Immunomodulatoriset metaboliitit ovat keskeinen piirre kasvaimen mikroympäristössä (TME), mutta muutamia poikkeuksia lukuun ottamatta niiden identiteetti on edelleen suurelta osin tuntematon. Tässä tutkimuksessa analysoimme kasvaimia ja T-soluja korkea-asteisen seroosin karsinooman (HGSC) potilaiden kasvaimista ja askitesnesteestä paljastaaksemme näiden eri TME-osastojen metabolomit. Askitesnesteellä ja kasvainsoluilla on merkittäviä metaboliittieroja. Verrattuna askitekseen kasvaimeen infiltratoituneet T-solut ovat merkittävästi rikastuneita 1-metyylinikotinamidin (MNA) suhteen. Vaikka MNA:n taso T-soluissa on kohonnut, nikotiiniamidi-N-metyylitransferaasin (entsyymi, joka katalysoi metyyliryhmien siirtymistä S-adenosyylimetioniinista nikotiiniamidiin) ilmentyminen rajoittuu fibroblasteihin ja kasvainsoluihin. Toiminnallisesti MNA indusoi T-soluja erittämään kasvaimia edistävää sytokiinia, tuumorinekroositekijä alfaa. Siksi TME:stä johdettu MNA edistää T-solujen immuunisäätelyä ja edustaa potentiaalista immunoterapiakohdetta ihmisen syövän hoidossa.
Kasvaimesta peräisin olevilla metaboliiteilla voi olla voimakas estävä vaikutus kasvaimia vastustavaan immuniteettiin, ja yhä useammat todisteet osoittavat, että ne voivat toimia myös keskeisenä taudin etenemisen ajurina (1). Warburgin vaikutuksen lisäksi viime aikoina on alettu tutkia kasvainsolujen metabolista tilaa ja sen suhdetta kasvaimen mikroympäristön (TME) immuunitilaan. Hiirimalleilla ja ihmisen T-soluilla tehdyt tutkimukset ovat osoittaneet, että glutamiinin aineenvaihdunta (2), oksidatiivinen aineenvaihdunta (3) ja glukoosiaineenvaihdunta (4) voivat vaikuttaa itsenäisesti erilaisiin immuunisolujen alaryhmiin. Useat näiden reittien metaboliitit estävät T-solujen kasvaimia vastustavaa toimintaa. On osoitettu, että koentsyymi tetrahydrobiopteriinin (BH4) esto voi vahingoittaa T-solujen lisääntymistä, ja BH4:n lisääntyminen elimistössä voi tehostaa CD4:n ja CD8:n välittämää kasvaimia vastustavaa immuunivastetta. Lisäksi kynureniinin immunosuppressiivinen vaikutus voidaan pelastaa antamalla BH4:ää (5). Isositraattidehydrogenaasi (IDH) -mutanttiglioblastoomassa enantiometabolisen (R)-2-hydroksiglutaraatin (R-2-HG) eritys estää T-solujen aktivaatiota, lisääntymistä ja sytolyysiaktiivisuutta (6). Äskettäin on osoitettu, että glykolyysin sivutuotetta, metyyliglyoksaalia, tuottavat myeloidista alkuperää olevat suppressorisolut, ja metyyliglyoksaalin siirto T-soluihin voi estää efektori-T-solujen toimintaa. Hoidossa metyyliglyoksaalin neutralointi voi voittaa myeloidista peräisin olevien suppressorisolujen (MDSC) aktiivisuuden ja tehostaa synergistisesti tarkastuspisteiden estohoitoa hiirimalleissa (7). Nämä tutkimukset korostavat yhdessä TME-peräisten metaboliittien keskeistä roolia T-solujen toiminnan ja aktiivisuuden säätelyssä.
T-solujen toimintahäiriöitä on raportoitu laajalti munasarjasyövässä (8). Tämä johtuu osittain hypoksian ja epänormaalin kasvaimen verisuoniston metabolisista ominaisuuksista (9), jotka johtavat glukoosin ja tryptofaanin muuntumiseen sivutuotteiksi, kuten maitohapoksi ja kynureniiniksi. Liiallinen solunulkoinen laktaatti vähentää interferoni-γ:n (IFN-γ) tuotantoa ja edistää myelosuppressiivisten alaryhmien erilaistumista (10, 11). Tryptofaanin kulutus estää suoraan T-solujen lisääntymistä ja estää T-solureseptorien signalointia (12-14). Näistä havainnoista huolimatta paljon immuunimetaboliaan liittyvää työtä on tehty in vitro T-soluviljelmissä käyttäen optimoituja elatusaineita tai rajoitettu homologisiin hiirimalleihin in vivo, joista kumpikaan ei täysin heijasta ihmisen syöpien ja fysiologisen makro- ja mikroympäristön heterogeenisyyttä.
Munasarjasyövän yleinen piirre on leviäminen vatsaonteloon ja askiteksen esiintyminen. Solunesteen kertyminen askitekseen liittyy pitkälle edenneeseen tautiin ja huonoon ennusteeseen (15). Raporttien mukaan tämä ainutlaatuinen tila on hypoksinen, siinä on korkeat verisuonten endoteelikasvutekijän (VEGF) ja indoleamiini-2,3-dioksigenaasin (IDO) pitoisuudet, ja siihen tunkeutuvat T-säätelysolut ja myeloidiset inhibiittorisolut (15-18). Askiteksen metabolinen ympäristö voi olla erilainen kuin kasvaimen itsensä, joten T-solujen uudelleenohjelmointi vatsaontelotilassa on epäselvä. Lisäksi askiteksen ja kasvainympäristössä olevien metaboliittien väliset keskeiset erot ja heterogeenisyys voivat haitata immuunisolujen tunkeutumista ja niiden toimintaa kasvaimissa, ja lisätutkimuksia tarvitaan.
Näiden ongelmien ratkaisemiseksi suunnittelimme herkän soluerottelu- ja nestekromatografia-tandemmassaspektrometriamenetelmän (LC-MS/MS) tutkiaksemme eri solutyyppejä (mukaan lukien CD4+- ja CD8+-T-solut) sekä kasvainten sisällä ja niiden välillä. Sen metaboliitit ulottuvat potilaan samassa askitesneste- ja kasvainympäristössä oleviin soluihin. Käytämme tätä menetelmää yhdessä korkeaulotteisen virtaussytometrian ja yksisolu-RNA-sekvensoinnin (scRNA-seq) kanssa tarjotaksemme erittäin selkeän kuvan näiden keskeisten populaatioiden aineenvaihduntatilasta. Tämä menetelmä paljasti merkittävän 1-metyylinikotinamidin (MNA) tason nousun kasvain-T-soluissa, ja in vitro -kokeet osoittivat, että MNA:n immunomodulatorinen vaikutus T-solujen toimintaan oli aiemmin tuntematon. Yleisesti ottaen tämä menetelmä paljastaa kasvainten ja immuunisolujen väliset keskinäiset metaboliset vuorovaikutukset ja tarjoaa ainutlaatuisia näkemyksiä immuunisäätelyn metaboliiteista, jotka voivat olla hyödyllisiä T-solupohjaisen munasarjasyövän immunoterapian hoidossa. Hoitomahdollisuudet.
Käytimme korkeaulotteista virtaussytometriaa samanaikaisesti glukoosinoton [2-(N-(7-nitrofenyyli-2-oksa-1,3-diatsa-4-yyli)amino)-2-deoksiglukoosi (2-NBDG) ja mitokondrioiden aktiivisuuden [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) kvantifioimiseksi. Nämä ovat rinnakkaisia ​​tyypillisiä markkereita, jotka erottavat immuunisolut ja kasvainsolupopulaatiot (taulukko S2 ja kuva S1A). Tämä analyysi osoitti, että askitesnesteessä ja kasvainsoluissa on T-soluihin verrattuna korkeammat glukoosinottotasot, mutta mitokondrioiden aktiivisuudessa on pienempiä eroja. Kasvainsolujen keskimääräinen glukoosinotto [CD45-EpCAM (EpCAM)+] on kolmesta neljään kertaa suurempi kuin T-solujen, ja CD4+ T-solujen keskimääräinen glukoosinotto on 1,2 kertaa suurempi kuin CD8+ T-solujen, mikä osoittaa, että kasvaimeen tunkeutuvilla lymfosyyteillä (TIL) on erilaiset aineenvaihduntavaatimukset jopa samassa TME:ssä (kuva 1A). Sitä vastoin mitokondrioiden aktiivisuus kasvainsoluissa on samankaltainen kuin CD4+ T-soluilla, ja molempien solutyyppien mitokondrioiden aktiivisuus on korkeampi kuin CD8+ T-soluilla (kuva 1B). Yleisesti ottaen nämä tulokset paljastavat metabolisen tason. Kasvainsolujen metabolinen aktiivisuus on korkeampi kuin CD4+ T-solujen, ja CD4+ T-solujen metabolinen aktiivisuus on korkeampi kuin CD8+ T-solujen. Näistä solutyyppien välisistä vaikutuksista huolimatta CD4+ ja CD8+ T-solujen metabolisessa tilassa tai niiden suhteellisissa osuuksissa askiteksessa ei ole johdonmukaista eroa kasvaimiin verrattuna (kuva 1C). Sitä vastoin CD45-solufraktiossa EpCAM+-solujen osuus kasvaimessa kasvoi askitekseen verrattuna (kuva 1D). Havaitsimme myös selkeän metabolisen eron EpCAM+- ja EpCAM--solukomponenttien välillä. EpCAM+ (kasvain)soluilla on korkeampi glukoosin otto ja mitokondrioiden aktiivisuus kuin EpCAM--soluilla, mikä on paljon korkeampi kuin fibroblastien metabolinen aktiivisuus kasvainsoluissa TME:ssä (kuva 1, E ja F).
