Propionihappo (PPA), sienilääke ja yleinen ravintolisä, on osoitettu aiheuttavan hiirillä epänormaalia neurologista kehitystä, johon liittyy ruoansulatuskanavan toimintahäiriöitä, jotka voivat johtua suoliston dysbioosista. Yhteys ruokavalion PPA-altistuksen ja suoliston mikrobiston dysbioosin välillä on ehdotettu, mutta sitä ei ole tutkittu suoraan. Tässä tutkimuksessa tutkimme PPA:han liittyviä muutoksia suoliston mikrobiston koostumuksessa, jotka voivat johtaa dysbioosiin. Käsittelemättömällä ruokavaliolla (n=9) ja PPA:lla rikastetulla ruokavaliolla (n=13) ruokittujen hiirten suoliston mikrobiomit sekvensoitiin käyttämällä pitkän kantaman metagenomisekvensointia mikrobikoostumuksen ja bakteerien aineenvaihduntareittien erojen arvioimiseksi. Ravinnon PPA liittyi merkittävien taksonien, mukaan lukien useiden Bacteroides-, Prevotella- ja Ruminococcus-lajien, runsauden lisääntymiseen, joiden jäseniä on aiemmin yhdistetty PPA:n tuotantoon. PPA:lle altistuneiden hiirten mikrobiomeilla oli myös enemmän lipidiaineenvaihduntaan ja steroidihormonien biosynteesiin liittyviä reittejä. Tuloksemme osoittavat, että PPA voi muuttaa suoliston mikrobistoa ja siihen liittyviä aineenvaihduntareittejä. Nämä havaitut muutokset korostavat sitä, että turvalliseksi luokitellut säilöntäaineet voivat vaikuttaa suoliston mikrobiston koostumukseen ja sitä kautta ihmisten terveyteen. Näistä valitaan P, G tai S analysoitavan luokittelutason mukaan. Väärien positiivisten luokitusten vaikutuksen minimoimiseksi käytettiin suhteellisen runsauden vähimmäiskynnystä 1e-4 (1/10 000 lukukertaa). Ennen tilastollista analyysia Brackenin raportoimat suhteelliset runsaudet (fraction_total_reads) muunnettiin käyttämällä keskitettyä log-ratio (CLR) -muunnosta (Aitchison, 1982). CLR-menetelmä valittiin datamuunnokseen, koska se on mittakaavainvariantti ja riittävä ei-harville datajoukoille (Gloor et al., 2017). CLR-muunnos käyttää luonnollista logaritmia. Brackenin raportoimat laskentatiedot normalisoitiin käyttämällä suhteellista logaritmilauseketta (RLE) (Anders ja Huber, 2010). Kuviot luotiin käyttämällä matplotlib v. 3.7.1:n, seaborn v. 3.7.2:n ja peräkkäisten logaritmien yhdistelmää (Gloor et al., 2017). 0.12.2 ja stantanotations v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). Bacillus/Bacteroidetes-suhde laskettiin kullekin näytteelle normalisoitujen bakteerimäärien avulla. Taulukoissa ilmoitetut arvot on pyöristetty neljän desimaalin tarkkuudella. Simpsonin monimuotoisuusindeksi laskettiin käyttämällä KrakenTools v. 1.2 -paketissa (Lu et al., 2022) olevaa alpha_diversity.py-skriptiä. Bracken-raportti on saatavilla skriptissä ja Simpsonin indeksi ”Si” on ilmoitettu -an-parametrille. Merkittävät runsauserot määriteltiin keskimääräisiksi CLR-eroiksi ≥ 1 tai ≤ -1. Keskimääräinen CLR-ero ±1 osoittaa näytetyypin runsauden 2,7-kertaista kasvua. Etumerkki (+/-) osoittaa, onko taksonia runsaampi PPA-näytteessä ja kontrollinäytteessä. Merkitsevyys määritettiin Mann-Whitney U -testillä (Virtanen et al., 2020). Käytettiin Statsmodels v. 0.14 -ohjelmaa (Benjamini ja Hochberg, 1995; Seabold ja Perktold, 2010), ja Benjamini-Hochbergin menetelmää sovellettiin moninkertaisen testauksen korjaamiseen. Tilastollisen merkitsevyyden määrittämisen kynnysarvona käytettiin oikaistua p-arvoa ≤ 0,05.
Ihmisen mikrobiomia kutsutaan usein "kehon viimeiseksi elimeksi", ja sillä on elintärkeä rooli ihmisen terveydessä (Baquero ja Nombela, 2012). Erityisesti suoliston mikrobiomi tunnetaan koko järjestelmän laajuisesta vaikutuksestaan ja roolistaan monissa tärkeissä toiminnoissa. Kommensaalibakteereja on runsaasti suolistossa, ja ne valtaavat useita ekologisia lokeroita, hyödyntävät ravinteita ja kilpailevat mahdollisten taudinaiheuttajien kanssa (Jandhyala et al., 2015). Suoliston mikrobioman monimuotoiset bakteerikomponentit pystyvät tuottamaan välttämättömiä ravintoaineita, kuten vitamiineja, ja edistämään ruoansulatusta (Rowland et al., 2018). Bakteerien metaboliittien on myös osoitettu vaikuttavan kudosten kehitykseen ja tehostavan aineenvaihdunta- ja immuunireittejä (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). Ihmisen suoliston mikrobiomin koostumus on erittäin monimuotoinen ja riippuu geneettisistä ja ympäristötekijöistä, kuten ruokavaliosta, sukupuolesta, lääkityksestä ja terveydentilasta (Kumbhare et al., 2019).
Äidin ruokavalio on kriittinen osa sikiön ja vastasyntyneen kehitystä ja oletettu lähde yhdisteille, jotka saattavat vaikuttaa kehitykseen (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Yksi tällainen kiinnostava yhdiste on propionihappo (PPA), lyhytketjuinen rasvahappo, bakteerikäymisen sivutuote ja elintarvikelisäaine (den Besten et al., 2013). PPA:lla on antibakteerisia ja antifungaalisia ominaisuuksia, ja siksi sitä käytetään elintarvikkeiden säilöntäaineena ja teollisissa sovelluksissa homeen ja bakteerien kasvun estämiseksi (Wemmenhove et al., 2016). PPA:lla on erilaisia vaikutuksia eri kudoksissa. Maksassa PPA:lla on tulehdusta estäviä vaikutuksia vaikuttamalla sytokiinien ilmentymiseen makrofageissa (Kawasoe et al., 2022). Tätä säätelyvaikutusta on havaittu myös muissa immuunisoluissa, mikä johtaa tulehduksen vähentymiseen (Haase et al., 2021). Aivoissa on kuitenkin havaittu päinvastainen vaikutus. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että PPA-altistus aiheuttaa autismin kaltaista käyttäytymistä hiirillä (El-Ansary et al., 2012). Muut tutkimukset ovat osoittaneet, että PPA voi indusoida glioosia ja aktivoida tulehdusta edistäviä reittejä aivoissa (Abdelli ym., 2019). Koska PPA on heikko happo, se voi diffundoitua suoliston epiteelin läpi verenkiertoon ja siten ylittää rajoittavia esteitä, kuten veri-aivoesteen ja istukan (Stinson ym., 2019), mikä korostaa PPA:n merkitystä bakteerien tuottamana säätelevänä metaboliittina. Vaikka PPA:n mahdollista roolia autismin riskitekijänä tutkitaan parhaillaan, sen vaikutukset autistisiin henkilöihin saattavat ulottua hermoston erilaistumisen indusointia pidemmälle.
