa puskuria (pH 7,5), joka sisälsi 10 mM HEPES-NaOH:ta, 0,1 % BSA:ta, 2 mM ATP:tä ja 10 mM MgCl2:ta, 2 tuntia 27 °C:ssa. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 800 µl metanolia, sitten jäähdytettiin -20 °C:ssa 1 tunti ja sentrifugoitiin sitten 20 000 g:llä 10 minuuttia 4 °C:ssa. Supernatantti analysoitiin sitten HPLC-MS/MS:llä. Kontrolliryhmässä käytettyjen proteiinien lämpöinaktivoimiseksi proteiineja inkuboitiin 50 % glyserolissa PBS:ssä 20 minuuttia 95 °C:ssa.
EPP-aktiivisuuden in vitro määrittämiseksi proteiinia inkuboitiin 3D20E22P:n kanssa (vastaa 18 MAG-parissa havaittua määrää, puhdistettu HPLC-MS/MS:llä) 100 µl:n puskurissa (pH 7,5), joka sisälsi 25 mM Tris:iä, 50 mM etikkahappoa, 25 mM Bis-Tris:iä, 150 mM NaCl:ia, 0,1 mM EDTA:ta ja 1 mM DTT:tä, 3 tuntia 27 °C:ssa. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 400 µl metanolia ja jäähdytettiin -20 °C:ssa 1 tunnin ajan, minkä jälkeen sentrifugoitiin 20 000 g:llä 10 minuuttia 4 °C:ssa. Supernatantti analysoitiin HPLC-MS/MS:llä.
EPP:n (362 bp), EcK1:n (AGAP004574, 365 bp) ja EcK2:n (556 bp) PCR-fragmentit monistettiin sekamuotoisten, päättömien hyttysten ruhoista valmistetusta cDNA:sta. eGFP-kontrollin PCR-fragmentti (495 bp) monistettiin aiemmin kuvatusta pCR2.1-eGFP:stä; PCR-alukkeet on lueteltu laajennetussa datataulukossa 2. PCR-fragmentti insertoitiin pL4440-plasmidin invertoitujen T7-promoottorien väliin. Plasmidirakenteet otettiin talteen NEB 5-α -kompetentista E. colista (New England Biolabs) ja varmistettiin DNA-sekvensoinnilla ennen käyttöä (katso inserttisekvenssi lisätiedoista 1). T7-promoottoriin (laajennettu datataulukko 2) sovitettuja alukkeita käytettiin insertin monistamiseen pL4440-pohjaisesta plasmidista. PCR-tuotteen koko varmistettiin agaroosigeelielektroforeesilla. dsRNA transkriptoitiin PCR-templaateista käyttämällä Megascript T7 -transkriptiopakkausta (Thermo Fisher) ja puhdistettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti aiemmin kuvatuin muutoksin.
dsRNA-injektiota varten injektoitiin 1 380 ng dsRNA:ta (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) 10 ng nl-1 -pitoisuudella aikuisten miesten tai naaraiden (Nanoject III, Drummond) rintaonteloon yhden päivän kuluessa sulkeutumisesta. Geenien alasajotasoja määritettiin vähintään kolmessa biologisessa toistossa RNA-uutolla, cDNA-synteesillä ja RT-qPCR:llä. Ekdysoni-injektiota varten 4 päivän ikäisille neitsyt- tai 6 päivän ikäisille verellä ruokituille neitsyt-naaraille injektoitiin 0,13, 0,21 tai 0,63 µg 20E:tä tai 3D20E:tä (Nanoject III, Drummond) pitoisuuksina 1,3 ja 2,1 kokeellisesta suunnittelusta riippuen tai 6,3 ng nl-1:tä. Injektoitiin 100 nl 10-prosenttista (vol/vol) etanolia vedessä; 100 nl 3D20E22P:tä 10-prosenttisessa etanolissa (vastaa 75 %:a MAG-parissa havaitusta määrästä). Hyttyset jaettiin satunnaisesti injektioryhmään.
Kutumäärityksissä 3 päivän ikäisille naaraille annettiin vapaasti ihmisen verta. Poistettiin osittain ruokitut tai ruokkimattomat hyttyset. Käsittelystä riippuen naaraat sijoitettiin erillisiin kutukuppeihin neljäksi yöksi vähintään 48 tuntia veriaterian jälkeen. Munat laskettiin stereoskoopilla (Stemi 508, Zeiss); pariteltujen naaraiden kohdalla toukiksi kuoriutuneita munia pidettiin hedelmällisinä.