(A ja B) Glukoosinottokyvyn mediaanifluoresenssi-intensiteetti (MFI) (2-NBDG) (A) ja CD4+ T-solujen mitokondriaalinen aktiivisuus (MitoTracker tummanpunainen) (B) Edustavat kaaviot (vasen) ja taulukkotiedot (oikea), CD8+ T-solut ja EpCAM+CD45-kasvainsolut askiteksessa ja kasvaimessa. (C) CD4+ ja CD8+ solujen (CD3+ T-solujen) suhde askiteksessa ja kasvaimessa. (D) EpCAM+ kasvainsolujen osuus askiteksessa ja kasvaimessa (CD45−). (E ja F) EpCAM+CD45-kasvain- ja EpCAM-CD45-matriisin glukoosinottokyky (2-NBDG) (E) ja mitokondriaalinen aktiivisuus (MitoTracker tummanpunainen) (F) Edustavat kaaviot (vasen) ja taulukkotiedot (oikea) Askites ja kasvainsolut. (G) Edustavat kaaviot CD25:n, CD137:n ja PD1:n ilmentymisestä virtaussytometrialla. (H ja I) CD25:n, CD137:n ja PD1:n ilmentyminen CD4+ T-soluissa (H) ja CD8+ T-soluissa (I). (J ja K) Naiivit, sentraaliset muisti- (Tcm), efektori- (Teff) ja efektorimuisti- (Tem) fenotyypit CCR7:n ja CD45RO:n ilmentymisen perusteella. Edustavat kuvat (vasen) ja taulukkomuotoiset tiedot (oikea) CD4+ T-soluista (J) ja CD8+ T-soluista (K) askiteksessa ja kasvaimissa. P-arvot määritettynä parillisella t-testillä (*P<0,05, **P<0,01 ja ***P<0,001). Viiva edustaa paritettuja potilaita (n = 6). FMO, fluoresenssi miinus yksi; MFI, mediaanifluoresenssi-intensiteetti.
Lisäanalyysi paljasti muita merkittäviä eroja erittäin erottuvien T-solujen fenotyyppisten tilojen välillä. Aktivoituneet (kuva 1, G-I) ja efektorimuistisolut (kuva 1, J ja K) esiintyvät kasvaimissa paljon useammin kuin askites (CD3+ T-solujen osuus). Vastaavasti fenotyypin analysointi aktivaatiomarkkereiden (CD25 ja CD137) ja ehtymismarkkereiden [ohjelmoitu solukuolemaproteiini 1 (PD1)] ilmentymisen perusteella osoitti, että vaikka näiden populaatioiden metaboliset ominaisuudet eroavat toisistaan ​​(kuva S1, B-E), ei havaittu johdonmukaisesti merkittäviä metabolisia eroja naiivisten, efektori- tai muistialaryhmien välillä (kuva S1, F-I). Nämä tulokset vahvistettiin käyttämällä koneoppimismenetelmiä solufenotyyppien automaattiseen määrittämiseen (21), mikä paljasti edelleen suuren määrän luuydinsoluja (CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+) potilaan askitesnesteessä (kuva S2A). Kaikista tunnistetuista solutyypeistä tämä myeloidisolupopulaatio osoitti korkeinta glukoosinottoa ja mitokondriaalista aktiivisuutta (kuva S2, B-G). Nämä tulokset korostavat voimakkaita metabolisia eroja HGSC-potilaiden askitesissa ja kasvaimissa esiintyvien useiden solutyyppien välillä.
TIL:n metabonomisten ominaisuuksien ymmärtämisen suurin haaste on tarve eristää kasvaimista riittävän puhtaita, laadukkaita ja määrältään T-solunäytteitä. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että virtaussytometriaan perustuvat lajittelu- ja helmirikastusmenetelmät voivat johtaa muutoksiin solujen metaboliittiprofiileissa (22-24). Tämän ongelman ratkaisemiseksi optimoimme helmirikastusmenetelmän TIL:n eristämiseksi ja eristämiseksi kirurgisesti resektoidusta ihmisen munasarjasyövästä ennen LC-MS/MS-analyysiä (katso Materiaalit ja menetelmät; kuva 2A). Jotta voisimme arvioida tämän protokollan kokonaisvaikutusta metaboliittimuutoksiin, vertasimme terveiden luovuttajien edellä mainitun helmierotteluvaiheen jälkeen aktivoimien T-solujen metaboliittiprofiileja soluihin, joita ei ollut erotettu helmillä, vaan jotka pysyivät jäissä. Tässä laadunvalvonta-analyysissä havaittiin, että näiden kahden olosuhteen välillä on korkea korrelaatio (r = 0,77), ja 86 metaboliitin ryhmän teknisellä toistettavuudella on korkea toistettavuus (kuva 2B). Siksi nämä menetelmät voivat suorittaa tarkan metaboliittianalyysin soluissa, joissa on meneillään solutyypin rikastusta, mikä tarjoaa ensimmäisen korkean resoluution alustan spesifisten metaboliittien tunnistamiseksi HGSC:ssä, mikä mahdollistaa ihmisten syvemmän ymmärryksen soluspesifisyydestä seksuaalisen aineenvaihdunnan ohjelmassa.
(A) Magneettihelmirikastuksen kaaviokuva. Ennen LC-MS/MS-analyysiä solut käyvät läpi kolme peräkkäistä magneettihelmirikastuskierrosta tai ne pysyvät jäissä. (B) Rikastustyypin vaikutus metaboliittien runsauteen. Kolmen mittauksen keskiarvo kullekin rikastustyypille ± SE. Harmaa viiva edustaa 1:1-suhdetta. Toistettujen mittausten luokan sisäinen korrelaatio (ICC) on esitetty akselin etiketissä. NAD, nikotiiniamidi-adeniinidinukleotidi. (C) Kaaviokuva potilasmetaboliittianalyysin työnkulusta. Potilailta kerätään askitesnestettä tai kasvaimia ja kryosäilötään. Pieni osa kustakin näytteestä analysoitiin virtaussytometrialla, kun taas loput näytteet rikastettiin kolme kertaa CD4+-, CD8+- ja CD45--solujen osalta. Nämä solufraktiot analysoitiin LC-MS/MS:llä. (D) Standardoidun metaboliittien runsauden lämpökartta. Dendrogrammi edustaa Wardin klusterointia näytteiden välisistä euklidisista etäisyyksistä. (E) Näytteen metaboliittikartan pääkomponenttianalyysi (PCA), jossa näkyy kolme toistoa kustakin näytteestä, saman potilaan näytteet on yhdistetty viivalla. (F) Potilaalla ehdollisen näytteen metaboliittiprofiilin PCA (eli osittaista redundanssia käyttäen); näytetyyppiä rajoittaa konveksi huppu. PC1, pääkomponentti 1; PC2, pääkomponentti 2.
Seuraavaksi käytimme tätä rikastusmenetelmää analysoidaksemme 99 metaboliittia kuuden HGSC-potilaan primaarisen askiteksen ja kasvainten CD4+-, CD8+- ja CD45-solufraktioissa (kuva 2C, kuva S3A ja taulukot S3 ja S4). Kiinnostava populaatio muodostaa 2–70 % alkuperäisestä suuresta elävien solujen näytteestä, ja solujen osuus vaihtelee suuresti potilaiden välillä. Helmien erottamisen jälkeen kiinnostuksen kohteena oleva rikastettu fraktio (CD4+, CD8+ tai CD45-) muodostaa keskimäärin yli 85 % kaikista näytteen elävistä soluista. Tämä rikastusmenetelmä mahdollistaa ihmisen kasvainkudoksen aineenvaihdunnasta peräisin olevien solupopulaatioiden analysoinnin, mikä on mahdotonta tehdä suurista näytteistä. Tätä protokollaa käyttämällä määritimme, että näiden kahden hyvin karakterisoidun immunosuppressiivisen metaboliitin, l-kynureniinin ja adenosiinin, pitoisuudet olivat koholla kasvain-T-soluissa tai kasvainsoluissa (kuva S3, B ja C). Nämä tulokset osoittavat siis soluerottelu- ja massaspektrometriateknologiamme tarkkuuden ja kyvyn löytää biologisesti tärkeitä metaboliitteja potilaskudoksista.