Ruoansulatuskanavan oireet, kuten ripuli ja ummetus, ovat yleisiä neurologisista kehityshäiriöistä kärsivillä potilailla (Cao et al., 2021). Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että autismin kirjon häiriöistä (ASD) kärsivien potilaiden mikrobiomi eroaa terveiden yksilöiden mikrobiomista, mikä viittaa suoliston mikrobiston dysbioosin esiintymiseen (Finegold et al., 2010). Vastaavasti tulehduksellisia suolistosairauksia, lihavuutta, Alzheimerin tautia jne. sairastavien potilaiden mikrobiomin ominaisuudet eroavat myös terveiden yksilöiden mikrobiomin ominaisuuksista (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Tähän mennessä ei kuitenkaan ole vahvistettu syy-yhteyttä suoliston mikrobiomin ja neurologisten sairauksien tai oireiden välillä (Yap et al., 2021), vaikka useiden bakteerilajien uskotaan olevan osallisina joissakin näistä sairaustiloista. Esimerkiksi Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio ja muita sukuja esiintyy runsaammin autismipotilaiden mikrobistossa (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Merkillepantavaa on, että joidenkin näiden sukujen jäsenlajeilla tiedetään olevan PPA:n tuotantoon liittyviä geenejä (Reichardt et al., 2014; Yun ja Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur ja Dürre, 2023). Ottaen huomioon PPA:n antimikrobiset ominaisuudet, sen runsauden lisääminen voi olla hyödyllistä PPA:ta tuottavien bakteerien kasvulle (Jacobson et al., 2018). Siten PFA-rikas ympäristö voi johtaa muutoksiin suoliston mikrobistossa, mukaan lukien ruoansulatuskanavan patogeenit, jotka voivat olla mahdollisia tekijöitä, jotka johtavat ruoansulatuskanavan oireisiin.
Keskeinen kysymys mikrobiomitutkimuksessa on, ovatko mikrobikoostumuksen erot taustalla olevien sairauksien syy vai oire. Ensimmäinen askel ruokavalion, suoliston mikrobiomin ja neurologisten sairauksien välisen monimutkaisen suhteen selvittämiseksi on arvioida ruokavalion vaikutuksia mikrobikoostumukseen. Tätä varten käytimme pitkäkestoista metagenomisekvensointia vertaillaksemme PPA-rikkaalla tai PPA-köyhällä ruokavaliolla ruokittujen hiirten jälkeläisten suolistomikrobiomeja. Jälkeläisille syötettiin samaa ruokavaliota kuin emoilleen. Oletimme, että PPA-rikas ruokavalio johtaisi muutoksiin suoliston mikrobikoostumuksessa ja mikrobien toimintareiteissä, erityisesti PPA-aineenvaihduntaan ja/tai PPA-tuotantoon liittyvissä reiteissä.
Tässä tutkimuksessa käytettiin FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J-transgeenisiä hiiriä (Jackson Laboratories), jotka yliekspressoivat vihreää fluoresoivaa proteiinia (GFP) gliasoluspesifisen GFAP-promoottorin säätelemänä Keski-Floridan yliopiston eläintenhoito- ja käyttökomitean (UCF-IACUC) ohjeiden mukaisesti (eläinten käyttöluvan numero: PROTO202000002). Vieroituksen jälkeen hiiret pidettiin yksittäin häkeissä, joissa oli 1–5 hiirtä kumpaakin sukupuolta häkkiä kohden. Hiiriä ruokittiin vapaasti joko puhdistetulla kontrolliruokavaliolla (modifioitu avoin standardiruokavalio, 16 kcal% rasvaa) tai natriumpropionaatilla täydennetyllä ruokavaliolla (modifioitu avoin standardiruokavalio, 16 kcal% rasvaa, joka sisälsi 5 000 ppm natriumpropionaattia). Käytetty natriumpropionaatin määrä vastasi 5 000 mg PFA:ta/kg ruoan kokonaispainoa. Tämä on korkein elintarvikkeiden säilöntäaineena käytettäväksi hyväksytty PPA-pitoisuus. Tätä tutkimusta varten emohiirille annettiin molempia ruokavalioita neljä viikkoa ennen parittelua ja sitä jatkettiin koko emon tiineyden ajan. Jälkeläishiiret [22 hiirtä, 9 kontrollihiirtä (6 urosta, 3 naarasta) ja 13 PPA-hiirtä (4 urosta, 9 naarasta)] vieroitettiin ja jatkettiin sitten samalla ruokavaliolla kuin emot viiden kuukauden ajan. Jälkeläishiiret lopetettiin viiden kuukauden iässä ja niiden suoliston uloste kerättiin ja säilytettiin aluksi 1,5 ml:n mikrosentrifugiputkissa -20 °C:ssa ja siirrettiin sitten -80 °C:n pakastimeen, kunnes isäntä-DNA oli ehtynyt ja mikrobien nukleiinihapot uutettu.
Isännän DNA poistettiin muunnellun protokollan mukaisesti (Charalampous et al., 2019). Lyhyesti sanottuna uloste siirrettiin 500 µl:aan InhibitEX-liuosta (Qiagen, tuotenumero/tunnus: 19593) ja säilytettiin pakastettuna. Käsittele enintään 1–2 ulostepellettiä uuttoa kohden. Uloste homogenisoitiin sitten mekaanisesti käyttämällä putken sisällä olevaa muovista survinta lietteen muodostamiseksi. Sentrifugoi näytteitä 10 000 RCF:n voimalla 5 minuuttia tai kunnes näytteet ovat pelletoituneet, ime sitten supernatantti pois ja suspendoi pelletti uudelleen 250 µl:aan 1× PBS:ää. Lisää näytteeseen 250 µl 4,4 % saponiiniliuosta (TCI, tuotenumero S0019) pesuaineeksi eukaryoottisolujen kalvojen irrottamiseksi. Näytteitä sekoitettiin varovasti, kunnes seos oli tasaista, ja inkuboitiin huoneenlämmössä 10 minuuttia. Seuraavaksi eukaryoottisolujen hajottamiseksi näytteeseen lisättiin 350 μl nukleaasitonta vettä, inkuboitiin 30 sekuntia ja sitten lisättiin 12 μl 5 M NaCl:a. Näytteet sentrifugoitiin sitten 6000 RCF:n voimalla 5 minuuttia. Supernatantti imettiin pois ja pelletti suspendoitiin uudelleen 100 μl:aan 1X PBS:ää. Isännän DNA:n poistamiseksi lisätään 100 μl HL-SAN-puskuria (12,8568 g NaCl:a, 4 ml 1 M MgCl2:a, 36 ml nukleaasitonta vettä) ja 10 μl HL-SAN-entsyymiä (ArticZymes P/N 70910-202). Näytteet sekoitettiin huolellisesti pipetoimalla ja inkuboitiin 37 °C:ssa 30 minuuttia nopeudella 800 rpm Eppendorf™ ThermoMixer C -laitteella. Inkuboinnin jälkeen sentrifugoitiin nopeudella 6000 RCF 3 minuutin ajan ja pestiin kahdesti 800 µl:lla ja 1000 µl:lla 1X PBS:ää. Lopuksi pelletti suspendoitiin uudelleen 100 µl:aan 1X PBS:ää.