Parittelukokeissa naarailla oli käsittelystä riippuen vähintään kaksi päivää aikaa kehittää paritteluresistenssi, ja villityypin ikäsovitetut urokset siirrettiin myöhemmin samaan häkkiin. Kaksi yötä myöhemmin naaraiden hedelmöitetyt vesikkelit dissektoitiin ja genominen DNA vapautettiin pakastamalla-sulattamalla ja sonikoimalla puskurissa, joka sisälsi 10 mM Tris-HCl:ää, 1 mM EDTA:ta ja 25 mM NaCl:a (pH 8,2). Näytteitä inkuboitiin proteinaasi K:lla (0,86 µg µl-1) 15 minuuttia 55 °C:ssa, minkä jälkeen 10 minuuttia 95 °C:ssa. Raa'at genomiset DNA-valmisteet laimennettiin 10-kertaisesti ja niille tehtiin Y-kromosomisekvenssien qPCR-detektio; alukkeet on lueteltu laajennetussa datataulukossa 2. Y-kromosomisekvenssin puuttuminen tarkoittaa, ettei parittelua tapahtunut.
Uudelleenparittelumäärityksiä varten pakkosiititettyjä naaraita tutkittiin parittelutulppien esiintymisen varalta parittelustatuksen varmistamiseksi, ja niiden annettiin kaksi päivää kehittyä kyky paritteluun ilman urosta, kuten aiemmin on kuvattu36. DsRed-transgeenisiä siittiöitä kantavat urokset sijoitettiin sitten naarashäkkeihin. Kaksi yötä myöhemmin hedelmöitysvesikkelit dissektoitiin naaraista, ja genominen DNA valmistettiin edellä kuvatulla tavalla ja sille tehtiin DsRed-transgeenin qPCR-määritys; alukkeet on lueteltu laajennetussa datataulukossa 2. DsRed-transgeenin puuttuminen osoitti, ettei uudelleenparittelua tapahtunut.
3D20E syntetisoitiin aiemmin kuvatulla tavalla37. Lyhyesti sanottuna 10 mg 20E:tä (Sigma-Aldrich) liuotettiin 10 ml:aan vettä, minkä jälkeen lisättiin 30 mg platinamustaa (jauheena, Sigma-Aldrich). Reaktioseokseen kuplitettiin jatkuvasti varovainen O2-virtaus, ja sitä sekoitettiin huoneenlämmössä. Kuuden tunnin kuluttua lisättiin 30 ml metanolia reaktion pysäyttämiseksi. Seos sentrifugoitiin katalyyttihiukkasten poistamiseksi. Supernatantti haihdutettiin kuiviin tyhjiössä huoneenlämmössä. Kuivattu reaktiotuote liuotettiin 10-prosenttiseen etanoliin ja metanoliin HPLC-MS/MS-analyysiä varten injektiota varten. Konversioaste (20E:stä 3D20E:ksi) oli noin 97 % (kuva 4b), ja syntetisoidun 3D20E:n MS-spektri vastasi pariteltujen naaraiden spektriä (kuva 4c).
Selite sisältää tarkempia tietoja suoritetuista tilastollisista testeistä. GraphPadilla (versio 9.0) suoritettiin Fisherin tarkka testi, Mantel-Cox-testi ja Studentin t-testi. Cochran-Mantel-Haenszel-testit suoritettiin käyttämällä mukautettua R-skriptiä (saatavilla osoitteesta https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Datajakauman normaalijakauma testattiin Shapiro-Wilk-testillä, jonka merkitsevyyskynnys oli 0,05. Kun data ei läpäissyt normaalijakaumatestiä, suoritettiin Mann-Whitney-testi. Eloonjäämistiedot analysoitiin Mantel-Cox-testillä. DESeq2-pakettia (versio 1.28.1) käytettiin RNA-sekvensoinnin geenitason differentiaalisen ilmentymisen analyysiin. Kaavion vaakasuora palkki edustaa mediaania. Merkitsevyysarvoa P = 0,05 käytettiin kynnysarvona kaikissa testeissä.
Lisätietoja tutkimusasetelmasta on tässä artikkelissa linkitetyssä Nature Research Report -abstraktissa.
MS-proteomiikkatiedot talletettiin ProteomeXchange Consortiumiin (//proteomecentral.proteomexchange.org) PRIDE-kumppaniarkiston (//www.ebi.ac.uk/pride/) kautta aineistotunnuksella PXD032157.
RNA-sekvensointiaineisto on talletettu Gene Expression Comprehensive Libraryyn (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) sarjanumerolla GSE198665.
Lisätietoja tämän tutkimuksen aikana tuotetuista ja/tai analysoiduista aineistoista voi saada vastaavilta kirjoittajilta kohtuullisesta pyynnöstä. Tämä artikkeli tarjoaa lähdetiedot.
De Loof, A. Ekdysteroidit: Laiminlyötyjä hyönteisten sukupuolisteroideja? Mies: Black Box. Insect Science. 13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hydroksiekdysoni ja munasarjojen kehitys Anopheles stephensissä. J. Insect Physiology. 28, 97–109 (1982).