Analyysimme paljasti myös voimakkaan metabolisen solutyyppien eriytymisen sekä potilaiden sisällä että niiden välillä (kuva 2D ja kuva S4A). Erityisesti muihin potilaisiin verrattuna potilaalla 70 oli erilaisia ​​metabolisia ominaisuuksia (kuva 2E ja kuva S4B), mikä viittaa siihen, että potilaiden välillä saattaa olla huomattavaa metabolista heterogeenisyyttä. On syytä huomata, että muihin potilaisiin verrattuna (1,2–2 litraa; taulukko S1) potilaalla 70 kerätyn askiteksen kokonaismäärä (80 ml) oli pienempi. Potilaiden välisen heterogeenisyyden kontrolli pääkomponenttianalyysin aikana (esimerkiksi osittaisen redundanssianalyysin avulla) osoittaa johdonmukaisia ​​muutoksia solutyyppien välillä, ja solutyypit ja/tai mikroympäristö aggregoituvat selvästi metaboliittiprofiilin mukaan (kuva 2F). Yksittäisten metaboliittien analyysi korosti näitä vaikutuksia ja paljasti merkittäviä eroja solutyyppien ja mikroympäristön välillä. On syytä huomata, että suurin havaittu ero on MNA, jota on yleensä runsaasti CD45--soluissa ja kasvaimeen tunkeutuvissa CD4+- ja CD8+-soluissa (kuva 3A). CD4+-soluilla tämä vaikutus on ilmeisin, ja myös CD8+-solujen MNA:han ympäristö näyttää vaikuttavan voimakkaasti. Tällä ei kuitenkaan ole merkitystä, koska vain kolmelta kuudesta potilaasta voidaan arvioida kasvaimen CD8+-pisteet. MNA:n lisäksi erityyppisissä askitesnesteessä ja kasvaimissa on myös muita metaboliitteja, jotka on huonosti karakterisoitu TIL:ssä, erilaistumisella rikastettuja (kuvat S3 ja S4). Siksi nämä tiedot paljastavat lupaavan joukon immunomodulatorisia metaboliitteja jatkotutkimuksia varten.
(A) Normalisoitu MNA-pitoisuus CD4+-, CD8+- ja CD45--soluissa askiteksessa ja kasvaimessa. Laatikkodiagrammi näyttää mediaanin (viiva), kvartiilien välisen alueen (kehyksen sarana) ja data-alueen, jopa 1,5-kertaiseen kvartiilien väliseen alueeseen (kehyksen viikset) asti. Kuten potilasmateriaaleissa ja -menetelmissä on kuvattu, käytä potilaan limma-arvoa P-arvon määrittämiseen (*P<0,05 ja **P<0,01). (B) Kaaviokuva MNA:n aineenvaihdunnasta (60). Metaboliitit: S-adenosyyli-1-metioniini; SAH, S-adenosiini-1-homokysteiini; NA, nikotiiniamidi; MNA, 1-metyylinikotiiniamidi; 2-PY, 1-metyyli-2-pyridoni-5-karboksamidi; 4-PY, 1-metyyli-4-pyridoni-5-karboksamidi; NR, nikotiiniamidiriboosi; NMN, nikotiiniamidimononukleotidi. Entsyymit (vihreä): NNMT, nikotiiniamidi-N-metyylitransferaasi; SIRT, sirtuiinit; NAMPT, nikotiiniamidifosforibosyylitransferaasi; AOX1, aldehydioksidaasi 1; NRK, nikotiiniamidiribosidikinaasi; NMNAT, nikotiiniamidimononukleotidiadenylaattitransferaasi; Pnp1, puriininukleosidifosforylaasi. (C) Askitesin (harmaa) ja kasvaimen (punainen; n = 3 potilasta) scRNA-sekvenssin t-SNE. (D) NNMT:n ilmentyminen eri solupopulaatioissa, jotka on tunnistettu scRNA-sekvenssin avulla. (E) NNMT:n ja AOX1:n ilmentyminen SK-OV-3:ssa, ihmisen alkion munuaisen (HEK) 293T-soluissa, T-soluissa ja MNA-käsitellyissä T-soluissa. Laskostunut ilmentyminen on esitetty suhteessa SK-OV-3:een. Ilmentymiskuvio SEM:llä on esitetty (n = 6 tervettä luovuttajaa). Yli 35:n Ct-arvoja pidetään havaitsemattomina (UD). (F) SLC22A1:n ja SLC22A2:n ilmentyminen SK-OV-3-, HEK293T- ja T-soluissa sekä 8 mM MNA:lla käsitellyissä T-soluissa. Laskostunut ilmentyminen on esitetty suhteessa SK-OV-3:een. Ilmentymiskuvio SEM:llä on esitetty (n = 6 tervettä luovuttajaa). Yli 35:n Ct-arvoja pidetään havaitsemattomina (UD). (G) Solujen MNA-pitoisuus aktivoiduissa terveissä luovuttaja-T-soluissa 72 tunnin MNA-inkubaation jälkeen. Ilmentymiskuvio SEM:llä on esitetty (n = 4 tervettä luovuttajaa).
MNA:ta tuotetaan siirtämällä metyyliryhmä S-adenosyyli-1-metioniinista (SAM) nikotiiniamidiin (NA) nikotiiniamidi-N-metyylitransferaasin (NNMT; kuva 3B) avulla. NNMT:tä ilmentyy liikaa useissa ihmisen syövissä, ja se liittyy proliferaatioon, invaasioon ja metastaasiin (25–27). Ymmärtääksemme paremmin MNA:n lähdettä T-soluissa TME:ssä käytimme scRNA-sekvensointia karakterisoidaksemme NNMT:n ilmentymistä eri solutyypeissä kolmen HGSC-potilaan askitesnesteessä ja kasvaimissa (taulukko S5). Noin 6 500 solun analyysi osoitti, että askitesnesteessä ja kasvainympäristöissä NNMT:n ilmentyminen rajoittui oletettuihin fibroblasti- ja kasvainsolupopulaatioihin (kuva 3, C ja D). On syytä huomata, että missään PTPRC:tä (CD45+) ilmentävässä populaatiossa ei ole selvää NNMT:n ilmentymistä (kuva 3D ja kuva S5A), mikä osoittaa, että metaboliittispektrissä havaittu MNA on kulkeutunut T-soluihin. Aldehydioksidaasi 1:n (AOX1) ilmentyminen muuntaa MNA:n 1-metyyli-2-pyridoni-5-karboksamidiksi (2-PYR) tai 1-metyyli-4-pyridoni-5-karboksamidiksi (4-PYR); kuva 3B) rajoittuu myös COL1A1:tä ilmentävien fibroblastien populaatioon (kuva S5A), jotka yhdessä osoittavat, että T-soluilta puuttuu kyky perinteiseen MNA-aineenvaihduntaan. Näiden MNA:han liittyvien geenien ilmentymiskuvio varmistettiin käyttämällä toista riippumatonta soluaineistoa HGSC-potilaiden askitesnesteestä (kuva S5B; n = 6) (16). Lisäksi terveiden, MNA:lla käsiteltyjen luovuttaja-T-solujen kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (qPCR) -analyysi osoitti, että verrattuna kontrolliryhmään kuuluviin SK-OV-3-munasarjasyöpäsoluihin, NNMT:tä tai AOX1:tä ei juurikaan ilmentynyt (kuva 3E). Nämä odottamattomat tulokset viittaavat siihen, että MNA:ta voi erittyä fibroblasteista tai kasvaimista viereisiin T-soluihin TME:ssä.
Vaikka ehdokkaisiin kuuluu liukoisen kantajan 22 (SLC22) perheen (SLC22A1, SLC22A2 ja SLC22A3) koodaamien orgaanisten kationien kuljettajien 1–3 perhe (OCT1, OCT2 ja OCT3), MNA:n mahdolliset kuljettajat ovat vielä määrittelemättömiä (28). Terveiden luovuttajien T-solujen mRNA:n QPCR-kokeessa havaittiin alhaisia ​​SLC22A1:n ilmentymistasoja, mutta SLC22A2:n pitoisuuksia ei havaittu, mikä vahvisti, että siitä oli aiemmin raportoitu kirjallisuudessa (kuva 3F) (29). Sitä vastoin SK-OV-3-munasarjasyöpäsolulinja ilmensi korkeita määriä molempia kuljettajia (kuva 3F).
Jotta testattaisiin T-solujen kykyä imeä vierasta MNA:ta, terveitä luovuttaja-T-soluja viljeltiin 72 tuntia eri MNA-pitoisuuksien läsnä ollessa. Ilman eksogeenista MNA:ta MNA:n solujen pitoisuutta ei voida havaita (kuva 3G). Eksogeenisella MNA:lla käsitellyissä aktivoituneissa T-soluissa havaittiin kuitenkin annoksesta riippuva MNA-pitoisuuden nousu solujen sisällä, jopa 6 mM MNA:han asti (kuva 3G). Tämä tulos osoittaa, että huolimatta transportterin alhaisesta ilmentymisestä ja solunsisäisestä MNA-aineenvaihdunnasta vastaavan pääentsyymin puutteesta, TIL voi silti ottaa MNA:ta.