Bakteerien kokonais-DNA eristettiin käyttämällä New England Biolabs Monarch Genomic DNA Purification Kit -pakkausta (New England Biolabs, Ipswich, MA, tuotenumero T3010L). Pakkauksen mukana toimitettua vakiotoimintamenettelyä on hieman muunnettu. Inkuboi ja pidä nukleaasitonta vettä 60 °C:ssa ennen käyttöä lopullista eluointia varten. Lisää jokaiseen näytteeseen 10 µl proteinaasi K:ta ja 3 µl RNase A:ta. Lisää sitten 100 µl solulyysipuskuria ja sekoita varovasti. Näytteitä inkuboitiin sitten Eppendorf™ ThermoMixer C -laitteessa 56 °C:ssa ja 1400 rpm:n nopeudella vähintään 1 tunnin ja enintään 3 tunnin ajan. Inkuboituja näytteitä sentrifugoitiin nopeudella 12 000 RCF 3 minuuttia, ja kunkin näytteen supernatantti siirrettiin erilliseen 1,5 ml:n mikrosentrifugiputkeen, joka sisälsi 400 µl sitoutumisliuosta. Putkia pulssisekoitettiin vorteksissa 5–10 sekuntia 1 sekunnin välein. Siirrä kunkin näytteen koko nestesisältö (noin 600–700 µl) suodatinpatruunaan, joka on asetettu läpivirtauskeräysputkeen. Putkia sentrifugoitiin 1 000 RCF:n voimalla 3 minuuttia DNA:n alkusitoutumisen mahdollistamiseksi ja sitten sentrifugoitiin 12 000 RCF:n voimalla 1 minuutin ajan jäännösnesteen poistamiseksi. Näytekolonni siirrettiin uuteen keräysputkeen ja pestiin sitten kahdesti. Ensimmäistä pesua varten lisää 500 µl pesupuskuria jokaiseen putkeen. Käännä putki ylösalaisin 3–5 kertaa ja sentrifugoi sitten 12 000 RCF:n voimalla 1 minuutin ajan. Hävitä neste keräysputkesta ja aseta suodatinpatruuna takaisin samaan keräysputkeen. Toista pesua varten lisää 500 µl pesupuskuria suodattimeen kääntämättä sitä ylösalaisin. Näytteitä sentrifugoitiin 12 000 RCF:n voimalla 1 minuutin ajan. Siirrä suodatin 1,5 ml:n LoBind®-putkeen ja lisää 100 µl esilämmitettyä nukleaasitonta vettä. Suodattimia inkuboitiin huoneenlämmössä 1 minuutin ajan ja sentrifugoitiin sitten 12 000 RCF:n voimalla 1 minuutin ajan. Eluoitua DNA:ta säilytettiin -80 °C:ssa.
DNA-pitoisuus kvantifioitiin Qubit™ 4.0 -fluorometrillä. DNA valmistettiin Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity Kit -pakkauksella (tuotenro Q33231) valmistajan ohjeiden mukaisesti. DNA-fragmenttien pituusjakauma mitattiin Aglient™ 4150- tai 4200 TapeStation -laitteella. DNA valmistettiin Agilent™ Genomic DNA -reagensseilla (tuotenro 5067-5366) ja Genomic DNA ScreenTape -screenTape-laitteella (tuotenro 5067-5365). Kirjaston valmistelu suoritettiin Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit -pakkauksella (SQK-RPB004) valmistajan ohjeiden mukaisesti. DNA sekvensoitiin ONT GridION™ Mk1 -sekvensserillä ja Min106D-virtauskennolla (R 9.4.1). Sekvensointiasetukset olivat: korkea tarkkuus emäksen tunnistamisessa, vähintään q-arvo 9, viivakoodin asettaminen ja viivakoodin leikkaus. Näytteitä sekvensoitiin 72 tuntia, minkä jälkeen emästunnistustiedot lähetettiin jatkokäsittelyä ja -analyysia varten.
Bioinformatiikan prosessointi suoritettiin aiemmin kuvatuilla menetelmillä (Greenman et al., 2024). Sekvensoinnista saadut FASTQ-tiedostot jaettiin hakemistoihin kullekin näytteelle. Ennen bioinformatiikan analyysia tiedot käsiteltiin seuraavalla prosessilla: ensin näytteiden FASTQ-tiedostot yhdistettiin yhdeksi FASTQ-tiedostoksi. Sitten alle 1000 bp:n lukemat suodatettiin Filtlong v. 0.2.1 -ohjelmalla, jossa ainoa muutettu parametri oli –min_length 1000 (Wick, 2024). Ennen lisäsuodatusta lukulaatua kontrolloitiin NanoPlot v. 1.41.3 -ohjelmalla seuraavilla parametreilla: –fastq –plots dot –N50 -o
Taksonomista luokittelua varten luetut ja kootut kontigit luokiteltiin Kraken2 v. 2.1.2:lla (Wood et al., 2019). Luo raportteja ja tulostetiedostoja luetuille ja kokoonpanoille vastaavasti. Käytä –use-names-vaihtoehtoa analysoidaksesi lukemia ja kokoonpanoja. –gzip-compressed- ja –paired-vaihtoehdot on määritetty luetuille segmenteille. Taksonien suhteellinen runsaus metagenomeissa arvioitiin Bracken v. 2.8:lla (Lu et al., 2017). Ensin loimme 1000 emästä sisältävän kmer-tietokannan käyttämällä bracken-build-komentoa seuraavilla parametreilla: -d
Geeniannotaatio ja suhteellisen runsauden arviointi tehtiin käyttämällä Maranga et al.:n kuvaaman protokollan muunneltua versiota (Maranga et al., 2023). Ensin alle 500 bp:n pituiset kontigit poistettiin kaikista kokoonpanoista käyttämällä SeqKit v. 2.5.1:tä (Shen et al., 2016). Valitut kokoonpanot yhdistettiin sitten pan-metagenomiksi. Avoimet lukukehykset (ORF) tunnistettiin käyttämällä Prodigal v. 1.0.1:tä (Prodigal v. 2.6.3:n rinnakkaisversio) seuraavilla parametreilla: -d
Geenit ryhmiteltiin ensin eggNOG:n antamien Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) -ortologi (KO) -tunnisteiden mukaisesti geenireittien runsauden vertailemiseksi. Geenit, joissa ei ollut knockout-geeniä tai joissa oli useita knockout-geeniä, poistettiin ennen analyysia. Kunkin knockout-geenin keskimääräinen runsaus näytettä kohden laskettiin ja suoritettiin tilastollinen analyysi. PPA-metaboliageenit määriteltiin geeneiksi, joille annettiin rivi ko00640 KEGG_Pathway-sarakkeessa, mikä osoittaa roolin propionaattimetaboliassa KEGG:n mukaan. PPA-tuotantoon liittyviksi tunnistetut geenit on lueteltu lisätaulukossa 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Permutaatiotestejä tehtiin PPA-metabolia- ja tuotantogeenien tunnistamiseksi, joita oli merkittävästi enemmän kussakin näytetyypissä. Jokaiselle analysoidulle geenille tehtiin tuhat permutaatiota. Tilastollisen merkitsevyyden määrittämiseksi käytettiin p-arvoa 0,05. Klusterin yksittäisille geeneille annettiin toiminnalliset merkinnät klusterin edustavien geenien merkintöjen perusteella. PPA-aineenvaihduntaan ja/tai PPA-tuotantoon liittyvät taksonit voitiin tunnistaa yhdistämällä Kraken2-tulostiedostojen kontig-ID:t samoihin kontig-ID:ihin, jotka säilytettiin funktionaalisen annotoinnin aikana eggNOG:ia käyttäen. Merkitsevyystestaus suoritettiin käyttämällä aiemmin kuvattua Mann-Whitney U -testiä. Useiden testien korjaus suoritettiin käyttämällä Benjamini-Hochbergin menetelmää. Tilastollisen merkitsevyyden määrittämiseksi käytettiin raja-arvona p-arvoa ≤ 0,05.