Potilaiden T-solujen metaboliittien kirjo ja in vitro -MNA:n absorptiokokeet lisäävät mahdollisuutta, että syöpään liittyvät fibroblastit (CAF) erittävät MNA:ta ja kasvainsolut saattavat säädellä TIL:n fenotyyppiä ja toimintaa. MNA:n vaikutuksen määrittämiseksi T-soluihin terveiden luovuttajien T-soluja aktivoitiin in vitro MNA:n läsnä ollessa tai ilman sitä, ja niiden proliferaatiota ja sytokiinituotantoa arvioitiin. Seitsemän päivän kuluttua MNA:n lisäämisestä suurimmalla annoksella populaation kaksinkertaistumisluku laski kohtalaisesti, kun taas elinvoima säilyi kaikilla annoksilla (kuva 4A). Lisäksi eksogeenisen MNA:n käsittely johti tuumorinekroositekijä-α:aa (TNFα; kuva 4B) ilmentävien CD4+- ja CD8+-T-solujen osuuden kasvuun. Sitä vastoin IFN-γ:n solunsisäinen tuotanto väheni merkittävästi CD4+-T-soluissa, mutta ei CD8+-T-soluissa, eikä interleukiini 2:ssa (IL-2; kuva 4, C ja D) havaittu merkittävää muutosta. Näiden MNA:lla käsiteltyjen T-soluviljelmien supernatanttien entsyymi-immunosorbenttimääritys (ELISA) osoitti siis merkittävää TNFα:n nousua, IFN-γ:n laskua ja IL-2:n pysymistä ennallaan (kuva 4, E–G). IFN-γ:n lasku viittaa siihen, että MNA:lla saattaa olla rooli T-solujen kasvaimia estävän aktiivisuuden estämisessä. MNA:n vaikutuksen simuloimiseksi T-solujen välittämään sytotoksisuuteen terveiden luovuttajien perifeerisen veren mononukleaarisolut (PBMC) tuottavat kimeerisiä antigeenireseptori T-soluja (FRα-CAR-T), jotka kohdistuvat folaattireseptori α:han, ja vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) säätelemiä CAR-T-soluja (GFP). CAR-T-soluja viljeltiin 24 tuntia MNA:n läsnä ollessa ja sitten niitä viljeltiin yhdessä ihmisen SK-OV-3-munasarjasyöpäsolujen kanssa, jotka ilmensivät folaattireseptori α:ta efektori-kohde-suhteella 10:1. MNA-käsittely johti FRα-CAR-T-solujen tappamisaktiivisuuden merkittävään vähenemiseen, mikä oli samanlaista kuin adenosiinilla käsitellyillä FRα-CAR-T-soluilla (kuva 4H).
(A) Kokonaiselinkykyisten solujen määrä ja populaation kaksinkertaistuminen (PD) suoraan viljelmästä päivänä 7. Pylväsdiagrammi esittää kuuden terveen luovuttajan keskiarvoa + SEM. Edustaa tietoja vähintään n = 3 riippumattomasta kokeesta. (B–D) CD3/CD28:aa ja IL-2:ta käytettiin T-solujen aktivoimiseen niiden vastaavilla MNA-pitoisuuksilla 7 päivän ajan. Ennen analyysia soluja stimuloitiin PMA/ionomysiinillä ja GolgiStopilla 4 tunnin ajan. TNFα:n (B) ilmentyminen T-soluissa. Esimerkkikuva (vasen) ja taulukkomuotoiset tiedot (oikea) TNFα:n ilmentymisestä elävissä soluissa. IFN-γ:n (C) ja IL-2:n (D) ilmentyminen T-soluissa. Sytokiinien ilmentyminen mitattiin virtaussytometrialla. Pylväsdiagrammi esittää keskiarvoa (n = 6 tervettä luovuttajaa) + SEM. Käytä yksisuuntaista varianssianalyysia ja toistuvia mittauksia (*P<0,05 ja **P<0,01) P-arvon määrittämiseksi. Edustaa tietoja vähintään n = 3 riippumattomasta kokeesta. (E - G) CD3/CD28:aa ja IL-2:ta käytettiin T-solujen aktivoimiseen niiden vastaavilla MNA-pitoisuuksilla 7 päivän ajan. Kasvualusta kerättiin ennen 4 tuntia PMA/ionomysiinistimulaatiota ja sen jälkeen. TNFα:n (E), IFN-γ:n (F) ja IL-2:n (G) pitoisuudet mitattiin ELISA:lla. Pylväsdiagrammi esittää keskiarvoa (n = 5 tervettä luovuttajaa) + SEM. P-arvo määritettiin käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysiä ja toistuvia mittauksia (*P<0,05). Katkoviiva osoittaa havaitsemisrajan. (H) Solulyysimääritys. FRα-CAR-T- tai GFP-CAR-T-soluja säädettiin adenosiinilla (250 μM) tai MNA:lla (10 mM) 24 tunnin ajan tai ne jätettiin käsittelemättä (Ctrl). SK-OV-3-solujen tappamisprosentti mitattiin. P-arvo määritettiin Welchin t-testillä (*P<0,5 ja **P<0,01).
MNA:sta riippuvan TNFα:n ilmentymisen säätelyn mekanistisen ymmärtämisen saavuttamiseksi arvioitiin MNA:lla käsiteltyjen T-solujen TNFα-mRNA:n muutoksia (kuva 5A). Terveillä, MNA:lla käsitellyillä luovuttaja-T-soluilla havaittiin TNFα:n transkriptiotasojen kaksinkertainen nousu, mikä viittaa siihen, että MNA on riippuvainen TNFα:n transkription säätelystä. Tämän mahdollisen säätelymekanismin tutkimiseksi arvioitiin kahta tunnettua TNFα:ta säätelevää transkriptiotekijää, nimittäin aktivoitunutta T-solun tumatekijää (NFAT) ja spesifistä proteiinia 1 (Sp1), vasteena MNA:n sitoutumiselle proksimaaliseen TNFα-promoottoriin (30). TNFα-promoottori sisältää 6 tunnistettua NFAT:n sitoutumiskohtaa ja 2 Sp1:n sitoutumiskohtaa, jotka ovat päällekkäisiä yhdessä kohdassa [-55 emäsparia (bp) 5'-päästä] (30). Kromatiini-immunosaostus (ChIP) osoitti, että MNA:lla käsiteltynä Sp1:n sitoutuminen TNFα-promoottoriin kolminkertaistui. Myös NFAT:n liittyminen lisääntyi ja lähestyi merkitystä (kuva 5B). Nämä tiedot osoittavat, että MNA säätelee TNFα:n ilmentymistä Sp1-transkription kautta ja vähäisemmässä määrin NFAT:n ilmentymistä.
(A) Verrattuna ilman MNA:ta viljeltyihin T-soluihin, TNFα:n ilmentymisen kerrannainen muutos MNA:lla käsitellyissä T-soluissa. Ilmentymiskuvio SEM:llä on esitetty (n = 5 tervettä luovuttajaa). Edustaa tietoja vähintään n = 3 riippumattomasta kokeesta. (B) 8 mM MNA:lla tai ilman MNA:ta käsiteltyjen T-solujen TNFα-promoottori NFAT:n ja Sp1:n jälkeen yhdistettiin (Ctrl)- ja PMA/ionomysiinistimulaatioon 4 tunnin ajan. Immunoglobuliini G:tä (IgG) ja H3:a käytettiin negatiivisina ja positiivisina kontrolleina immunosaostuksessa. ChIP:n kvantifiointi osoitti, että Sp1:n ja NFAT:n sitoutuminen TNFα-promoottoriin MNA:lla käsitellyissä soluissa lisääntyi moninkertaisesti kontrolliin verrattuna. Edustaa tietoja vähintään n = 3 riippumattomasta kokeesta. P-arvo määritetty useilla t-testeillä (*** P <0,01). (C) Verrattuna HGSC:n askitekseen, T-solut (ei-sytotoksiset) osoittivat lisääntynyttä TNF:n ilmentymistä kasvaimessa. Värit edustavat eri potilaita. Näytetyt solut on otettu satunnaisesti 300 soluun ja niitä on värinäheräte, jotta niiden määrä ei ylikuormitu (** Padj = 0,0076). (D) Ehdotettu MNA-malli munasarjasyövälle. MNA:ta tuotetaan kasvainsoluissa ja fibroblasteissa TME:ssä, ja T-solut ottavat sen vastaan. MNA lisää Sp1:n sitoutumista TNFα-promoottoriin, mikä johtaa lisääntyneeseen TNFα-transkriptioon ja TNFα-sytokiinien tuotantoon. MNA aiheuttaa myös IFN-γ:n vähenemistä. T-solujen toiminnan esto johtaa heikentyneeseen tappamiskykyyn ja kiihtyneeseen kasvaimen kasvuun.
Raporttien mukaan TNFα:lla on etu- ja takapuolisesti riippuvaisia ​​kasvaimia estäviä ja kasvaimia ehkäiseviä vaikutuksia, mutta sillä on tunnettu rooli munasarjasyövän kasvun ja metastaasin edistämisessä (31–33). Raporttien mukaan TNFα:n pitoisuus munasarjasyöpäpotilaiden askitesnesteessä ja kasvainkudoksissa on korkeampi kuin hyvänlaatuisissa kudoksissa (34–36). Mekanismin osalta TNFα voi säädellä valkosolujen aktivaatiota, toimintaa ja lisääntymistä sekä muuttaa syöpäsolujen fenotyyppiä (37, 38). Näiden havaintojen mukaisesti differentiaalinen geeniekspressioanalyysi osoitti, että TNF:n ilmentyminen lisääntyi merkittävästi kasvainkudosten T-soluissa verrattuna askitekseen (kuva 5C). TNF:n ilmentymisen lisääntyminen oli havaittavissa vain T-solupopulaatioissa, joilla oli ei-sytotoksinen fenotyyppi (kuva S5A). Yhteenvetona voidaan todeta, että nämä tiedot tukevat näkemystä, että MNA:lla on sekä immunosuppressiivisia että kasvaimia edistäviä vaikutuksia korkean verenkierron tukikudoksessa (HGSC).
Virtaussytometriaan perustuvasta fluoresenssileimauksesta on tullut tärkein menetelmä TIL-aineenvaihdunnan tutkimiseen. Nämä tutkimukset ovat osoittaneet, että verrattuna perifeerisen veren lymfosyytteihin tai sekundaaristen imukudosten T-soluihin, hiiren ja ihmisen TIL:llä on suurempi taipumus ottaa glukoosia (4, 39) ja mitokondrioiden toiminta heikkenee asteittain (19, 40). Vaikka olemme havainneet samankaltaisia ​​tuloksia tässä tutkimuksessa, keskeinen kehitysaskel on vertailla kasvainsolujen ja samasta resektoidusta kasvainkudoksesta peräisin olevien TIL-solujen aineenvaihduntaa. Näiden aiempien raporttien mukaisesti askitesnesteestä ja kasvaimista peräisin olevien kasvainsolujen (CD45-EpCAM+) glukoosinottokyky on suurempi kuin CD8+ ja CD4+ T-solujen, mikä tukee sitä, että kasvainsolujen korkeaa glukoosinottokykyä voidaan verrata T-solujen korkeaan glukoosinottokykyyn. T-solujen kilpailun käsite. TME. Kasvainsolujen mitokondriaalinen aktiivisuus on kuitenkin korkeampaa kuin CD8+ T-solujen, mutta mitokondriaalinen aktiivisuus on samanlainen kuin CD4+ T-solujen. Nämä tulokset vahvistavat nousevaa teemaa, että oksidatiivinen aineenvaihdunta on tärkeää kasvainsoluille (41, 42). Ne viittaavat myös siihen, että CD8+ T-solut saattavat olla alttiimpia oksidatiiviselle toimintahäiriölle kuin CD4+ T-solut, tai että CD4+ T-solut saattavat käyttää muita hiilen lähteitä kuin glukoosia mitokondriaalisen aktiivisuuden ylläpitämiseen (43, 44). On huomattava, ettemme havainneet eroa glukoosin otossa tai mitokondriaalisessa aktiivisuudessa CD4+ T-efektorisolujen, T-efektorimuistisolujen ja T-keskusmuistisolujen välillä askiteksessa. Vastaavasti CD8+ T-solujen erilaistumistila kasvaimissa ei liity mitenkään glukoosin oton muutoksiin, mikä korostaa merkittävää eroa in vitro -viljeltyjen T-solujen ja in vivo -viljeltyjen ihmisen TIL-solujen välillä (22). Nämä havainnot vahvistettiin myös käyttämällä puolueetonta automaattista solupopulaation allokointia, joka paljasti edelleen, että CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ -solut, joilla on korkeampi glukoosin otto ja mitokondriaalinen aktiivisuus kuin kasvainsoluilla, ovat yleisiä, mutta niillä on metabolisesti aktiivinen solupopulaatio. Tämä populaatio voi edustaa scRNA-sekvensointianalyysissä tunnistettua myeloidisten suppressorisolujen tai plasmasytoididendriittisolujen oletettua alapopulaatiota. Vaikka molempia näistä on raportoitu ihmisen munasarjakasvaimissa [45], ne vaativat vielä lisätutkimusta tämän myeloidisen alaryhmän kuvaamiseksi.
Vaikka virtaussytometriaan perustuvat menetelmät voivat selventää yleisiä eroja glukoosi- ja oksidatiivisessa aineenvaihdunnassa solutyyppien välillä, glukoosin tai muiden hiililähteiden tuottamia tarkkoja metaboliitteja mitokondrioiden aineenvaihdunnassa TME:ssä ei ole vielä määritetty. Metaboliittien läsnäolon tai puuttumisen määrittäminen tietylle TIL-alaryhmälle edellyttää solupopulaation puhdistamista poistetusta kudoksesta. Siksi solurikastusmenetelmämme yhdistettynä massaspektrometriaan voi antaa tietoa metaboliiteista, jotka ovat rikastuneet eri tavoin T-soluissa ja kasvainsolupopulaatioissa vastaavissa potilasnäytteissä. Vaikka tällä menetelmällä on etuja fluoresenssiaktivoituun solulajitteluun verrattuna, tietyt metaboliittikirjastot voivat kärsiä luontaisen stabiiliutensa ja/tai nopean vaihtuvuusnopeuden vuoksi (22). Menetelmämme pystyi kuitenkin tunnistamaan kaksi tunnettua immunosuppressiivista metaboliittia, adenosiinin ja kynureniinin, koska ne vaihtelevat suuresti eri näytetyyppien välillä.
Kasvainten ja TIL-alatyyppien metabonominen analyysimme antaa lisää tietoa metaboliittien roolista munasarjojen TME:ssä. Ensinnäkin virtaussytometriaa käyttäen totesimme, ettei mitokondrioiden aktiivisuudessa ollut eroa kasvainten ja CD4+ T-solujen välillä. LC-MS/MS-analyysi kuitenkin paljasti merkittäviä muutoksia metaboliittien määrässä näiden populaatioiden välillä, mikä viittaa siihen, että TIL-aineenvaihduntaa ja sen yleistä metabolista aktiivisuutta koskevat johtopäätökset vaativat huolellista tulkintaa. Toiseksi, MNA on metaboliitti, jolla on suurin ero CD45-solujen ja T-solujen välillä askiteksessa, ei kasvaimissa. Siksi kompartmentalisaatiolla ja kasvaimen sijainnilla voi olla erilaisia ​​vaikutuksia TIL-aineenvaihduntaan, mikä korostaa mahdollista heterogeenisyyttä tietyssä mikroympäristössä. Kolmanneksi, MNA:ta tuottavan entsyymin NNMT:n ilmentyminen rajoittuu pääasiassa CAF-soluihin, jotka ovat vähäisemmässä määrin kasvainsoluja, mutta havaittavia MNA-tasoja havaitaan kasvaimesta peräisin olevissa T-soluissa. NNMT:n yliekspressiolla munasarjojen CAF-soluissa on tunnettu syöpää edistävä vaikutus, osittain johtuen CAF-aineenvaihdunnan, kasvaimen invaasion ja metastaasin edistämisestä (27). Vaikka TIL:n kokonaismäärä on kohtalainen, NNMT:n ilmentyminen CAF:ssa liittyy läheisesti Cancer Genome Atlas (TCGA) -mesenkymaaliseen alatyyppiin, jolla on yhteys huonoon ennusteeseen (27, 46, 47). Lopuksi, myös MNA:n hajoamisesta vastaavan AOX1-entsyymin ilmentyminen rajoittuu CAF-populaatioon, mikä osoittaa, että T-soluilla ei ole kykyä metaboloida MNA:ta. Nämä tulokset tukevat ajatusta siitä, että vaikka tämän löydöksen varmistamiseksi tarvitaan lisätutkimuksia, korkeat MNA-pitoisuudet T-soluissa saattavat viitata immunosuppressiiviseen CAF-mikroympäristöön.
Ottaen huomioon MNA-kuljettajien alhaisen ilmentymistason ja MNA-aineenvaihduntaan osallistuvien keskeisten proteiinien havaitsemattomat pitoisuudet, MNA:n läsnäolo T-soluissa on odottamatonta. NNMT:tä eikä AOX1:tä ei voitu havaita kahden riippumattoman kohortin scRNA-sekvensointianalyysillä ja kohdennetulla qPCR:llä. Nämä tulokset osoittavat, että T-solut eivät syntetisoi MNA:ta, vaan se imeytyy ympäröivästä TME:stä. In vitro -kokeet osoittavat, että T-solut pyrkivät keräämään eksogeenistä MNA:ta.
In vitro -tutkimuksemme ovat osoittaneet, että eksogeeninen MNA indusoi TNFα:n ilmentymistä T-soluissa ja tehostaa Sp1:n sitoutumista TNFα-promoottoriin. Vaikka TNFα:lla on sekä kasvaimia estäviä että kasvaimia estäviä toimintoja, munasarjasyövässä TNFα voi edistää munasarjasyövän kasvua (31–33). TNFα:n neutralointi munasarjasyöpäsoluviljelmässä tai TNFα-signaalin eliminointi hiirimalleissa voi parantaa TNFα:n välittämää tulehduksellisten sytokiinien tuotantoa ja estää kasvaimen kasvua (32, 35). Siksi tässä tapauksessa TME:stä peräisin oleva MNA voi toimia tulehdusta edistävänä metaboliittina TNFα:sta riippuvan mekanismin kautta autokriinisen silmukan kautta, mikä edistää munasarjasyövän esiintymistä ja leviämistä (31). Tämän mahdollisuuden perusteella TNFα:n salpausta tutkitaan potentiaalisena munasarjasyövän hoitoaineena (37, 48, 49). Lisäksi MNA heikentää CAR-T-solujen sytotoksisuutta munasarjasyöpäsoluille, mikä tarjoaa lisää todisteita MNA:n välittämästä immuunisuppressiosta. Yhdessä nämä tulokset viittaavat malliin, jossa kasvaimet ja CAF-solut erittävät MNA:ta solunulkoiseen TME:hen. (I) TNF:n indusoiman munasarjasyövän kasvun stimulaation ja (ii) MNA:n indusoiman T-solujen sytotoksisen aktiivisuuden estämisen kautta tällä voi olla kaksinkertainen kasvainvaikutus (kuva 5D).