Hiirien suolistomikrobiomin monimuotoisuutta arvioitiin Simpsonin monimuotoisuusindeksillä. Kontrolli- ja PPA-näytteiden välillä ei havaittu merkittäviä eroja suvun ja lajin monimuotoisuuden suhteen (suvun p-arvo: 0,18, lajin p-arvo: 0,16) (kuva 1). Mikrobikoostumusta verrattiin sitten pääkomponenttianalyysillä (PCA). Kuva 2 esittää näytteiden ryhmittymistä niiden pääjaksojen mukaan, mikä osoittaa, että mikrobiomien lajikoostumuksessa oli eroja PPA- ja kontrollinäytteiden välillä. Tämä ryhmittymä oli vähemmän selvä suvutasolla, mikä viittaa siihen, että PPA vaikuttaa tiettyihin bakteereihin (lisäkuva 1).
Kuva 1. Sukujen alfadiversiteetti ja hiiren suolistomikrobiomin lajikoostumus. Laatikkodiagrammit, jotka esittävät sukujen (A) ja lajien (B) Simpsonin monimuotoisuusindeksejä PPA- ja kontrollinäytteissä. Merkitsevyys määritettiin Mann-Whitney U -testillä ja moninkertaiset korjaukset tehtiin Benjamini-Hochbergin menetelmällä. ns, p-arvo ei ollut merkitsevä (p>0,05).
Kuva 2. Hiiren suoliston mikrobiomin koostumuksen pääkomponenttianalyysin tulokset lajitasolla. Pääkomponenttianalyysin kuvaaja näyttää näytteiden jakautumisen kahden ensimmäisen pääkomponentin kesken. Värit osoittavat näytetyypin: PPA:lle altistuneet hiiret ovat violetteja ja kontrollihiiret keltaisia. Pääkomponentit 1 ja 2 on piirretty x-akselille ja y-akselille, ja ne ilmaistaan selitettynä varianssisuhteena.
RLE-muunnettuja laskentatietoja käyttäen havaittiin merkittävä Bacteroidetes/Basills-suhteen mediaaniarvon lasku kontrolli- ja PPA-hiirillä (kontrolli: 9,66, PPA: 3,02; p-arvo = 0,0011). Tämä ero johtui Bacteroidetes-bakteerien suuremmasta määrästä PPA-hiirillä verrattuna kontrolliryhmään, vaikka ero ei ollutkaan merkitsevä (kontrollin keskimääräinen CLR: 5,51, PPA:n keskimääräinen CLR: 6,62; p-arvo = 0,054), kun taas Bacteroidetes-bakteerien määrä oli samanlainen (kontrollin keskimääräinen CLR: 7,76, PPA:n keskimääräinen CLR: 7,60; p-arvo = 0,18).
Suoliston mikrobiomin taksonomisten jäsenten runsauden analyysi paljasti, että yksi pääjakso ja 77 lajia erosivat merkittävästi PPA- ja kontrollinäytteiden välillä (lisätaulukko 2). PPA-näytteissä 59 lajin runsaus oli merkittävästi suurempi kuin kontrollinäytteissä, kun taas vain 16 lajin runsaus kontrollinäytteissä oli suurempi kuin PPA-näytteissä (kuva 3).
Kuva 3. Taksonien erilainen runsaus PPA- ja kontrollihiirten suolistomikrobiomissa. Tulivuorikuviot näyttävät sukujen (A) tai lajien (B) runsauserot PPA- ja kontrollinäytteiden välillä. Harmaat pisteet osoittavat, ettei taksonien runsaudessa ole merkittävää eroa. Värilliset pisteet osoittavat merkittäviä eroja runsaudessa (p-arvo ≤ 0,05). Punaisella ja vaaleansinisellä (kontrolli- ja PPA-näytteet) on esitetty 20 suurinta taksonia, joilla on suurimmat runsauserot näytetyyppien välillä. Keltaiset ja violetit pisteet olivat vähintään 2,7 kertaa runsaampia kontrolli- tai PPA-näytteissä kuin kontrolleissa. Mustat pisteet edustavat taksoneita, joilla on merkitsevästi erilaiset runsauserot, keskimääräisten CLR-erojen ollessa -1 ja 1. P-arvot laskettiin Mann-Whitney U -testillä ja korjattiin monitestien varalta Benjamini-Hochberg-menetelmällä. Lihavoidut keskimääräiset CLR-erot osoittavat merkittäviä eroja runsaudessa.
Analysoituamme suoliston mikrobikoostumuksen teimme mikrobiomille funktionaalisen annotaation. Suodatettuamme pois heikkolaatuiset geenit, kaikista näytteistä tunnistettiin yhteensä 378 355 ainutlaatuista geeniä. Näiden geenien transformoitua runsautta käytettiin pääkomponenttianalyysiin (PCA), ja tulokset osoittivat näytetyyppien korkeaa klusterointiastetta niiden funktionaalisten profiilien perusteella (kuva 4).
Kuva 4. PCA-tulokset käyttäen hiiren suolistomikrobiomin toiminnallista profiilia. PCA-käyrä näyttää näytteiden jakautumisen niiden kahden ensimmäisen pääkomponentin kesken. Värit osoittavat näytetyypin: PPA:lle altistuneet hiiret ovat violetteja ja kontrollihiiret keltaisia. Pääkomponentit 1 ja 2 on piirretty x-akselille ja y-akselille, ja ne ilmaistaan selitetyn varianssin suhteena.
Seuraavaksi tutkimme KEGG-geenien runsautta eri näytetyypeissä. Yhteensä 3648 ainutlaatuista geeniä tunnistettiin, joista 196 oli merkittävästi runsaampi kontrollinäytteissä ja 106 oli runsaampi PPA-näytteissä (kuva 5). Kontrollinäytteissä havaittiin yhteensä 145 geeniä ja PPA-näytteissä 61 geeniä, joiden runsaudet vaihtelivat merkittävästi. Lipidi- ja aminosokeriaineenvaihduntaan liittyvät reitit olivat merkittävästi rikastuneempia PPA-näytteissä (lisätaulukko 3). Typen aineenvaihduntaan ja rikin välitysjärjestelmiin liittyvät reitit olivat merkittävästi rikastuneempia kontrollinäytteissä (lisätaulukko 3). Aminosokeri-/nukleotidiaineenvaihduntaan (ko:K21279) ja inositolifosfaatin aineenvaihduntaan (ko:K07291) liittyvien geenien runsaus oli merkittävästi suurempi PPA-näytteissä (kuva 5). Kontrollinäytteissä oli merkittävästi enemmän bentsoaattiaineenvaihduntaan (ko:K22270), typen aineenvaihduntaan (ko:K00368) ja glykolyysiin/glukoneogeneesiin (ko:K00131) liittyviä geenejä (kuva 5).
Kuva 5. KO:iden runsauden ero PPA- ja kontrollihiirten suolistomikrobiomissa. Tulivuorikuvio kuvaa funktionaalisten ryhmien (KO:iden) runsauden eroja. Harmaat pisteet osoittavat KO:ita, joiden runsaus ei eronnut tilastollisesti merkitsevästi näytetyyppien välillä (p-arvo > 0,05). Värilliset pisteet osoittavat merkittäviä eroja runsaudessa (p-arvo ≤ 0,05). Punaisella ja vaaleansinisellä on esitetty 20 KO:ta, joiden runsaudessa on suurimmat erot näytetyyppien välillä, jotka vastaavat vastaavasti kontrolli- ja PPA-näytteitä. Keltaiset ja violetit pisteet osoittavat KO:ita, joita oli vähintään 2,7 kertaa enemmän kontrolli- ja PPA-näytteissä. Mustat pisteet osoittavat KO:ita, joiden runsaudet eroavat merkittävästi, keskimääräisten CLR-erojen ollessa -1 ja 1. P-arvot laskettiin Mann-Whitney U -testillä ja oikaistiin useiden vertailujen varalta Benjamini-Hochbergin menetelmällä. NaN osoittaa, että KO ei kuulu mihinkään KEGG:n reittiin. Lihavoidut keskimääräiset CLR-eroarvot osoittavat merkittäviä eroja runsaudessa. Yksityiskohtaisia tietoja reiteistä, joihin luetellut KO:t kuuluvat, on esitetty lisätaulukossa 3.
Annotoitujen geenien joukossa 1601 geenillä oli merkitsevästi erilaisia runsauksia näytetyyppien välillä (p ≤ 0,05), ja jokainen geeni oli vähintään 2,7-kertaisesti runsaampi. Näistä geeneistä 4 geeniä oli runsaampi kontrollinäytteissä ja 1597 geeniä oli runsaampi PPA-näytteissä. Koska PPA:lla on antimikrobisia ominaisuuksia, tutkimme PPA:n aineenvaihduntaan ja tuotantoon liittyvien geenien runsauksia eri näytetyyppien välillä. 1332 PPA:n aineenvaihduntaan liittyvästä geenistä 27 geeniä oli merkitsevästi runsaampi kontrollinäytteissä ja 12 geeniä oli runsaampi PPA-näytteissä. 223 PPA:n tuotantoon liittyvästä geenistä 1 geeni oli merkitsevästi runsaampi PPA-näytteissä. Kuvio 6A osoittaa edelleen PPA:n aineenvaihduntaan osallistuvien geenien suuremman runsauden, merkitsevästi suuremman runsauden kontrollinäytteissä ja suuret vaikutuskoot, kun taas kuvio 6B korostaa yksittäisiä geenejä, joiden runsaus havaittiin merkitsevästi suurempana PPA-näytteissä.
Kuva 6. PPA:han liittyvien geenien erilainen runsaus hiiren suolistomikrobiomissa. Tulivuorikuviot kuvaavat PPA-aineenvaihduntaan (A) ja PPA-tuotantoon (B) liittyvien geenien runsauden eroja. Harmaat pisteet osoittavat geenejä, joiden runsaus ei eronnut merkitsevästi näytetyyppien välillä (p-arvo > 0,05). Värilliset pisteet osoittavat merkittäviä eroja runsaudessa (p-arvo ≤ 0,05). 20 geeniä, joilla on suurimmat runsauserot, on esitetty punaisella ja vaaleansinisenä (kontrolli- ja PPA-näytteet). Keltaisten ja violettien pisteiden runsaus oli vähintään 2,7 kertaa suurempi kontrolli- ja PPA-näytteissä kuin kontrollinäytteissä. Mustat pisteet edustavat geenejä, joilla on merkitsevästi erilaiset runsaudet, keskimääräisten CLR-erojen ollessa -1 ja 1. P-arvot laskettiin Mann-Whitney U -testillä ja korjattiin useiden vertailujen varalta Benjamini-Hochbergin menetelmällä. Geenit vastaavat edustavia geenejä ei-redundanttien geenien luettelossa. Geenien nimet koostuvat KEGG-symbolista, joka tarkoittaa KO-geeniä. Lihavoidut keskimääräiset CLR-erot osoittavat merkitsevästi erilaisia runsauksia. Viiva (-) osoittaa, että geenille ei ole symbolia KEGG-tietokannassa.
Taksonit, joilla on PPA-aineenvaihduntaan ja/tai tuotantoon liittyviä geenejä, tunnistettiin yhdistämällä kontigien taksonominen identiteetti geenin kontigin tunnukseen. Sukutasolla 130 suvulla havaittiin PPA-aineenvaihduntaan liittyviä geenejä ja 61 suvulla PPA-tuotantoon liittyviä geenejä (lisätaulukko 4). Yhdessäkään suvussa ei kuitenkaan havaittu merkittäviä eroja runsaudessa (p > 0,05).