Yhteenvetona voidaan todeta, että yhdistämällä nopea solurikastus, yksisolusekvensointi ja metabolinen profilointi, tämä tutkimus paljasti valtavat immunometabolomiset erot kasvainten ja askitessolujen välillä HGSC-potilailla. Tämä kattava analyysi osoitti, että T-solujen glukoosinotossa ja mitokondrioiden aktiivisuudessa on eroja, ja tunnisti MNA:n ei-solukohtaiseksi autonomiseksi immuunisäätelymetaboliitiksi. Näillä tiedoilla on vaikutusta siihen, miten TME vaikuttaa T-solujen aineenvaihduntaan ihmisen syövissä. Vaikka T-solujen ja syöpäsolujen välistä suoraa kilpailua ravinteista on raportoitu, metaboliitit voivat toimia myös epäsuorina säätelijöinä edistäen kasvaimen etenemistä ja mahdollisesti tukahduttamalla endogeenisiä immuunivasteita. Näiden säätelymetaboliittien toiminnallisen roolin tarkempi kuvaus voi avata vaihtoehtoisia strategioita kasvaimia vastustavan immuunivasteen tehostamiseksi.
Potilasnäytteet ja kliiniset tiedot saatiin Kanadan kudosrepositorioverkoston sertifioimasta Brittiläisen Kolumbian syöpäkasvainkudosrepositoriosta. Brittiläisen Kolumbian syöpätutkimuseettisen komitean ja Brittiläisen Kolumbian yliopiston hyväksymän protokollan (H07-00463) mukaisesti kaikilta potilailta saatiin kirjallinen suostumus tai heiltä annettiin muodollinen luopuminen suostumuksestaan. Näytteet säilytetään sertifioidussa BioBankissa (BRC-00290). Yksityiskohtaiset potilastiedot on esitetty taulukoissa S1 ja S5. Kryosäilytystä varten potilaan kasvainnäyte hajotetaan mekaanisesti skalpellilla ja työnnetään sitten 100 mikronin suodattimen läpi yksittäisten solujen suspension saamiseksi. Potilaan askitesneste sentrifugoitiin nopeudella 1500 rpm 10 minuuttia 4 °C:ssa solujen pelletoimiseksi ja supernatantin poistamiseksi. Kasvaimesta ja askitesnesteestä saadut solut kryosäilöttiin 50 %:ssa lämpöinaktivoitua ihmisen AB-seerumia (Sigma-Aldrich), 40 %:ssa RPMI-1640:tä (Thermo Fisher Scientific) ja 10 %:ssa dimetyylisulfoksidia. Nämä säilötyt yksittäisten solujen suspensiot sulatettiin ja niitä käytettiin alla kuvattuun metabolomiikkaan ja metaboliittien määritykseen.
Täydellinen kasvatusalusta koostuu 0,22 μm suodatetusta 50:50-rikastetusta RPMI 1640:AimV:stä. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamiini (Thermo Fisher Scientific), johon on lisätty 10 % lämpöinaktivoitua ihmisen AB-seerumia (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepesiä (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamiinia (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x penisilliinistreptomysiiniliuosta (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) ja 50 μMB-merkaptoetanolia. AimV (Invitrogen) on täydennetty 20 mM Hepesillä (Thermo Fisher Scientific) ja 2 mM l-glutamiinilla (Thermo Fisher Scientific). Virtaussytometrin värjäyspuskuri koostui 0,22 μm suodatetusta fosfaattipuskuroidusta suolaliuoksesta (PBS; Invitrogen), johon on lisätty 3 % lämpöinaktivoitua ihmisen AB-seerumia (Sigma). Solurikastuspuskuri koostuu 0,22 μm:n suodatetusta PBS:stä, johon on lisätty 0,5 % lämmöllä inaktivoitua ihmisen AB-seerumia (Sigma-Aldrich).
Solut värjättiin 37 °C:ssa täydellisessä elatusaineessa 10 nM MT DR:llä ja 100 μM 2-NBDG:llä 30 minuutin ajan. Seuraavaksi solut värjättiin elinkykyisyysvärillä eF506 4 °C:ssa 15 minuutin ajan. Suspendoidaan solut uudelleen FC Block -liuokseen (eBioscience) ja Brilliant Stain Buffer -liuokseen (BD Biosciences), laimennetaan virtaussytometrin värjäyspuskuriin (valmistajan ohjeiden mukaisesti) ja inkuboidaan 10 minuuttia huoneenlämmössä. Värjätään solut vasta-ainesarjalla (taulukko S2) virtaussytometrin värjäyspuskurissa 4 °C:ssa 20 minuutin ajan. Suspendoidaan solut uudelleen virtaussytometrin värjäyspuskuriin (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R-konfiguraatio) ennen analyysia. Analysoi solujen määrätiedot SpectroFlo- ja FlowJo V10 -ohjelmistoilla ja luo tiedot GraphPad Prism 8 -ohjelmistolla. 2-NBDG:n ja MT DR:n mediaanifluoresenssi-intensiteetti (MFI) logaritmisesti normalisoitiin, ja sitten käytettiin paritettua t-testiä tilastollisessa analyysissä vastaavien potilaiden huomioimiseksi. Poista analyysistä kaikki populaatiot, joissa on alle 40 tapahtumaa; anna MFI-arvoksi 1 kaikille negatiivisille arvoille ennen tilastollisen analyysin ja datan visualisoinnin suorittamista.
Täydentääksemme yllä olevan prosessipaneelin manuaalista tahdistusstrategiaa käytimme muodonrajoituspuun (FAUST) (21) täyttä annotaatiota solujen automaattiseen liittämiseen populaatioon kuolleiden solujen poistamisen jälkeen FlowJossa. Hallinnoimme tulosta manuaalisesti yhdistääksemme populaatiot, jotka näyttävät olevan väärin allokoituja (yhdistämällä PD1+-kasvainsoluja PD1-kasvainsolujen kanssa), ja säilyneet populaatiot. Jokainen näyte sisältää keskimäärin yli 2 % soluja, yhteensä 11 populaatiota.
Ficoll-gradienttitiheyssentrifugointia käytettiin PBMC:n erottamiseen leukosyyttien erotustuotteista (STEMCELL Technologies). CD8+ T-solut eristettiin PBMC:stä käyttämällä CD8 MicroBeads -helmiä (Miltenyi) ja niitä kasvatettiin täydellisessä kasvatusalustassa käyttäen TransAct-liuosta (Miltenyi) kahden viikon ajan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solujen annettiin seistä viisi päivää täydellisessä kasvatusalustassa, joka sisälsi IL-7:ää (10 ng/ml; PeproTech), ja sitten ne stimuloitiin uudelleen TransAct-liuoksella. Päivänä 7, valmistajan ohjeiden mukaisesti, solujen rikastukseen käytettiin ihmisen CD45 MicroBeads -helmiä (Miltenyi) kolmessa peräkkäisessä kierroksessa. Solut jaettiin eriin virtaussytometrianalyysiä varten (kuten edellä on kuvattu), ja miljoona solua jaettiin kolme kertaa eriin LC-MS/MS-analyysiä varten. Näytteet käsiteltiin LC-MS/MS:llä alla kuvatulla tavalla. Arvioimme puuttuvan metaboliitin arvon ioniluvulla 1 000. Jokainen näyte normalisoidaan kokonaisioniluvulla (TIC), muunnetaan logaritmisesti ja normalisoidaan automaattisesti MetaboAnalystR:ssä ennen analyysia.
Kunkin potilaan yksittäisten solujen suspensio sulatettiin ja suodatettiin 40 μm:n suodattimen läpi täydelliseen kasvatusalustaan ​​(kuten edellä on kuvattu). Valmistajan ohjeiden mukaisesti näytteet rikastettiin CD8+-, CD4+- ja CD45-solujen osalta (jäällä) kolmella peräkkäisellä positiivisen selektion kierroksella magneettihelmierottelulla käyttäen MicroBeads-laitteita (Miltenyi). Lyhyesti sanottuna solut suspendoidaan uudelleen solurikastuspuskuriin (kuten edellä on kuvattu) ja lasketaan. Soluja inkuboitiin ihmisen CD8-helmien, ihmisen CD4-helmien tai ihmisen CD45-helmien (Miltenyi) kanssa 4 °C:ssa 15 minuuttia ja pestiin sitten solurikastuspuskurilla. Näyte johdetaan LS-kolonnin (Miltenyi) läpi, ja positiiviset ja negatiiviset fraktiot kerätään. Keston lyhentämiseksi ja solujen talteenottovaiheen maksimoimiseksi CD8-fraktiota käytetään sitten toiseen CD4+-rikastuskierrokseen ja CD4-fraktiota seuraavaan CD45-rikastuskierrokseen. Liuos pidetään jäissä koko erotusprosessin ajan.
Näytteiden valmistamiseksi metaboliittianalyysiä varten solut pestiin kerran jääkylmällä suolaliuoksella, ja jokaiseen näytteeseen lisättiin 1 ml 80-prosenttista metanolia, minkä jälkeen ne vorteksoitiin ja jäädytettiin nopeasti nestemäisessä typessä. Näytteet pakastettiin kolme kertaa ja sentrifugoitiin nopeudella 14 000 rpm 15 minuuttia 4 °C:ssa. Metaboliitteja sisältävä supernatantti haihdutettiin kuivaksi. Metaboliitit liuotettiin uudelleen 50 μl:aan 0,03-prosenttista muurahaishappoa, sekoitettiin vorteksilla ja sentrifugoitiin sitten epäpuhtauksien poistamiseksi.
Uuta metaboliitit edellä kuvatulla tavalla. Siirrä supernatantti korkean suorituskyvyn nestekromatografiapulloon metabolomiikkatutkimusta varten. Käytä satunnaista käsittelyprotokollaa käsitelläksesi jokaisen näytteen samanlaisella määrällä soluja erävaikutusten estämiseksi. Suoritimme aiemmin julkaistun globaalien metaboliittien kvalitatiivisen arvioinnin AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer -laitteella (50). Kromatografinen analyysi ja piikkien pinta-alojen integrointi suoritettiin MultiQuant versio 2.1 -ohjelmistolla (Applied Biosystems SCIEX).