Lajitasolla 144 bakteerilajilla havaittiin PPA-aineenvaihduntaan liittyviä geenejä ja 68 bakteerilajilla PPA-tuotantoon liittyviä geenejä (lisätaulukko 5). PPA:ta metaboloivista bakteerista kahdeksan bakteerin runsaus lisääntyi merkittävästi näytetyyppien välillä, ja kaikkien vaikutuksessa havaittiin merkittäviä muutoksia (lisätaulukko 6). Kaikki tunnistetut PPA-metaboloijat, joiden runsaudessa oli merkittäviä eroja, olivat runsaampia PPA-näytteissä. Lajitason luokittelu paljasti sukujen edustajia, jotka eivät eronneet merkittävästi näytetyyppien välillä, mukaan lukien useita Bacteroides- ja Ruminococcus-lajeja sekä Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus ja Alcaligenes polymorpha. PPA:ta tuottavista bakteereista neljällä bakteerilla havaittiin merkittäviä eroja runsaudessa näytetyyppien välillä. Lajeja, joiden runsaudessa oli merkittäviä eroja, olivat Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis ja Ruminococcus bovis.
Tässä tutkimuksessa tarkastelimme PPA-altistuksen vaikutuksia hiirten suoliston mikrobiotaan. PPA voi aiheuttaa bakteereissa erilaisia vasteita, koska tietyt lajit tuottavat sitä, muut lajit käyttävät sitä ravinnonlähteenä tai sillä on antimikrobisia vaikutuksia. Siksi sen lisääminen suolistoon ravintolisien kautta voi aiheuttaa erilaisia vaikutuksia riippuen toleranssista, alttiudesta ja kyvystä hyödyntää sitä ravinnonlähteenä. Herkät bakteerilajit voidaan eliminoida ja korvata sellaisilla, jotka ovat resistenttejä PPA:lle tai pystyvät hyödyntämään sitä ravinnonlähteenä, mikä johtaa muutoksiin suoliston mikrobiston koostumuksessa. Tuloksemme paljastivat merkittäviä eroja mikrobien koostumuksessa, mutta eivät vaikutusta mikrobien kokonaisdiversiteettiin. Suurimmat vaikutukset havaittiin lajitasolla, ja yli 70 taksonin runsaus erosi merkittävästi PPA- ja kontrollinäytteiden välillä (lisätaulukko 2). PPA:lle altistuneiden näytteiden koostumuksen jatkoarviointi paljasti mikrobilajien suuremman heterogeenisyyden verrattuna altistamattomiin näytteisiin, mikä viittaa siihen, että PPA voi parantaa bakteerien kasvuominaisuuksia ja rajoittaa bakteeripopulaatioita, jotka voivat selviytyä PPA-rikkaissa ympäristöissä. Siten PPA voi selektiivisesti aiheuttaa muutoksia sen sijaan, että aiheuttaisi laajamittaista suoliston mikrobiston monimuotoisuuden häiriintymistä.
Elintarvikkeiden säilöntäaineiden, kuten PPA:n, on aiemmin osoitettu muuttavan suoliston mikrobiomin komponenttien runsautta vaikuttamatta kokonaisdiversiteettiin (Nagpal et al., 2021). Tässä tutkimuksessa havaitsimme silmiinpistävimmät erot Bacteroidetes-lajien välillä Bacteroidetes-pääjakson sisällä (aiemmin tunnettu nimellä Bacteroidetes), jotka rikastuivat merkittävästi PPA:lle altistuneilla hiirillä. Bacteroides-lajien lisääntynyt runsaus liittyy lisääntyneeseen liman hajoamiseen, mikä voi lisätä infektioriskiä ja edistää tulehdusta (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Yhdessä tutkimuksessa havaittiin, että Bacteroides fragilis -valmisteella hoidetut vastasyntyneet uroshiiret osoittivat autismin kirjon häiriötä (ASD) muistuttavia sosiaalisia käyttäytymismalleja (Carmel et al., 2023), ja muut tutkimukset ovat osoittaneet, että Bacteroides-lajit voivat muuttaa immuunitoimintaa ja johtaa autoimmuuniseen tulehdukselliseen kardiomyopatiaan (Gil-Cruz et al., 2019). Myös Ruminococcus-, Prevotella- ja Parabacteroides-sukuihin kuuluvien lajien määrä lisääntyi merkittävästi PPA:lle altistuneilla hiirillä (Coretti et al., 2018). Tietyt Ruminococcus-lajit yhdistetään sairauksiin, kuten Crohnin tautiin, tulehdusta edistävien sytokiinien tuotannon kautta (Henke et al., 2019), kun taas Prevotella-lajit, kuten Prevotella humani, yhdistetään aineenvaihduntasairauksiin, kuten verenpainetautiin ja insuliiniherkkyyteen (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Lopuksi havaitsimme, että Bacteroidetes-lajien (aiemmin Firmicutes) ja Bacteroidetes-lajien suhde oli merkittävästi pienempi PPA:lle altistuneilla hiirillä kuin kontrollihiirillä johtuen Bacteroidetes-lajien suuremmasta kokonaismäärästä. Tämän suhteen on aiemmin osoitettu olevan tärkeä indikaattori suoliston homeostaasille, ja tämän suhteen häiriöitä on yhdistetty useisiin sairaustiloihin (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), mukaan lukien tulehdukselliset suolistosairaudet (Stojanov et al., 2020). Yhteenvetona voidaan todeta, että kohonnut PPA-pitoisuus ruokavaliossa vaikuttaa voimakkaimmin Bacteroidetes-pääjakson lajeihin. Tämä voi johtua korkeammasta PPA:n sietokyvystä tai kyvystä käyttää PPA:ta energianlähteenä, minkä on osoitettu pitävän paikkansa ainakin yhden lajin, Hoylesella enocean, kohdalla (Hitch et al., 2022). Vaihtoehtoisesti äidin PPA-altistus voi edistää sikiönkehitystä tekemällä hiiren jälkeläisten suolistosta alttiimman Bacteroidetes-kolonisaatiolle; tutkimusasetelmamme ei kuitenkaan mahdollistanut tällaista arviointia.
Metagenomiikan arviointi paljasti merkittäviä eroja PPA:n aineenvaihduntaan ja tuotantoon liittyvien geenien runsaudessa. PPA:lle altistuneilla hiirillä oli suurempi määrä PPA:n tuotannosta vastaavia geenejä, kun taas PPA:lle altistumattomilla hiirillä oli suurempi määrä PAA:n aineenvaihdunnasta vastaavia geenejä (kuva 6). Nämä tulokset viittaavat siihen, että PPA:n vaikutus mikrobikoostumukseen ei välttämättä johdu pelkästään sen käytöstä, muuten PPA:n aineenvaihduntaan liittyvien geenien runsauden olisi pitänyt olla suurempi PPA:lle altistuneiden hiirten suolistomikrobiomissa. Yksi selitys on, että PPA välittää bakteerien runsautta ensisijaisesti antimikrobisten vaikutustensa kautta eikä siten, että bakteerit käyttävät sitä ravintoaineena. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että PPA estää Salmonella Typhimuriumin kasvua annoksesta riippuvalla tavalla (Jacobson et al., 2018). Altistuminen suuremmille PPA-pitoisuuksille voi valikoida bakteereja, jotka ovat resistenttejä sen antimikrobisille ominaisuuksille eivätkä välttämättä pysty metaboloimaan tai tuottamaan sitä. Esimerkiksi useilla Parabacteroides-lajeilla havaittiin merkittävästi suurempi määrä PPA-näytteissä, mutta PPA:n aineenvaihduntaan tai tuotantoon liittyviä geenejä ei havaittu (lisätaulukot 2, 4 ja 5). Lisäksi PPA:n tuotanto käymisen sivutuotteena on laajalti levinnyt useiden bakteerien kesken (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Suurempi bakteerien monimuotoisuus voi olla syynä PPA-aineenvaihduntaan liittyvien geenien suurempaan runsauteen kontrollinäytteissä (Averina et al., 2020). Lisäksi vain 27:n (2,14 %) 1332 geenistä ennustettiin olevan geenejä, jotka liittyvät yksinomaan PPA-aineenvaihduntaan. Monet PPA-aineenvaihduntaan liittyvät geenit ovat mukana myös muissa aineenvaihduntareiteissä. Tämä osoittaa edelleen, että PPA-aineenvaihduntaan osallistuvien geenien runsaus oli suurempi kontrollinäytteissä; nämä geenit voivat toimia reiteillä, jotka eivät johda PPA:n käyttöön tai muodostumiseen sivutuotteena. Tässä tapauksessa vain yksi PPA:n muodostumiseen liittyvä geeni osoitti merkittäviä eroja runsaudessa näytetyyppien välillä. Toisin kuin PPA-aineenvaihduntaan liittyvät geenit, PPA-tuotantoon liittyvät markkerigeenit valittiin, koska ne osallistuvat suoraan bakteerien PPA-tuotantoreittiin. PPA:lle altistetuilla hiirillä kaikilla lajeilla havaittiin merkittävästi lisääntynyt PPA:n määrä ja tuotantokapasiteetti. Tämä tukee ennustetta, että PPA:t valikoisivat PPA-tuottajia ja siten ennustaisivat PPA:n tuotantokapasiteetin kasvua. Geenien runsaus ei kuitenkaan välttämättä korreloi geenien ilmentymisen kanssa; näin ollen, vaikka PPA-aineenvaihduntaan liittyvien geenien määrä on suurempi kontrollinäytteissä, ilmentymisnopeus voi olla erilainen (Shi et al., 2014). PPA:ta tuottavien geenien esiintyvyyden ja PPA-tuotannon välisen suhteen vahvistamiseksi tarvitaan tutkimuksia PPA-tuotantoon osallistuvien geenien ilmentymisestä.
PPA- ja kontrollimetagenomien toiminnallinen annotointi paljasti joitakin eroja. Geenisisällön PCA-analyysi paljasti erillisiä klustereita PPA- ja kontrollinäytteiden välillä (kuva 5). Näytteiden sisäinen klusterointi paljasti, että kontrolligeenien sisältö oli monimuotoisempaa, kun taas PPA-näytteet ryhmittyivät yhteen. Geenisisällön mukainen klusterointi oli verrattavissa lajikoostumuksen mukaiseen klusterointiin. Siten reittien runsauden erot ovat yhdenmukaisia tiettyjen lajien ja kantojen runsauden muutosten kanssa niiden sisällä. PPA-näytteissä kaksi merkittävästi runsaampaa reittiä liittyivät aminosokeri-/nukleotidisokerimetaboliaan (ko:K21279) ja useisiin lipidimetaboliareitteihin (ko:K00647, ko:K03801; lisätaulukko 3). ko:K21279:ään liittyvien geenien tiedetään liittyvän Bacteroides-sukuun, joka on yksi suvuista, joissa on merkittävästi enemmän lajeja PPA-näytteissä. Tämä entsyymi voi välttää immuunivasteen ilmentämällä kapselin polysakkarideja (Wang et al., 2008). Tämä voi selittää PPA:lle altistuneilla hiirillä havaitun Bacteroidetes-bakteerien lisääntymisen. Tämä täydentää PPA-mikrobiomissa havaittua lisääntynyttä rasvahapposynteesiä. Bakteerit käyttävät FASIIko:K00647 (fabB) -reittiä rasvahappojen tuottamiseen, jotka voivat vaikuttaa isännän aineenvaihduntareitteihin (Yao ja Rock, 2015; Johnson et al., 2020), ja lipidiaineenvaihdunnan muutokset voivat olla osallisena neurologisessa kehityksessä (Yu et al., 2020). Toinen reitti, joka osoitti lisääntynyttä runsautta PPA-näytteissä, oli steroidihormonien biosynteesi (ko:K12343). On yhä enemmän todisteita siitä, että suoliston mikrobiotan kyvyn vaikuttaa hormonitasoihin ja hormonien vaikutuksen välillä on käänteinen suhde, joten kohonneilla steroiditasoilla voi olla terveysvaikutuksia (Tetel et al., 2018).
Tässä tutkimuksessa on rajoituksia ja huomioitavia asioita. Tärkeä ero on, ettemme tehneet eläinten fysiologisia arviointeja. Siksi ei ole mahdollista päätellä suoraan, liittyvätkö mikrobiomin muutokset mihinkään sairauteen. Toinen huomioitava seikka on, että tässä tutkimuksessa hiiriä ruokittiin samalla ruokavaliolla kuin niiden emoja. Tulevaisuudessa voidaan mahdollisesti selvittää, parantaako siirtyminen PPA-rikkaasta ruokavaliosta PPA-vapaaseen ruokavalioon sen vaikutuksia mikrobiomiin. Yksi tutkimuksemme rajoituksista, kuten monien muidenkin, on rajallinen otoskoko. Vaikka päteviä johtopäätöksiä voidaan tehdä, suurempi otoskoko antaisi suuremman tilastollisen voiman tuloksia analysoitaessa. Olemme myös varovaisia tehdessämme johtopäätöksiä suoliston mikrobiomin muutosten ja minkä tahansa sairauden välisestä yhteydestä (Yap et al., 2021). Sekoittavat tekijät, kuten ikä, sukupuoli ja ruokavalio, voivat vaikuttaa merkittävästi mikro-organismien koostumukseen. Nämä tekijät voivat selittää kirjallisuudessa havaittuja epäjohdonmukaisuuksia suoliston mikrobiomin yhteydestä monimutkaisiin sairauksiin (Johnson et al., 2019; Lagod ja Naser, 2023). Esimerkiksi Bacteroidetes-suvun jäsenten on osoitettu joko lisääntyneen tai vähentyneen ASD-eläimillä ja ihmisillä (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). Vastaavasti tulehduksellisia suolistosairauksia sairastavien potilaiden suoliston koostumuksen tutkimuksissa on havaittu sekä lisääntymistä