Puuttuvan metaboliitin arvon arvioimiseksi käytettiin ionimäärää 1000, ja kunkin näytteen TIC-arvoa käytettiin kunkin havaitun metaboliitin normalisoidun piikkialueen laskemiseen näytteenkäsittelyn instrumentaalianalyysin aiheuttamien muutosten korjaamiseksi. Kun TIC on normalisoitu, MetaboAnalystR(51) (oletusparametri) käytetään logaritmiseen muunnokseen ja automaattiseen normiviivan skaalaukseen. Käytimme PCA:ta vegan R -paketilla metabolomierojen tutkivaan analyysiin näytetyyppien välillä ja osittaista redundanssianalyysia potilaiden analysointiin. Käytimme Wardin menetelmää lämpökarttadendrogrammin rakentamiseen näytteiden välisen euklidisen etäisyyden ryhmittelemiseksi. Käytimme limmaa (52) standardoidulle metaboliittien runsaudelle tunnistaaksemme eriasteisesti runsaat metaboliitit koko solutyypissä ja mikroympäristössä. Selityksen yksinkertaistamiseksi käytimme ryhmän keskiarvoparametria mallin määrittämiseen ja tarkastelimme mikroympäristön solutyyppejä ryhminä (n = 6 ryhmää); merkitsevyystestiä varten suoritimme kolme toistettua mittausta jokaiselle metaboliitille. Väärien replikaatioiden välttämiseksi potilas sisällytettiin limma-suunnitteluun esteenä. Eri potilaiden metaboliittien erojen tarkistamiseksi muokkasimme limma-mallia, johon potilaat otettiin mukaan kiinteällä tavalla. Raportoimme ennalta määritellyn kontrastin merkitsevyyden solutyypin ja Padj < 0,05 -mikroympäristön välillä (Benjamini-Hochbergin korjaus).
Miltenyi Dead Cell Removal Kit -pakkauksella tehdyn elinkykyrikastuksen (>80 %:n elinkyky) jälkeen suoritettiin yksisolutranskriptomisekvensointi kaikille eläville pakastetuille askites- ja kasvainnäytteille käyttäen 10x 5'-geeniekspressioprotokollaa. Analysoitiin viisi tapausta, joissa kasvaimet ja askites olivat yhteensopivat, vaikka yhden kasvainnäytteen alhainen elinkyky esti sen sisällyttämisen tutkimukseen. Useiden potilasvalintojen saavuttamiseksi yhdistimme kunkin potilaan näytteet 10x kromikontrollin kaistoilla ja analysoimme askites- ja kasvainkohdat erikseen. Sekvensoinnin jälkeen [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp:n paritettu pää (PE), Quebecin genomi; keskimäärin 73 488 ja 41 378 lukua solua kohden kasvaimessa ja askiteksessa]], käytimme CellSNP:tä ja Vireoa (53) (perustuen CellSNP:hen, koska GRCh38:n tarjoamalle yhteiselle ihmisen SNP:lle (VCF) on määritetty luovuttajan identiteetti. Käytämme SNPRelatea päätelläksemme potilaan genotyyppistatuksen (IBS) lähimmän identiteetin (IBS), jättäen pois määrittämättömät solut ja duplekseiksi tunnistetut solut ja yhdistämällä luovuttajat askites- ja kasvainnäytteiden välillä (54). Tämän tehtävän perusteella säilytimme kolme tapausta, joissa oli runsaasti soluja kasvaimessa ja askiteksessa, jatkoanalyysiä varten. Massasuodatuksen suorittamisen jälkeen scater (55) ja scran (56) BioConductor -pakkauksissa saatiin analyysiä varten 6975 solua (2792 ja 4183 solua kasvaimesta ja askiteksesta). Käytämme igraphin (57) Louvainin klusterointia jaetusta lähimmän naapurin verkosta (SNN) Jaccard-etäisyyden perusteella klusterisoluihin ilmentymisen mukaan. klusterit annotoitiin manuaalisesti oletetuille solutyypeille markkerigeenien ilmentymisen perusteella ja visualisoitiin t-SNE:llä. Sytotoksiset T-solut määritellään CD8A:n ja GZMA:n ilmentymisen perusteella, lukuun ottamatta alaklustereita, joilla on alhainen ribosomaalisen proteiinin ilmentyminen. Käytimme Izarin ym. (16) julkaisemia tietoja, mukaan lukien heidän t-SNE:nsä upottaminen, jotka voivat kontrolloida immuunisolujen markkerien ja NNMT:n ilmentymisen päällekkäisyyttä.
PBMC-solut erotettiin leukosyyttien erotustuotteista (STEMCELL Technologies) Ficoll-gradienttitiheyssentrifugoinnilla. CD3+-solut eristettiin PBMC-soluista käyttäen CD3-helmiä (Miltenyi). MNA:n läsnä ollessa tai ilman sitä CD3+-solut aktivoitiin levylle sidotuilla CD3-soluilla (5 μg/ml), liukoisilla CD28-soluilla (3 μg/ml) ja IL-2:lla (300 U/ml; Proleukin). Viimeisenä laajennuspäivänä elinkykyisyys (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) ja proliferaatio (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) arvioitiin virtaussytometrialla. Arvioi efektorin toimintaa stimuloimalla soluja PMA:lla (20 ng/ml) ja ionomysiinillä (1 μg/ml) GolgiStop-laitteella neljän tunnin ajan ja seuraa CD8-PerCP:tä (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700:aa (RPA-T4, BioLegend) ja TNFα-fluoreseiini-isotiosyanaattia (FITC) (MAb11, BD). Stimuloi qPCR- ja ChIP-soluja PMA:lla (20 ng/ml) ja ionomysiinillä (1 μg/ml) neljän tunnin ajan. ELISA-supernatantti kerättiin ennen PMA:lla (20 ng/ml) ja ionomysiinillä (1 μg/ml) neljän tunnin ajan tapahtuvaa stimulaatiota ja sen jälkeen.
Eristä RNA valmistajan ohjeiden mukaisesti käyttämällä RNeasy Plus Mini Kit -pakkausta (QIAGEN). Homogenisoi näyte QIAshredderillä (QIAGEN). Syntetisoi komplementaarista DNA:ta (cDNA) suuren kapasiteetin RNA-cDNA-pakkauksella (Thermo Fisher Scientific). Määritä geenien ilmentyminen TaqMan Rapid Advanced Master Mixillä (Thermo Fisher Scientific) (valmistajan ohjeiden mukaisesti) seuraavilla koettimilla: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glyseraldehydi-3-fosfaatti vedystä (GAPDH)] ja Hs01010726_m1 (SLC22A2). Näytteet ajettiin StepOnePlus-reaaliaikaisella PCR-järjestelmällä (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) MicroAmp-pikaoptisessa 96-kuoppaisessa reaktiolevyssä (Applied Biosystems) ja MicroAmp-optisella filmillä. Kaikki Ct-arvot, jotka ylittävät 35, katsotaan havaitsemiskynnyksen yläpuolelle ja merkitään havaitsemattomiksi.
Suorita ChIP aiemmin kuvatulla tavalla (58). Lyhyesti sanottuna solut käsiteltiin formaldehydillä (loppupitoisuus 1,42 %) ja inkuboitiin huoneenlämmössä 10 minuuttia. Käytä täydennettyä turvotuspuskuria (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl ja 0,1 % NP-40) jäillä 10 minuutin ajan, minkä jälkeen ne suspendoidaan uudelleen immunosaostuspuskuriin kuvatulla tavalla (58). Näyte sonikoitiin sitten seuraavilla sykleillä: 10 sykliä (20 1 sekunnin pulssia) ja 40 sekunnin staattinen aika. Inkuboi ChIP-laatuisia immunoglobuliini G:tä (Cell Signaling Technology; 1 μl), histoni H3:a (Cell Signaling Technology; 3 μl), NFAT:ia (Invitrogen; 3 μl) ja SP1:tä (Cell Signaling Technology; 3 μl) näytteen kanssa 4 °C:ssa ravistamalla yön yli. Inkuboi proteiini A -helmiä (Thermo Fisher Scientific) näytteen kanssa 4 °C:ssa varovasti ravistellen 1 tunnin ajan, rikasta sitten DNA chelex-helmillä (Bio-Rad) ja käytä proteinaasi K:ta (Thermo Fisher) proteiinin pilkkomiseen. TNFα-promoottori havaittiin PCR:llä: eteenpäin, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; päinvastoin, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207 bp:n tuote). Kuvat tuotti Image Lab (Bio-Rad) ja kvantifioitiin ImageJ-ohjelmistolla.
Soluviljelmäsupernatantti kerättiin edellä kuvatulla tavalla. Määritys suoritettiin ihmisen TNFα ELISA -pakkauksen (Invitrogen), ihmisen IL-2 ELISA -pakkauksen (Invitrogen) ja ihmisen IFN-γ ELISA -pakkauksen (Abcam) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Valmistajan ohjeiden mukaisesti supernatantti laimennettiin suhteessa 1:100 TNFα:n ja IL-2:n havaitsemiseksi ja suhteessa 1:3 IFN-γ:n havaitsemiseksi. Absorbanssin mittaamiseen 450 nm:ssä käytettiin EnVision 2104 Multilabel Reader -laitetta (PerkinElmer).
PBMC-solut erotettiin leukosyyttien erotustuotteista (STEMCELL Technologies) Ficoll-gradienttitiheyssentrifugoinnilla. CD3+-solut eristettiin PBMC-soluista käyttäen CD3-helmiä (Miltenyi). MNA:n läsnä ollessa tai ilman sitä CD3+-solut aktivoitiin levylle sidotulla CD3:lla (5 μg/ml), liukoisella CD28:lla (3 μg/ml) ja IL-2:lla (300 U/ml; Proleukin) kolmen päivän ajan. Kolmen päivän kuluttua solut kerättiin ja pestiin 0,9-prosenttisella suolaliuoksella, ja pelletti pakastettiin nopeasti. Solulaskenta suoritettiin virtaussytometrialla (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R-konfiguraatio) käyttäen 123count eBeads -mikrohelmiä.
Uuta metaboliitit kuten edellä on kuvattu. Kuivattu uute liuotettiin pitoisuuteen 4000 soluekvivalenttia/μl. Analysoi näyte käänteisfaasikromatografialla (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ja CORTECS T3 -kolonnilla (2,1 × 150 mm, hiukkaskoko 1,6 μm, huokoskoko 120 Å; #186008500, Waters). Polaarinen massaspektrometri (6470, Agilent), jossa sähkösuihkutusionisaatio toimii positiivisessa tilassa. Liikkuva faasi A on 0,1 % muurahaishappoa (H2O:ssa), liikkuva faasi B on 90 % asetonitriiliä, 0,1 % muurahaishappoa. LC-gradientti on 0–2 minuuttia 100 % A:lle, 2–7,1 minuuttia 99 % B:lle ja 7,1–8 minuuttia 99 % B:lle. Sitten kolonni tasapainotetaan uudelleen liikkuvalla faasilla A virtausnopeudella 0,6 ml/min 3 minuutin ajan. Virtausnopeus on 0,4 ml/min ja kolonnikammio lämmitetään 50 °C:seen. Käytä MNA:n puhdasta kemiallista standardia (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Kanada) retentioajan (RT) ja transformaation (RT = 0,882 minuuttia, transformaatio 1 = 137→94,1, transformaatio 2 = 137→92, konversio 3 = 137→78) määrittämiseksi. Kun kaikki kolme siirtymää tapahtuvat oikealla retentioajalla, siirtymää 1 käytetään kvantifiointiin spesifisyyden varmistamiseksi. MNA:n (Toronto Research Chemical Company) standardikäyrä luotiin tekemällä kuusi sarjalaimennosta kantaliuoksesta (1 mg/ml), jolloin saatiin standardiliuokset, joiden pitoisuudet olivat 0,1, 1,0, 10 ja 100 ng/ml sekä 1,0 ja 10 μg/ml nestemäisenä liuoksena. Havaitsemisraja on 1 ng/ml ja lineaarinen vaste on 10 ng/ml ja 10 μg/ml välillä. LC/MS-analyysissä käytetään jokaista kahden mikrolitran näyte- ja standardiinjektiota, ja sekoitettu laadunvalvontanäyte ajetaan joka kahdeksannen injektion välein analyysialustan vakauden varmistamiseksi. Kaikkien MNA:lla käsiteltyjen solunäytteiden MNA-vasteet olivat määrityksen lineaarisella alueella. Data-analyysi tehtiin käyttämällä MassHunter-kvantitatiivista analyysiohjelmistoa (v9.0, Agilent).
Toisen sukupolven αFR-CAR-konstrukti otettiin Songin ym. (59) julkaisusta. Lyhyesti sanottuna konstrukti sisältää seuraavat sisällöt: CD8a:n johtosekvenssin, ihmisen αFR-spesifisen yksiketjuisen variaabelifragmentin, CD8a:n sarana- ja transmembraanialueen, CD27:n solunsisäisen domeenin ja CD3z:n solunsisäisen domeenin. Täydellinen CAR-sekvenssi syntetisoitiin GenScriptillä ja kloonattiin sitten toisen sukupolven lentiviraaliseen ilmentämisvektoriin GFP-ilmentämiskasetin ylävirtaan, jota käytettiin transduktiotehokkuuden arvioimiseen.
Lentivirus tuotetaan transfektoimalla HEK293T-soluja [American Type Culture Collection (ATCC); kasvatettu Dulbeccon modifioidussa Eagle-elatusaineessa, joka sisältää 10 % naudan sikiön seerumia (FBS) ja 1 % PenStrep:iä, ja käytetty CAR-GFP-vektoria. Pakkausplasmideissa (psPAX2 ja pMD2.G, Addgene) käytetään lipofektioamiinia (Sigma-Aldrich). Virusta sisältävä supernatantti kerättiin 48 ja 72 tuntia transfektion jälkeen, suodatettiin ja konsentroitiin ultrasentrifugoimalla. Säilytä konsentroitua virussupernatanttia -80 °C:ssa transduktioon asti.
Terveiden luovuttajien PBMC-solut erotetaan toisistaan ​​(STEMCELL Technologies) Ficoll-gradienttitiheyssentrifugoinnilla. Eristetään CD8+-solut PBMC-soluista positiivisen selektion CD8-mikrohelmillä (Miltenyi). Stimuloidaan T-soluja TransAct-soluilla (Miltenyi) ja TexMACS-elatusaineessa [Miltenyi; täydennettynä 3 %:lla lämpöinaktivoitua ihmisen seerumia, 1 %:lla PenStrep:iä ja IL-2:ta (300 U/ml)]. Kaksikymmentäneljä tuntia stimulaation jälkeen T-solut transdusoitiin lentiviruksella (10 μl väkevöityä virussupernatanttia per 106 solua). 1–3 päivää transduktion jälkeen Cytek Auroralla (FSC (eteenpäin sironta)/SSC (sivulle sironta), Singlet, GFP+) arvioidaan solujen GFP-ilmentymistä vähintään 30 %:n transduktiotehokkuuden osoittamiseksi.
CAR-T-soluja viljeltiin 24 tuntia Immunocult-elatusaineessa (STEMCELL Technologies; täydennetty 1 % PenStrepillä) seuraavissa olosuhteissa: käsittelemättömiä, käsitelty 250 μM adenosiinilla tai 10 mM MNA:lla. Esikäsittelyn jälkeen CAR-T-solut pestiin PBS:llä ja yhdistettiin 20 000 SK-OV-3-solun [ATCC; McCoy 5A -elatusaineessa (Sigma-Aldrich), johon oli lisätty 10 % FBS:ää ja 1 % PenStrepiä, suhde 10: Efektorin ja kohteen suhde 1 monistettiin kolmena rinnakkaisena täydennettyyn Immunocult-elatusaineeseen. SK-OV-3-soluja ja digitalis saponiinilla (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) lysoituja SK-OV-3-soluja käytettiin negatiivisina ja positiivisina kontrolleina. 24 tunnin yhteisviljelyn jälkeen supernatantti kerättiin ja laktaattidehydrogenaasi (LDH) mitattiin valmistajan ohjeiden mukaisesti (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). LDH-supernatantti laimennettiin suhteessa 1:50 LDH-puskuriin. Tappamisprosentti mitattiin seuraavalla kaavalla: tappamisprosentti = korjausprosentti / suurin tappamisprosentti x 100 %, jossa korjausprosentti = yhteisviljely - vain T-solut ja suurin tappamisprosentti = positiivinen kontrolli - negatiivinen kontrolli.
Kuten tekstissä tai materiaaleissa ja menetelmissä on kuvattu, käytä tilastollisessa analyysissä GraphPad Prism 8-, Microsoft Excel- tai R v3.6.0 -ohjelmia. Jos samalta potilaalta kerätään useita näytteitä (kuten askites ja kasvain), käytämme paritettua t-testiä tai sisällytämme potilaan satunnaisena vaikutuksena lineaariseen tai yleistettyyn malliin tarpeen mukaan. Metabolomiikka-analyysissä tärkeystesti suoritetaan kolmena rinnakkaisnäytteenä.
Tämän artikkelin lisämateriaaleja on osoitteessa http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Tämä on avoimen saatavuuden artikkeli, joka on jaettu Creative Commons Nimeä-EiKaupallinen -lisenssin ehtojen mukaisesti. Tämä lisenssi sallii käytön, jakelun ja kopioinnin missä tahansa mediassa, kunhan lopullinen käyttö ei ole kaupallista hyötyä varten ja lähtökohtana on, että alkuperäinen teos on oikein. Viite.
Huomautus: Pyydämme sinua antamaan sähköpostiosoitteesi vain, jotta sivulle suosittelemasi henkilö tietää, että haluat hänen näkevän sähköpostin ja että se ei ole roskapostia. Emme tallenna sähköpostiosoitteita.
Tätä kysymystä käytetään testaamaan, oletko vierailija, ja estämään automaattinen roskapostin lähetys.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), J. B. R. De Bellard, Ralph J.B. G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA edistää T-solujen immuunisuppressiota ja edustaa potentiaalista immunoterapiakohdetta ihmisen syövän hoidossa.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), J. B. R. De Bellard, Ralph J.B. G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA edistää T-solujen immuunisuppressiota ja edustaa potentiaalista immunoterapiakohdetta ihmisen syövän hoidossa.
©2021 American Association for the Advanced of Science. kaikki oikeudet pidätetään. AAAS on HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ja COUNTER kumppani. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.