että vähenemistä samoilla taksoneilla (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). Sukupuolivinouman vaikutuksen rajoittamiseksi pyrimme varmistamaan sukupuolten tasapuolisen edustuksen, jotta erot johtuivat todennäköisimmin ruokavaliosta. Yksi toiminnallisen annotoinnin haasteista on tarpeettomien geenisekvenssien poistaminen. Geeniklusterimenetelmämme vaatii 95 %:n sekvenssi-identtyyden ja 85 %:n pituussamankaltaisuuden sekä 90 %:n kohdistuskattavuuden virheellisen klusteroinnin poistamiseksi. Joissakin tapauksissa havaitsimme kuitenkin COG:eja, joilla oli samat annotoinnit (esim. MUT) (kuva 6). Lisätutkimuksia tarvitaan sen selvittämiseksi, ovatko nämä ortologit erillisiä, liittyvätkö ne tiettyihin sukuihin vai onko tämä geeniklusterointimenetelmän rajoitus. Toinen funktionaalisen annotoinnin rajoitus on mahdollinen virheellinen luokittelu; bakteerigeeni mmdA on tunnettu entsyymi, joka osallistuu propionaatin synteesiin, mutta KEGG ei yhdistä sitä propionaatin aineenvaihduntareittiin. Sitä vastoin scpB- ja mmcD-ortologit ovat sukua toisilleen. Suuri määrä geenejä, joilla ei ole nimettyjä knockout-geenejä, voi johtaa kyvyttömyyteen tunnistaa PPA:han liittyviä geenejä geenien runsautta arvioitaessa. Tulevaisuuden tutkimukset hyötyvät metatranskriptomianalyysistä, joka voi tarjota syvemmän ymmärryksen suoliston mikrobiotan toiminnallisista ominaisuuksista ja yhdistää geenien ilmentymisen mahdollisiin jatkovaikutuksiin. Tutkimuksissa, jotka koskevat tiettyjä neurologisia kehityshäiriöitä tai tulehduksellisia suolistosairauksia, tarvitaan eläinten fysiologisia ja käyttäytymiseen liittyviä arviointeja, jotta voidaan yhdistää mikrobiston koostumuksen muutokset näihin häiriöihin. Lisätutkimukset, joissa suoliston mikrobiomi siirretään bakteerittomiin hiiriin, olisivat myös hyödyllisiä sen määrittämiseksi, onko mikrobiomi sairauden ajuri vai ominaisuus.
Yhteenvetona voidaan todeta, että osoitimme, että ruokavalion PPA vaikuttaa suoliston mikrobiston koostumukseen. PPA on FDA:n hyväksymä säilöntäaine, jota esiintyy laajalti useissa elintarvikkeissa ja joka pitkäaikaisessa altistuksessa voi johtaa normaalin suolistoflooran häiriintymiseen. Havaitsimme muutoksia useiden bakteerien runsaudessa, mikä viittaa siihen, että PPA voi vaikuttaa suoliston mikrobiston koostumukseen. Muutokset mikrobistossa voivat johtaa tiettyjen aineenvaihduntareittien tasojen muutoksiin, mikä voi johtaa fysiologisiin muutoksiin, joilla on merkitystä isännän terveydelle. Lisätutkimuksia tarvitaan sen selvittämiseksi, voivatko ruokavalion PPA:n vaikutukset mikrobiston koostumukseen johtaa dysbioosiin tai muihin sairauksiin. Tämä tutkimus luo pohjan tuleville tutkimuksille siitä, miten PPA:n vaikutukset suoliston koostumukseen voivat vaikuttaa ihmisen terveyteen.
Tässä tutkimuksessa esitetyt aineistot ovat saatavilla verkkoarkistoissa. Arkiston nimi ja käyttönumero ovat: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Keski-Floridan yliopiston eläintenhoito- ja käyttökomitea (UCF-IACUC) hyväksyi tämän eläintutkimuksen (eläinten käyttöluvan numero: PROTO202000002). Tämä tutkimus on paikallisten lakien, määräysten ja laitoksen vaatimusten mukainen.
NG: Konseptualisointi, Datan kuratointi, Muodollinen analyysi, Tutkimus, Metodologia, Ohjelmisto, Visualisointi, Kirjoittaminen (alkuperäinen luonnos), Kirjoittaminen (tarkistus ja editointi). LA: Konseptualisointi, Datan kuratointi, Metodologia, Resurssit, Kirjoittaminen (tarkistus ja editointi). SH: Muodollinen analyysi, Ohjelmisto, Kirjoittaminen (tarkistus ja editointi). SA: Tutkimus, Kirjoittaminen (tarkistus ja editointi). Päätuomari: Tutkimus, Kirjoittaminen (tarkistus ja editointi). SN: Konseptualisointi, Projektin hallinto, Resurssit, Ohjaus, Kirjoittaminen (tarkistus ja editointi). TA: Konseptualisointi, Projektin hallinto, Ohjaus, Kirjoittaminen (tarkistus ja editointi).
Kirjoittajat ilmoittivat, etteivät he saaneet taloudellista tukea tämän artikkelin tutkimukseen, kirjoittamiseen ja/tai julkaisemiseen.
Kirjoittajat vakuuttavat, että tutkimus tehtiin ilman kaupallisia tai taloudellisia suhteita, joita voitaisiin pitää mahdollisena eturistiriitana. Ei sovelleta.
Kaikki tässä artikkelissa esitetyt mielipiteet ovat yksinomaan kirjoittajien omia eivätkä välttämättä vastaa heidän organisaatioidensa, kustantajiensa, toimittajiensa tai arvioijiensa näkemyksiä. Julkaisija ei takaa tai tue tässä artikkelissa arvioituja tuotteita tai niiden valmistajien esittämiä väitteitä.
Tämän artikkelin lisämateriaalia löytyy verkosta: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). Propionihappo indusoi glioosia ja neuroinflammaatiota säätelemällä PTEN/AKT-reittiä autismin kirjon häiriöissä. Scientific reports 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Koostumustietojen tilastollinen analyysi. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). Firmicutes/Bacteroidetes-suhde rintasyövän riskitekijänä. Journal of Clinical Medicine, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). Sekvenssilaskentadatan differentiaalinen ilmentymisanalyysi. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI, ym. (2013). Ulosteen mikrobiota ja metabolomi lapsilla, joilla on autismi ja laaja-alainen kehityshäiriö, jota ei ole muuten määritelty. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). Suoliston mikrobiotan bakteeriperäiset neurometaboliset ominaisuudet pienillä lapsilla, joilla on autismin kirjon häiriö. Journal of Medical Microbiology 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). Mikrobiomi ihmisen elimenä. Clinical Microbiology and Infection 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). Uusia näkemyksiä propionihappoa tuottavien bakteerien fysiologiasta: Anaerotignum propionicum ja Anaerotignum neopropionicum (aiemmin Clostridium propionicum ja Clostridium neopropionicum). Microorganisms 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Äidin ravitsemus ja sikiön kehitys. J Nutr. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y., ja Hochberg, J. (1995). Väärien positiivisten tulosten määrän hallinta: Käytännöllinen ja tehokas lähestymistapa useisiin testeihin. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
Julkaisun aika: 18. huhtikuuta 2025